체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

요약

선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다.

초록

의 GnRH 유사체 효과적인 표적 부분과 선택적으로 악성 종양 세포에있는 높은 표현의 GnRH 수용체에 항암제를 제공 할 수 있습니다. 그러나의 GnRH 유사체 '세포 흡수의 정량 분석의 GnRH 계 약물 전달 시스템의 연구 세포 종류는 현재 제한된다. 이전에 도입, 선택적으로 표지 된 형광의 GnRH I, -II 및 -III 유도체 좋은 검출 감도를 제공하고, 그들은 재현하고 강력한 실험에 적합한 화학적 특성이 있습니다. 우리는 이러한 라벨의 GnRH 유사체에 해당하는 최신 방법은 GnRH에 기반 약물 전달 시스템에 대한 새로운 정보를 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-I, [D-리스 ⁶ (FITC)] - -의 GnRH-II와 [리스 ⁸ (FITC)] - GnRH에이 원고는 [D-리스 ⁶ (FITC)]의 세포 흡수에 관한 몇 가지 간단하고 빠른 실험을 소개합니다 EBC-1 (폐)에 -III의 BxPC-3 (췌장)와 디트로이트-562- (인두)에 악성 tumor 세포. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로는 GnRH-I 수용체의 세포 표면 수준은 이전과 공 초점 레이저 주사 현미경으로 GnRH의 처리 후에 이들 세포주를 조사 하였다. 의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수는 형광 - 활성화 세포 선별에 의해 정량화 하였다. 이러한 실험에서의 GnRH 유사체 및 세포 유형 간의 주요 차이점 중 사소한 차이가 관찰되었다. 세포주 간의 유의 한 차이는 세포 표면의 GnRH-I 수용체의 자신의 고유 한 수준의 상관 관계가있다. 도입 된 실험은 시각화, 정량화 및 각종 접착 세포 배양에 시간과 농도 의존적으로의 GnRH-FITC 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실제적인 방법을 포함한다. 이러한 결과는 소정의 세포 배양에서의 GnRH 접합체 약물 타겟팅 효율을 예측하고, GnRH에 기반 약물 전달 시스템의 시험에서 추가 실험을위한 좋은 기초를 제공 할 수있다.

서론

펩타이드 계 표적 약물 전달 시스템은 지난 몇 년 동안 ^{1, 2를} 통해 암 치료에 빠른 개발 및 유망 영역이되었다. 인간의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체 타입 I (는 GnRH-IR) 주로 뇌하수체에 위치뿐만 아니라 ^3자가 재생산을 담당 여러 다른 조직에 존재한다. 의 GnRH-IR은 생식계 ^-4,5- 관련된 또는 무관 한, 암 조직의 개수로 표현된다. 건강한 조직과 비교하여 여러 가지의 악성 종양 세포의 GnRH-IR의 높은 발현은 표적 치료 ^{(5, 6)에} 대한 기회를 제공한다.

많은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에) 유사체 잔기를 표적으로 사용할 수 지난 수십 년에 개발되어왔다F "> ^{7, 8, 9.} 이러한 펩티드는 악성 종양 세포에 높은 선택성을 가진 항암제를 제공 할 수있는 위에 표현의 GnRH-IR ^6. 대응하는 접합보다 높은 선택성 및 더 나은 효율 몇몇 GnRH의 공액 항암 약물 무료 ^{약물, 9 8 7보고되었다.}

의 GnRH 펩타이드 및 그 수용체에 대한 이전 서적은의 GnRH-IR은 GnRH에 ¹⁰ 유사체에 대해 서로 다른 선택이 다양한 입체를 가정 할 수 있다고보고했다. 고도로 변수의 GnRH-IR은 복잡하고 다양한 신호 전달 경로는 자연과 인공 리간드 ^(11)에 대한 다른 활동이 부여되어있다. 이러한 사실은 GnRH에 기반 시스템의 조사가 도전합니다. 한편, Y는 유망한 치료 가능성을 가지고있다. 방사성 표지의 GnRH 펩티드와 몇 가지 실험을 이전하는 형광 표지의 GnRH 유사체가 사용 된 ^{12, 13, 14, 15,하지만} 실험을보고되었다 여전히 제한되어 있습니다. 방사성 표지는 고감도를 제공하는 동안, 형광 표식은 여러 다른 장점, 예를 들면, 취급이 용이하고, 다른 형광체와 Counterstain과 능력을 갖는다. 성공적 약물 전달에 사용 된 일반적인 세의 GnRH 유사체는 -GnRH-I, [D-리스가 ^6] -GnRH-II와의 GnRH-III 있지만 타겟팅 잔기 이들 펩타이드의 효과 인 ^[6 D-리스]입니다 ^{거의, 17 (16)을} 비교합니다. 한편, 다른 암세포의 GnRH 유사체 사용 된 별도의 실험 결과는 다양하다.

이러한 고려 사항을 바탕으로 ntent는 "> 우리는 이들의 GnRH 펩티드의 대상으로 종양 및 약물 전달의 가능성에 집중하여 합성하고, [D-리스 ⁶ (FITC)] 특징 -의 GnRH-I, [D-리스 ⁶ (FITC를 )] -는 GnRH-II 및 [리스 ⁸ (FITC)] -의 GnRH-III 펩티드 접합체 ^(18)이 유사 선택적 그들의리스 또는 D-리스 (펩티드 FITC 비 측쇄 1 FITC로 표지되어 각각에서 하나. 접합체). 아이디어는 선택적 형광 표식이 펩티드에 대한 새로운 정보를 제공하고, 그 양호한 추적 및 신뢰성 정량화를 허용 할 수 있다고 하였다. 이들 콘쥬 게이트는 쉽게 그들의 종양 타겟팅 효율을 비교할 수 있도록 안전한 취급 및 신뢰성 검출 능력을 가지며, 악성 종양 세포의 많은 종류의 선별. 우리는 최대 이러한 펩티드 접합체와 날짜 실험의 GnRH - 약물 접합체를 타겟팅하는 신규 한 암의 발전에 기여하고, 새로운 치료 타르를 식별하는 데 도움이 될 수있는 희망뿐만 아니라 가져옵니다.

본 원고의 GnRH-FITC 접합체 일부 잘 재현하고 빠른 실험을 보여줍니다. 는 GnRH-R의 세포 표면 발현은 거기서 동시에 시험 세포주에서의 GnRH-IR의 세포 표면 수준을 조사, GnRH에 대한 흡수 한정적 조건이다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)으로의 GnRH-IR과의 GnRH-FITC 접합체를 시각화 한 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량.

프로토콜

세포 배양 및 시약 1. 준비

1. 10 % (v / v)의 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지 불리는) 보충 제조자의 권장 배지에서 세포 배양을 유지한다. 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기 배양기에서 세포 배양 플라스크 유지. 거꾸로 현미경으로 세포의 증식 및 포화 상태에 따라 (10X 위상 대비 목표를 사용).
2. 세포가 적절한 포화 상태에 도달하면, 배지를 제거하고 2-3 ㎖, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 배양을 씻는다. PBS를 제거하고 세포 배양 물 0.5 ㎖, 멸균 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 추가하고 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 배양한다.
3. 트립신을 중지하고 멸균 원심 분리기 튜브로를 전송하는 데 3 ~ 4 mL의 멸균 완전 배지에서 세포를 일시 중단합니다. 실온에서 4 분 (RT) 150 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 무시하고 페이지를 일시 중단2 ~ 3 mL의 멸균 완전 배지에서 ellet.
4. 세포 현탁액 100 μL를 가지고 죽은 세포를 얼룩, 100 μL 0.4 % (m / V를) 트리 판 블루 용액을 혼합한다. 로드 혈구로이 혼합물을 10 μL와 도립 현미경으로 생존 세포의 수를 결정한다.
5. 4 × ¹⁰⁴ 세포 / ㎖를 함유하는 멸균 완전 배지 10 ㎖에 13 단계에서 제조 된 세포 현탁액의 요구량을 희석.
6. 첫 번째 유리 바닥 8 잘 현미경 슬라이드의 일곱 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 ⁽¹⁰⁴ 세포 / 웰). 의 GnRH 흡수 방법이 슬라이드를 사용합니다.
7. 제 8 잘 현미경 슬라이드의 다섯 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 ⁽¹⁰⁴ 세포 / 웰). 이 슬라이드는의 GnRH-IR 발현 방법에 사용된다.
8. 추가 1도 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액의 용액 (4 × ¹⁰⁴ 세포 / 웰) 일곱 아에12 웰 플레이트의 LS. 이 판은 GnRH의 정량 방법에 사용된다.
9. 세포는 두 현미경 슬라이드 플레이트에 부착하자. 48 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기 배양기에서이를 부화.
10. 배양 후 (10X 위상 대비 목표를 사용) 거꾸로 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포가 건강하고 연결된 경우 다음 단계를 계속 진행합니다.
11. 세 접합체 ^(18)의 각각에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 밀리미터의 GnRH-FITC 스톡 용액을 제조 하였다. 의 GnRH-I, 16.97 μg의 / μL [D-리스 ⁶ (FITC)] - -의 GnRH-II 및 16.47 μg의 / μL [리스 ⁸ (16.43 μg의 / μL [D-리스 ⁶ (FITC)] : (이 희석 농도를 사용하여 FITC)] -의 GnRH-III)을 실온에서 어두운 장소에서 이러한 재고 솔루션을 유지하고 몇 주 이내에 그들을 사용합니다.
12. 1.7 μL 1.7 mL를 완전 배지에서 10 세의 GnRH-FITC mM의 스톡 용액을 각각 희석. 이러한 솔루션을 흔들어. (살전전자 미디어의 치료 10 μM의 GnRH-FITC 수 있습니다.) 1.35 mL를 완전 배지에 150 μL 세 10 μM의 GnRH-FITC 치료 매체의 각 희석. 뿐만 아니라 이러한 솔루션을 흔들어 (이것들은 1 μM의 GnRH-FITC 치료 중간).
    주 : 치료 매체를 포함하는 모든의 GnRH-FITC가 빛으로부터 보호하고 몇 시간 내에 사용하여야한다.
13. 37 ° C까지 6의 GnRH-FITC 처리 매체 (단계 1.12에서 제조) 및 4 mL의 완전 배지를 예열.
14. 5 mM의 형광 프로브 솔루션의 3 μL 5 μm의 3 mL의 PBS에 (재료 목록에 언급 된 핵 Counterstain과)를 희석. 이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다.

2. 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)

1. GnRH에 흡수 방법
   1. 단계 1.6에서 제조 된 최초의 현미경 슬라이드를 타고 잘 칠 각각에서 전체 매체를 피펫. 예열이 완료 메디칼의 250 μL를 추가제 1 웰에 음. 음성 대조군으로 사용합니다. (1 μM, 3과 10 μM로 3 우물) 향후 6 우물 각 (1.13부터) 미디어를 처리 예열의 GnRH-FITC의 250 μL를 추가합니다. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기 배양기에서 슬라이드 부화.
   2. 각 웰의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 고정 용액 (10 % 중성 완충 포르말린)의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어.
   3. 각 웰의 고정 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어.
   4. 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫, 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 마지막으로, 각 웰에 장착 매체의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 이미징 때까지 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다.
2. 의 GnRH-IR 발현 방법
   1. 단계 1.7에서 제조 된 제 8 잘 현미경 슬라이드를 타고 다섯 우물에서 각각 전체 매체를 피펫.
   2. 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가이 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 너무 두 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가하고 GnRH에 처리하기 전에의 GnRH-IR 발현을 조사 할 때 사용합니다.
   3. 향후 3 우물에 250 μL 세 예열 된 10 μM의 GnRH-FITC 치료 미디어의 각을 추가합니다. 의 GnRH-IR 발현을 조사하기 전에의 GnRH-FITC 접합체와 세포를 전처리하는이 우물을 사용합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기 배양기에서 슬라이드 부화.
   4. GnRH의 처리 후는 GnRH-IR의 발현을 조사하고 예열 된 완전 배지 250 μL 이러한 웰을 세척하는 데 사용되는 각각의 3 개 웰로부터 처리 매체를 피펫. 250 추가μL의 세 각 웰에 완전 배지를 예열. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기 배양기에서 슬라이드 부화.
   5. 다섯 우물 각각의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 솔루션을 고정의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어.
   6. 각 웰의 고정 솔루션을 피펫과 PBS 250 μL와 세포를 씻는다. 1 시간 동안, 각각의 웰에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블록 함유 PBS 용액 250 μL를 첨가하고 RT에서 슬라이드를 배양한다.
   7. (: 100 비율 1) 1 mL의 PBS에서의 GnRH-IR 차 항체의 10 μL를 희석. RT에 그것을 유지하고 몇 시간 내에 그것을 사용합니다.
   8. 음성 대조군 (제 1도)를 제외한 각 웰에서 BSA 차단 솔루션을 피펫. (음성 대조군 잘 제외) 250 μL PBS로 세포를 씻으십시오. 250 μL PBS는 EAC로 단계 2.2.7에서 제조의 GnRH-IR 차 항체를 포함의 추가(음성 대조군 제외) 시간 잘. 어두운 곳에서, 1 시간 동안 RT에서 슬라이드를 부화.
   9. (: 500 비율 1) 1.25 mL의 PBS에 알렉사 546 레이블 차 항체의 2.5 μL를 희석.
      참고 :이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다.
   10. 다섯 우물 각각의 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 2.2.9에서 제조 된 AF 546 레이블 차 항체를 포함하는 PBS 250 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 슬라이드를 품어.
   11. 각 웰의 용액을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 RT에서 10 분 동안 슬라이드를 품어.
   12. 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 후, 각 웰에 장착 미디어의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 어둠 속에서 슬라이드를 유지RT의 미세한 이미지까지.
3. 영상
   1. 이미지 (63X 오일 침지 대물 사용) 반전 공 초점 레이저 주사 현미경으로 세포
      1. 다음 여기 / 방출 파장을 사용합니다. GnRH에 콘쥬 게이트 : 514분의 488 nm의 알렉사 546 표지 된 항체 : 546분의 488 나노 미터 (만의 GnRH-IR 표현 방법 사용), DRAQ5 형광 프로브 : 680분의 633 nm의.
      2. 음성 대조군 세포를 이용한 촬상 파라미터를 설정한다. 이미지 처리 된 세포에 이러한 매개 변수 (그림 3)를 사용합니다. 재조정 분석의 시작에서 각각의 미세한 슬라이드에 촬상 파라미터. 필요한 경우 제조업체가 제공하는 소프트웨어와 미세 조정과 수출 이미지.

3. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)

1. GnRH에 정량 방법
   1. 단계 1.8에서 제조 된 판을 가지고 개에서 완전 배지를 피펫일곱 우물 채널. 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 1 ML을 추가합니다. 음성 대조군으로 사용합니다. 추가 1 mL의 향후 6 우물에 미디어 (1 μM, 10 μM 3 우물 3 우물)을 치료 예열 여섯의 각. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO ₂ 분위기 배양기에서 플레이트를 인큐베이션.
   2. 각 웰의 매체를 피펫. 조심스럽게 2 mL의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 각 우물에 트립신 EDTA 용액 500 μL를 추가합니다. 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
   3. 트립신을 중지 아니라 각에 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다. 접시를 흔들어. 피펫으로 부드럽게 세포를 일시 중지하고, FACS 튜브에 각 우물에서 현탁액을 전송합니다. 4 ℃에서 4 분 동안 150 XG에 튜브를 원심 분리기.
   4. 하나의 움직임으로 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 세포를 일시 중지 다시 부드럽게 각 FACS 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 500 μL를 추가하고. 이 끝날 때까지 얼음에 튜브를 유지실험.
2. 분석 및 계산
   1. 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다. 여기 들어, 488 nm의 아르곤 레이저 파장을 사용하여 검출을위한 530 nm 파장을 사용한다. 음성 대조군 세포를 실행하여 매개 변수 흐름 cytometer를 설정합니다. 처리 된 세포 (그림 4A)을 분석하려면이 매개 변수를 사용합니다. 제조업체의 소프트웨어와 데이터를 평가 중간 형광 세기 (MFI) 값을 결정하고, MFI 상대 값을 계산한다.

결과

공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 얻어진 영상은 시간 및 농도 의존적으로 주어진 세포 배양에서의 GnRH-FITC 접합체의 흡수에 대한 훌륭한 정보를 제공한다. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병행하여, 세포 표면에의 GnRH-IR의 존재는 CLSM 실험에 의해 검증 가능하다. 또, 원적외선 DNA 염색 형광 프로브를 이용하여, 그것과는 GnRH의 GnRH-IR 외에도 세포의 핵을 Counterstain과 수있다. 공 촛점 이미지 정량화 아니지만 그러나 간단한 "GnRH의 섭취 방법은"쉽게 테스트 셀의 GnRH-FITC 접합체의 더 높거나 낮은 양이 포함되는지 여부를 평가할 수있다. 필요에 따라인가의 GnRH-FITC 접합체 그들의 농도, 처리 시간은,이 방법에서 가변이다. 도 1에 도시 된 바와 같이 다양한 암세포는 농도 의존적으로는 GnRH-FITC 상이한 레벨을 포함한다.

고급 "의 GnRH-IR 발현 방법은"이전과는 GnRH-FITC 처리 후, 면역 세포에 의해 세포 표면의 GnRH-IR의 시각화를 설명한다. 합니다 (GnRH에-FITC 처리 전에)이 메소드의 첫 번째 부분에서 우리의 GnRH-FITC 처리없이, 면역 세포에서의 GnRH-IR을 시각화. 합니다 (GnRH에-FITC 처리 후)이 메소드의 두 번째 부분에서 우리는 10 μM의 GnRH-FITC 1 시간 동안 세포를 취급합니다. 치료 후, 우리는 추가로 1 시간 동안 완전 배지에서 세포를 배양하고 면역 세포로의 GnRH-IR을 시각화. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 다양한 암 세포의 GnRH-FITC 처리 전에 표면의 GnRH-IR의 다양한 수준을 나타낸다. 도 2b에 도시 된 바와 같이,는 GnRH-FITC 처리 후, 발현 세포의 GnRH-IR은 멤브레인상의 (EBC-1) 또는 증가 (디트로이트 562)의 GnRH-IR 레벨을 유지한다. 이 시점에서 우리가 이전에 확인 있습니다 Bx로PC-3 세포도의 GnRH-IR을 표현하지만, 그들의 막 ^(18)에 제시하지 않습니다. 세포막이 투과성이 경우의 GnRH-IR은 면역 세포에 의해 BxPC-3 세포 내부에서 가시화 될 수있다. 이 현상은 BxPC-3 세포의 비교적 낮은 GnRH의 흡수 효율을 설명한다. 이러한 진술을 바탕으로 우리는 여기에 세포 표면의 GnRH-IR에만 초점을 맞 춥니 다. 도 1을 비교하면 2가 세포 표면의 GnRH-IR의 레벨이 대응하는 셀의 GnRH-FITC의 양에 상관 것을 확인도. 또한,도 3c는의 GnRH-FITC의 위치 파악이는 GnRH-FITC 처리 세포 표면의 GnRH-I-H 서까래 하나의 신호로부터 분리되어 있기는 GnRH-FITC를 세포로 내재화되는 것을 명확히. 우리는 "의 GnRH-IR 발현 방법"은 "의 GnRH 흡수 법」에서 얻은 정보를 지원한다는 결론 지었다.

또한 잘 조절 세트를 사용하는 것이 중요이미징 동안 십시. FITC (514 ㎚) 및 형광 표지 된 이차 항체 (546 ㎚)의 발광 파장도 3a에 도시 된 바와 같이, 처리되지 않은 대조군 세포는 또한 약간의 형광도있다. 이 원하지 않는 형광 거짓 긍정적 인 결과를 제공 할 수 있습니다. 이에 의해, 영상의 처음에도 3b에 도시 된 바와 같이, 대조군 세포의 형광 강도를 조정하는 것이 중요하다. 그것은 하나가 다른 두 파장에서 형광 신호 핵 염색 (680 ㎚)의 발광 파장에서의 핵의 명확한 신호를 관찰 할 것으로 예상된다 단지 가시적 또는 제로 근처에있다. 다른 모든 세포 샘플이 잘 조절 및 고정 매개 변수를 이미지화한다. 도 3c에 도시 된 바와 같이,이 방법은, 514 nm에서 관찰 된 신호의 GnRH-IR 및 특히 핵의 신호로부터 680 nm에서의 신호로부터 546 nm에서의 단의 GnRH-FITC의 신호로부터 유도된다. 이미지 Fi를 수필요한 경우, 소프트웨어를 이용하여, 촬상 후에 NE 조정.

실험은 세포에 의해 흡수 된의 GnRH-FITC 접합체의 양에 대한 정량적 정보를 제공 유세포. 필요에 따라인가의 GnRH-FITC 접합체, 그 농도 및 처리 시간은,이 방법도 다양하다. 미처리 세포는 유동 세포 계측법 및 매개 변수 분석 초기에 그들의 중간 형광 세기 (MFI)를 결정하는 조정에 대한 음성 대조군으로서 사용된다. 도 4a에 도시 된 바와 같이, MFI는 동일한 파라미터를 사용하여 각 샘플에 대해 측정 하였다. 상대 MFI 값은도 4b에서의 계산 공식을 이용하여 MFI 값으로부터 계산된다. 이 식을 이용하여, 대조군 세포의 상대적인 MFI 값은 항상 0이다. 산출 된 상대 MFI 값은 (A)에 비례의 GnRH-FITC 접합체의 형광 강도를 정량세포의 농도 verage. 이러한 데이터로,도 5에 도시 된 바와 같이, 하나 보여 이들 암세포가의 GnRH-FITC 접합체를 가지고 얼마나 효율적으로 비교할 수있다. 따라서, 흐름에 의해 얻어진 결과는 세포 계측법 보완하고 공 초점 현미경에 의해 획득 된 이미지를 지원합니다.

도 1 : ^8리스 (FITC) 상기 미처리 및 공 촛점 이미지 -의 GnRH-III 암 세포를 처리 하였다. 블루 얼룩 : 핵; 녹색 얼룩 : [리스 ⁸ (FITC)] -의 GnRH-III. 이러한 이미지는 "GnRH의 흡수 방법"을 사용하여 얻어진다. (A) 비 처리 된 세포의 형광 신호는 각 셀 라인은 514nm (녹색)에서 0에 가깝게 조정된다. DRAQ5 원적외선 형광 프로브는 세포의 핵을 염색하는 데 사용됩니다. 상기 EBC-1 폐암 디트로이트-562 인간의 설정을 적용하면 (B)인두 암세포 검출 보여 주지만, 1 μM [리스 ⁸ (FITC)]을 5 시간 처리 후 514 nm의 (녹색)에 낮은 신호 -의 GnRH-III. 10 μM 5 시간 처리 후 (C) [리스 ⁸ (FITC)] -의 GnRH-III 세 세포주 각각 본 높은 형광 신호. 이 실험의 결과는 GnRH의 접합체 쉽게 타겟팅 할 수있는 두 가지 다른 세포주에 비해 BxPC-3 췌장 암 세포는 매우 낮은 효율로의 GnRH-FITC를 제안했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 전후 [D-리스 ⁶ (FITC)] 세포 표면의 GnRH-IR의 공 초점 이미지 -의 GnRH-I 처리. 블루 얼룩 : 핵; 녹색 얼룩 : [D-리스 ⁶ (FITC)] -의 GnRH-I; 붉은 얼룩 : GnRH에-IR. 이러한 이미지는 "는 GnRH-IR 발현 방법"을 사용하여 생성된다. (A)에의 GnRH-FITC 처리 전에 BxPC-3 세포 그러나, 멤브레인의 GnRH-IR이없는 EBC-1 세포는 높은 발현 및 특정 디트로이트-562 세포의 GnRH-IR의 중간 레벨을 나타낸다. 의 GnRH-FITC 처리 후 (B), BxPC-3 세포는 여전히 멤브레인의 GnRH-IR을 발현하지 않는다. EBC-1 세포는 자신의 GnRH-IR 발현과의 GnRH-FITC 그들 내부에 나타납니다 유지한다. 디트로이트-562 세포 치료 이후의 GnRH-IR의 높은 수준을 보이는 것 같다 그들은뿐만 아니라,의 GnRH-FITC를 차지합니다. 이 실험은, 악성 종양 세포의 종류는 그 표면에의 GnRH-IR의 다른 레벨을 나타내는 것을 알 수와의 GnRH-FITC 흡수 밀접 세포 표면의 GnRH-IR 발현과 관련이있을 것으로 보인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 3 : EBC-1 폐암 세포의 공 초점 이미지. 블루 얼룩 : 핵; 녹색 얼룩 : [리스 ⁸ (FITC)] -의 GnRH-III; 붉은 얼룩 : GnRH에-IR. 이 이미지는 "의 GnRH-IR의 표현 방법"에 의해 만들어집니다. 위에 증폭 장비 설정을 사용하는 경우 (A) (의 GnRH-FITC 및 알렉사 546)없이 미처리 대조군 세포는 514 nm 내지 546 nm에서 검출 원하지 않는 형광있다. (B) 처리되지 않은 음성 대조군 세포의 장비 설정을 조정은, 녹색 (514nm)과 빨간색 (546 ㎚) 신호가 제로 근처에있다. (C) 조정 파라미터 처리는 GnRH-FITC와의 GnRH-IR 염색 된 세포에 대한 명확하고 안정적인 신호를 초래한다. 의 GnRH-FITC 처리 후에는 GnRH-FITC (녹색)의 위치 파악은 세포 표면의 GnRH-IR (적색)로부터 분리된다.529fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 데이터 유동 세포 계측법의 평가. 미처리 및 처리 디트로이트-562 세포 (A) 히스토그램. 세포 샘플의 MFI 값의 히스토그램으로부터 결정된다. x 축은 세포의 형광 강도를 도시하고, Y 축은 카운트를 나타낸다. 검은 선 다음의 GnRH-FITC 처리하기 전에 MFI; 녹색 점선 : MFI 1 μM [리스 ⁸ (FITC)]으로 5 시간 처리 후 -의 GnRH-III; 의 GnRH-III - 10 μM [리스 ⁸ (FITC)]으로 5 시간 처리 후 MFI : 빨간색 점선. MFI 상대 값 (B) 계산식. 상대 MFI 값은 MFI 값으로부터 계산된다. 이 계산을 이용하여, 처리되지 않은 대조군 샘플의 상대 MFI 값은 항상 0이다. relat 처리 된 샘플의 IVE MFI 값은 세포 내부에의 GnRH-FITC 접합체의 양을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5는 GnRH-FITC 접합체 1 μM 5 시간 처리 한 후 암세포의 상대 MFI 값. 상대 MFI 값을 비교하고 주어진 세포 유형의 GnRH 유사체를 취할 수있는 방법을 효율적으로 정의합니다. 의 GnRH-IR이 아닌 전시 BxPC-3 세포는 이들의 GnRH 유사체의 흔적이 포함되어 있습니다. EBC-1 폐암 세포를 발현의 GnRH-IR 적당히 포함하고 디트로이트 562 인두 암세포의 GnRH 유사체의 많은 양을 함유한다. 결과는 = 3 N, 평균 ± SD로 표시됩니다."_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

실험은 선별을 위해 선택적으로 부착 표지의 GnRH 유사체를 사용하여 본원에 기재된 시험 관내 세포 배양. 공 초점 현미경과 세포 계측법 방법은 추적에 적합하고, 시간과 농도 의존적으로 이들의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량화되어 흐른다. 이 실험은 다음과 같은 중요한 단계 : 1) 멸균 건강한 세포 배양 물을 유지하는 단계; 2)의 GnRH 펩타이드는 고품질이어야합니다; 3) 적당한 농도와 배양 시간 따라야합니다; 4) 치료 및 세척 단계; 5) 기기 설정을 잘 조절.

세포는 제조업체의 10 %로 보충 권장 배지 (V / V) 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지)에서 유지된다. 세포를 보관하고 (GnRH에-FITC 콘쥬 게이트로) 처리 단계까지 무균 환경에서 처리되어야합니다. 실험하기 전에, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 확인합니다. 그들은 건강해야첨부하고 필요한 수량에 도달해야합니다.

이는 고품질의 순도는 GnRH 펩타이드를 사용하는 것이 중요하다. 우리는이 펩티드를 합성하여 98 % 이상 ^(18)로 정제 하였다. 펩타이드는 동결 건조 된 분말로서 냉장고에 -25 ℃에서 저장 될 수있다. DMSO에서 10 밀리미터의 GnRH-FITC의 재고 솔루션은 실온에서 어두운 장소에 보관하고 몇 주 내에 사용되어야한다. 우리는이 복합체의 안정성을 조사하고 그들이 DMSO에 안정된하고 자신의 형광 강도가 적절한 보관 1 개월 후 유지되는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-FITC 접합체의 농도와 치료의 시간은 큰 장점을 제공이 실험에서 변수이지만, 특정 제한 사항 (아래 참조). 이 프로토콜에 적용 농도 및 배양 시간은 단지 권고 있지만, 그들은 초기 실험을위한 좋은 기초를 제공한다.

CLSM 실험은 절단이 필요알 세척 단계. 이러한 단계는 신중하게 수행되어야한다. 세포에 직접 액체를 전송하지 마십시오. 오히려, 측면 또는 이러한 목적을 위해, 웰 코너를 사용한다. 이 떨어져 세척하고 부착 된 세포 손실을 최소화 할 수 있습니다. 이 형광 샘플 (photobleaching에 영향을) 감도를 줄이다 수 또한 전체 실험 기간 동안 직사광선을 방지하는 것이 좋습니다. 어두운 곳에서 처리 된 샘플을 유지하거나 실험하는 동안 알루미늄 호일 조각으로 덮여있다. 이전의 결과에 따라인가 된 처리 매체의 최종 DMSO 농도 (0.1 % (V / V) 10 μM 처리 매체 DMSO) 결과에 영향을주지는 이에 DMSO없는 완전 배지는 무시할 수 있음을 발견 음성 대조군으로도 적합.

CLSM 및 FACS 실험 중에 잘 조정 악기 매개 변수를 사용하는 것이 중요합니다. 이들 파라미터 모두는 분석 전에 모든 세포 타입에 재 교정 할 필요가있다. CLSM 실험에서, SI레이저 강도, 검출기 이득 및 오프셋 및 핀홀 크기 : 촛점 이미지 gnal 강도는 다음 파라미터에 의존한다. 이들 매개 변수를 조정하는 경우, 수용 가능한 이미지를 생성 및 광표백을 피하기 위하여 낮은 레이저 출력을 사용한다. 제로 근방 (도 3b)에 흠없는 대조군 세포의 배경 형광을 조정하는 촬상 파라미터를 설정한다. 이러한 조정 매개 변수를 사용하여 이미지 처리 된 세포는 거짓 긍정적 인 결과를 방지 할 수 있습니다. 의 GnRH 또는 GnRH에-IR에 대한 필수 정보를 포함 내지 514 nm의 (546)에서 처리 된 세포에서 방출 추가 신호. 이 단계는 CLSM 실험 경험을 필요로한다. FACS 실험에서, 그래프의 중앙에 주요 생존 세포 집단을 조절하는 표준 전방 산란 측 산점도 (리니어 스케일)과 설정 전압을 생성한다. 살아있는 세포 주위의 영역을 그립니다. 히스토그램을 생성, 설정 횡축 일 (FL1-530 나노, 로그 스케일을) 채널과 게이트로 이전에 정의 된 영역을 설정합니다이 히스토그램. 10 ⁽¹⁾ (도 4a)에 따라 염색 음성 대조군 세포의 신호를 가지고 FL1 전압을 설정한다. 이러한 조정 매개 변수를 처리 한 세포를 분석 할 수 있습니다.

또한, 수시로 세포 배양의 마이코 플라즈마 상태를 확인하는 것이 중요하다. 다양한 분석법이 목적을 위해 사용할 수있다. 마이코 플라스마 양성의 경우, 세포를 버리고 새로운 문화 작업을 시작합니다. 이는 마이코 플라즈마 않도록 최적화 된 배지에서 항생제 혼합물을 사용하는 것이 권장된다. 의 GnRH-FITC 접합체의인가 농도 및 치료 시간은 그러나 형광 검출 너무 약한 신호가 발생할 수 저농도 짧은 배양 시간을 적용 실험 변수이다.

의 GnRH 유사체와 병렬에서의 GnRH-IR 이미징 때, 더 높은의 GnRH-FITC 농도가 좋습니다 (10 μM 최적입니다). 높은 농도의 이유짧은 배양 시간 (1 시간)과의 GnRH-FITC 접합체와 비교하여, 표지 된 항체의 상대적으로 높은 형광 신호이다. 한편, 두 형광 염료를 배출 (514 nm 내지 546 ㎚) 사이의 작은 오버랩은 단지 546 nm에서 발생의 GnRH-FITC 접합체의 신호로부터 유도되는, 발견되었다. 도 3에서 설명하지만, 알렉사 546 및 웰 조정 파라미터의 상대적으로 높은 형광 신호는이 효과를 최소화 할 수있다. 중복을 피하기 위해 다른 가능한 해결책은합니다 (CLSM 기술 파라미터가이를 허용한다면) FITC에 비해 상이한 여기 파장 및 / 또는 더 나은 분리 발광 스펙트럼을 갖는다 차 항체를 표지 적용하는 것이다. 이러한 가능성의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로 선택적 형광 프로브를 사용 가능하게 CLSM 방법에 대해 큰 장점을 제공한다. 예를 들어, 이들 다른 형광 프로브는 필요에 따라 다른 소기관으로 대조 사용될 수있다.

의 GnRH-FITC 접합체의 적용 농도는 다음과 같은 제한이 있습니다. 의 GnRH-FITC 접합체의 최대 농도 한계는 용해도 ^(18)에 기초한다. 이러한 값은 실온에서 PBS에 다음과 같다의 GnRH-I를 90 μM; 의 GnRH-II : 40 μM; 의 GnRH-III : 200 μM. 한편, 이전의 실험에서는 다음의 GnRH 펩티드의 흡수 인간의 GnRH-I 수용체 이외의 수용체에 의해 일어날 수 있다고 생각; 이 흡수는 ¹⁸ (10 μM 위)보다 높은 농도에서 더 중요한 것 같다. 의 GnRH-FITC 접합체의 검출 하한치가 다양한 파라미터를 기반으로하지만, 최적 설정에서 실험은 CLMS 약 1 μM이다. 우리는 흐름 세포 계측법 공 초점 현미경보다 더 나은 감도를 제공했습니다. 이상적인 설정에서의 GnRH-FITC 접합체의 정량 한계 미만 1 μM 수 있습니다. 검출 또는 정량 한계 수그들은 세포 유형 및 배양 시간에 따라 달라 지므로, 모든 실험에서 상이 할. 이 샘플 당 세포의 수천을 감지하고 세포의 평균 신호가 계산되기 때문에 FACS에 의해 얻어진 데이터가 CLSM보다 더 신뢰할 수 있습니다. 그러나, 프로토콜, FACS는의 GnRH-FITC 접합체의 세포 현지화의 GnRH-IR의 세포 표면 발현에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이러한 고려에 기초하여, 우리는 CLSM 및 FACS 실험이 독특한 장점을 가지고 결론, 그들은 서로를 보완. 한편, 함량이 높은 화상 분석 흥미롭고과 CLSM FACS 분석에 대한 좋은 대안이 될 수있다.

요약하면,이 실험에서 얻은 데이터는 세 가지의 GnRH-FITC 접합체의 각 세포 표면의 GnRH-IR을 발현하는 세포에 들어갈 수 있음을 확인한다. 이들의 GnRH 유사체은 같은 농도에서 유사한 타겟팅 효능이있다. 다른 캔 표면 그러나의 GnRH-IR 레벨CER 세포는 매우 다양하다. 유동 세포 계측법 분석의 데이터로부터 계산 된 결과는 세포주 또는의 GnRH 유사체의 비교를 가능하게한다. 동시에, 공 초점 현미경에 의해 얻은 이미지는 세포 표면의 GnRH-IR의 발현 수준을 나타내 이들 접합체가 세포로 내재화되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과에 기초하여, 하나는 도입 실험 GnRH에 기초하여 약물 전달 시스템의 조사를위한 실용적인 방법 변수를 포함하는 추가의 실험을위한 좋은 기초를 제공하는 것을 확인할 수있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
EBC-1	JCRB 세포 은행	JCRB0820	인간 폐 편평 세포 암종
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	인간 췌장 선암
디트로이트-562	ATCC	CCL-138	인간 인두 암종
RPMI-1640 L-글루타민이 있는 배지	Lonza	BE12-702F	BxPC-3 세포용 배양 배지
Eagle's Minimum Essential EBC-1	Lonza	BE12-611F	그리고 Detroit-562 세포를 위한 0.1% 나트륨 피루베이트로 보충
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	는 배양 매체 (항생제)를 보완합니다.
표준 라인 세포 배양 플라스크	VWR	10062-872	세포에 일관된, 멸균 성장 환경을 제공합니다
트립신-EDTA 혼합물	Lonza	BE17-161E	부착 된 세포 제거
인산염 완충 식염수 (PBS)	Lonza	BE17-516F	용매
디메틸 설폭 사이드	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	용매
Trypan 블루 솔루션, 0.4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061	세포 계수에 사용
[D-Lys6(FITC)] -GnRH-I	made by us	-	순도 ≥ 98 % (HPLC)
[D-Lys6 < / sup > (FITC)] -GnRH-II	us-Purity	에 의해 만들어졌다	; 98 % (HPLC)
[Lys 8 < / sup > (FITC)] -GnRH-III	미국 제조	-	Purity ≥ 98% (HPLC)
유리 바닥 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	CLSM 실험에 사용
Corning Costar 세포 배양 플레이트, 12 웰	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	FACS 실험에 사용
고정 용액(10% 중성 완충 포르말린)	Bio-Optica	01V60P	부착 세포 고정
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A7906-10G	항체의 비특이적 결합 방지
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	면역세포화학 시약, human type-I GnRH 수용체에
결합 Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, 1차 항체에 결합
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	카운터스테인 핵
플루오로마운트 수성 장착 매체	시그마-알드리치	F4680-25ML	CLSM 실험에서 사용, 형광
보존 반전 현미경	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	세포 배양의 표현형 및 밀도 확인
반전 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Zeiss	LSM-710	CLSM 실험에 사용
유세포 분석기	BD Biosciences	BD FACSCalibur	FACS 실험에 사용