방법 논문

체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

DOI:

10.3791/55529

⸱

2017년 3월 21일

 ,  ,  ,  ,  , 
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

이 논문에서

요약

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선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다.

초록

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의 GnRH 유사체 효과적인 표적 부분과 선택적으로 악성 종양 세포에있는 높은 표현의 GnRH 수용체에 항암제를 제공 할 수 있습니다. 그러나의 GnRH 유사체 '세포 흡수의 정량 분석의 GnRH 계 약물 전달 시스템의 연구 세포 종류는 현재 제한된다. 이전에 도입, 선택적으로 표지 된 형광의 GnRH I, -II 및 -III 유도체 좋은 검출 감도를 제공하고, 그들은 재현하고 강력한 실험에 적합한 화학적 특성이 있습니다. 우리는 이러한 라벨의 GnRH 유사체에 해당하는 최신 방법은 GnRH에 기반 약물 전달 시스템에 대한 새로운 정보를 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II와 [리스 8 (FITC)] - GnRH에이 원고는 [D-리스 6 (FITC)]의 세포 흡수에 관한 몇 가지 간단하고 빠른 실험을 소개합니다 EBC-1 (폐)에 -III의 BxPC-3 (췌장)와 디트로이트-562- (인두)에 악성 tumor 세포. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로는 GnRH-I 수용체의 세포 표면 수준은 이전과 공 초점 레이저 주사 현미경으로 GnRH의 처리 후에 이들 세포주를 조사 하였다. 의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수는 형광 - 활성화 세포 선별에 의해 정량화 하였다. 이러한 실험에서의 GnRH 유사체 및 세포 유형 간의 주요 차이점 중 사소한 차이가 관찰되었다. 세포주 간의 유의 한 차이는 세포 표면의 GnRH-I 수용체의 자신의 고유 한 수준의 상관 관계가있다. 도입 된 실험은 시각화, 정량화 및 각종 접착 세포 배양에 시간과 농도 의존적으로의 GnRH-FITC 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실제적인 방법을 포함한다. 이러한 결과는 소정의 세포 배양에서의 GnRH 접합체 약물 타겟팅 효율을 예측하고, GnRH에 기반 약물 전달 시스템의 시험에서 추가 실험을위한 좋은 기초를 제공 할 수있다.

서론

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펩타이드 계 표적 약물 전달 시스템은 지난 몇 년 동안 1, 2를 통해 암 치료에 빠른 개발 및 유망 영역이되었다. 인간의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체 타입 I (는 GnRH-IR) 주로 뇌하수체에 위치뿐만 아니라 3자가 재생산을 담당 여러 다른 조직에 존재한다. 의 GnRH-IR은 생식계 -4,5- 관련된 또는 무관 한, 암 조직의 개수로 표현된다. 건강한 조직과 비교하여 여러 가지의 악성 종양 세포의 GnRH-IR의 높은 발현은 표적 치료 (5, 6)에 대한 기회를 제공한다.

많은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에) 유사체 잔기를 표적으로 사용할 수 지난 수십 년에 개발되어왔다F "> 7, 8, 9. 이러한 펩티드는 악성 종양 세포....

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프로토콜

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세포 배양 및 시약 1. 준비

  1. 10 % (v / v)의 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지 불리는) 보충 제조자의 권장 배지에서 세포 배양을 유지한다. 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 세포 배양 플라스크 유지. 거꾸로 현미경으로 세포의 증식 및 포화 상태에 따라 (10X 위상 대비 목표를 사용).
  2. 세포가 적절한 포화 상태에 도달하면, 배지를 제거하고 2-3 ㎖, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 배양을 씻는다. PBS를 제거하고 세포 배양 물 0.5 ㎖, 멸균 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 추가하고 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 배양한다.
  3. 트립신을 중지하고 멸균 원심 분리기 튜브로를 전송하는 데 3 ~ 4 mL의 멸균 완전 배지에서 세포를 일시 중단합니다. 실온에서 4 분 (RT) 150 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 무시하고 페이지를 일시 중단2 ~ 3 mL의 멸균 완전 배지에서 ellet.
  4. 세포 현탁액 100 μL를 가지고 죽은 세포를 얼룩, 100 μL 0.4 % (m / V를) 트리 판 블루 용액을 혼합한다. 로드 혈구로이 혼합물을 10 μL와 도립 현미경으로 생존 세포의 수를 결정한다.
  5. 4 × 104....

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결과

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공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 얻어진 영상은 시간 및 농도 의존적으로 주어진 세포 배양에서의 GnRH-FITC 접합체의 흡수에 대한 훌륭한 정보를 제공한다. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병행하여, 세포 표면에의 GnRH-IR의 존재는 CLSM 실험에 의해 검증 가능하다. 또, 원적외선 DNA 염색 형광 프로브를 이용하여, 그것과는 GnRH의 GnRH-IR 외에도 세포의 핵을 Counterstain과 수있다. 공 촛점 이미지 정량화 아니지만 그러나 간단한 "GnRH의 섭취 방법은"쉽게 테스트 셀의 GnRH-FITC 접합체의 더 높거나 낮은 양이 포함되는지 여부를 평가할 수있다. 필요에 따라인가의 GnRH-FITC 접합체 그들의 농도, 처리 시간은,이 방법에서 가변이다. 도 1에 도시 된 바와 같이 다양한 암세포는 농도 의존적으로는 GnRH-FITC 상이한 레벨을 포함한다.

고급 "의 GnRH-IR 발현 방법은.......

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토론

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실험은 선별을 위해 선택적으로 부착 표지의 GnRH 유사체를 사용하여 본원에 기재된 시험 관내 세포 배양. 공 초점 현미경과 세포 계측법 방법은 추적에 적합하고, 시간과 농도 의존적으로 이들의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량화되어 흐른다. 이 실험은 다음과 같은 중요한 단계 : 1) 멸균 건강한 세포 배양 물을 유지하는 단계; 2)의 GnRH 펩타이드는 고품질이어야합니다; 3) 적당한 농도와 배양 시간 따라야합니다; 4) 치료 및 세척 단계; 5) 기기 설정을 잘 조절.

세포는 제조업체의 10 %로 보충 권장 배지 (V / V) 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지)에서 유지된다. 세포를 보관하고 (GnRH에-FITC 콘쥬 게이트로) 처리 단계까지 무균 환경에서 처리되어야합니다. 실험하기 전에, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 확인합니다. 그들은 건강해야첨부하고 필요한 수량에 도달해야합니다.

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 프로젝트는 National Research Fund OTKA(K 104045)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
EBC-1JCRB 세포 은행JCRB0820인간 폐 편평 세포 암종
BxPC-3ATCCCRL-1687인간 췌장 선암
디트로이트-562ATCCCCL-138인간 인두 암종
RPMI-1640 L-글루타민이 있는 배지LonzaBE12-702FBxPC-3 세포용 배양 배지
Eagle's Minimum Essential EBC-1LonzaBE12-611F그리고 Detroit-562 세포를 위한 0.1% 나트륨 피루베이트로 보충
Fetal Bovine SerumEuro CloneECS0180L
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012는 배양 매체 (항생제)를 보완합니다.
표준 라인 세포 배양 플라스크VWR10062-872세포에 일관된, 멸균 성장 환경을 제공합니다
트립신-EDTA 혼합물 LonzaBE17-161E부착 된 세포 제거
인산염 완충 식염수 (PBS)LonzaBE17-516F용매
디메틸 설폭 사이드Sigma-AldrichD8418-100ML용매
Trypan 블루 솔루션, 0.4 %Thermo Fisher Scientific15250061세포 계수에 사용
[D-Lys6(FITC)] -GnRH-Imade by us- 순도 ≥ 98 % (HPLC)
[D-Lys6 < / sup > (FITC)] -GnRH-IIus-Purity에 의해 만들어졌다; 98 % (HPLC)
[Lys 8 < / sup > (FITC)] -GnRH-III미국 제조-Purity ≥ 98% (HPLC)
유리 바닥 8-well microscopic slideIbidi80826CLSM 실험에 사용
Corning Costar 세포 배양 플레이트, 12 웰Sigma-AldrichCLS3513-50EAFACS 실험에 사용
고정 용액(10% 중성 완충 포르말린)Bio-Optica01V60P부착 세포 고정
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA7906-10G항체의 비특이적 결합 방지
GnRHR AntibodyProteintech19950-1-AP면역세포화학 시약, human type-I GnRH 수용체에
결합 Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugateThermo Fisher ScientificA11035Immunocytochemistry reagent, 1차 항체에 결합
Fluorescent probe solution (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254카운터스테인 핵
플루오로마운트 수성 장착 매체시그마-알드리치F4680-25MLCLSM 실험에서 사용, 형광
보존 반전 현미경Elektro-Optika Ltd. Alpha XDS-2T세포 배양의 표현형 및 밀도 확인
반전 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경ZeissLSM-710CLSM 실험에 사용
유세포 분석기BD BiosciencesBD FACSCaliburFACS 실험에 사용
세포를 위한 Medium , 된 은 는 . 는 &ge

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.

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재인쇄 및 허가

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GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

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