레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
한 DNA 손상 반응 (DDR)는 광범위 생균 마이크로 레이저 빔 조사에 의해 유도 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)의 연구에있어서되었다. 동독은 interstrand DNA에 크로스 링크 (ICLS)를 포함하여 DNA의 공유 개조를 왜곡하는 나선뿐만 아니라, 정의되지 않는다. 우리는 살아있는 세포의 핵에, immunotagged psoralens의 레이저 photoactivation 현지화 ICLS에 의해 자극 DDR을 공부했다. 부가 배포 및 복제 포크의 만남에 대한 근본적인 문제를 해결하기 위해, 우리는 두 개의 다른 기술과 레이저 현지화를 결합했다. DNA 섬유는 종종 짧은 펄스 중에 혼입 클레오 사이드 유사체의 면역에 의한 복제 포크의 진행을 표시하기 위해 사용된다. Immunoquantum 점은 널리 단일 분자 이미징을 위해 사용되어왔다. 새로운 방식으로, 레이저 국소 ICLS 운반 세포로부터 DNA 섬유 현미경 슬라이드 상에 확산된다. 태그가 달린 ICLS는 immunoquantum 점 및 일 함께 표시됩니다E 간 거리 병변 결정. ICLS와 복제 포크의 충돌이 가시화 될 수 있으며, 다른 만남 패턴 확인 및 정량.
서론
DNA는 또한,도 산화 적 대사에 의해 생성 된 내인성 라디칼 종에 의해 공격 등의 방사선, 자외선, 환경 독소, 연소 생성물과 같은 외래 에이전트로부터 일정한 공격을 받고있다. 이 모든 화학적 또는 물리적으로 DNA 1의 무결성을 방해 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 게놈의 교란은 병변 수리에 관여하는 단백질과 마이크로 RNA하지 않을 경우 수천, 수백와 DNA 손상 응답 (DDR), 모집 및 사후 번역 수정 캐스케이드를 활성화 할 수 있습니다, 세포주기, 세포 사멸, 노화 및 염증 경로의 조절 2.
동독에 대한 우리의 정보의 대부분은 DSBs와 연구에서 비롯됩니다. 이는 3 살아있는 세포 게놈 DNA에서 서열 특이 나누기 포함 나누기를 도입하기위한 기술의 유용성에 큰 부분이다. 또한, propensit중단의 예는 면역에 의해 표시 될 수 DDR 단백질의 초점을 유도하는 단계, 및 반응 속도론 단백질의 요구를 식별하는 매우 유용하고있다. 동독 연구를위한 핵심 기술 중 하나는 살아있는 세포 4의 핵에 '관심 지역'에 DSBs의 스트라이프를 직접 (ROI)을....
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프로토콜
파기 TMP-1의 제조
- 50 mg의 (0.18 밀리몰) 8- trimethylpsoralen 4'- 클로로 -4,5- '및 건식 25 ㎖ 둥근 590 mg의 (2.7 밀리몰) 4,7,10- 트리 옥사 1,13-tridecanedi 아민의 믹스 질소하에 플라스크 -bottom. 12 시간 동안 톨루엔 10ml를 첨가하고 환류를 추가한다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다.
- 실리카겔상에서 플래시 칼럼 크로마토 그래피시킴으로써 잔류 물을 정제 하였다. (1 : 0.5 ~ 9), 클로로포름, 메탄올, 28 % 암모니아 용액으로 컬럼을 용출시켰다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 증발시키고, 회복 순수 -4 '- [N- (13- 아미노 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 메틸 4,5', 8- trimethylpsoralen 점성의 담황색 액체.
- 4 5.5 밀리그램 (0.012 밀리몰)을 혼합 '- [N-를 (13- 아미노 - 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 -4,5-'디곡 NHS 에스테르 5 ㎎ (0.008 밀리몰)의 8-trimethylpsoralen 질소하에 무수 환저 플라스크. 0.5 mL의 무수 디메틸 포름 아미드를 추가 (DM....
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결과
레이저 지역화 파고-TMP (그림 1A) ICLS는 소 랄렌에 연결 발굴 태그에 대한 면역 형광 표시 할 수 있습니다. 레이저 임의 형상의 영역에서 공격 지시 할 수 있지만, 줄무늬 세포 "자연"형상없고, 정당한 신호 용이 의한 일차 또는 이차 항체에 의한 비특이적 결합 아티팩트 구별 될 수있다. 완벽한 특이 이하의 항체를 사용하는 경우이 기능을 사용하면 도움이된다. 파기-TMP ICLS의 스트라이프의 DDR, γ-H2AX의 공지 된 마커의 예는도 1b에 도시된다.
발굴의 면역 형광은 부가의 빈도와 간격과 같은 결론을 허용하지 않습니다 레이저 스트라이프 병변 태그. 확인하기 위해이 판정 세포 전에 ICLS 도입로 24 시간 동안 배양 하였다 CldU. 제 대하여 염색E CldU는 파.......
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토론
레이저 현지화 기술은 밝은 필드 현미경에서 볼 수 있습니다 핵에 부착 세포의 사용을 필요로한다. 우리는 리신 또는 콜라겐, 또는 더 복잡한 혼합물로서 세포 접착 제제로 유리 표면에, 예컨대 차 림프구 또는 AD293 느슨하게 접착 배양 된 세포와 같은 비 접착 성 세포를 부착하는 것을 시도했다. 이러한 치료는 표면에 세포를 결합 할 수 있지만, 우리는 그들이 일반적으로 매우 어려운 핵에 집중하고 둥근 머물 것을 찾을 수 있습니다. 또한, 세포들은 성장 배지를 제거한 후, 세척, 초기 생존하지 못한다. 그러나, 접착 세포에 대한 요구 사항 내에서, 우리는 성공적으로이 연구에 대한 표준 셀 라인의 다양한뿐만 아니라 일차 전지를 사용하고 있습니다. 마이코 플라스마 오염에 대한 세포를 테스트하는 데 유용합니다. 우리는 세포 반응은 이러한 감염에 의해 변경되는 것을 찾을 수 있습니다.
레이저의 초점면은 중요하다. 목표는이다핵 내에서 ICLS를 놓습니다. 너무 높은 및 photoacti.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 연구는 (Z01 AG000746-08)와 판 코니 빈혈 연구 기금을 노화에 국립 보건원, 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Digoxigenin NHS 에스테르 | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| 디아미노글리콜 | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| 암모늄 용액 | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC 플레이트 | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass 유리 기둥 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 회전 디스크 컨포칼 현미경, 자동 스테이지 및 환경 제어 챔버 및 플레이트 홀더 장착 | Perkin Elmer | Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | 질소 펄스 레이저를 사용한 | Andor Technologies | |
| 염료 셀 | Andor Technologies | MP-2250-2-365 365 | |
| 염료 | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm 유리 botomm 플레이트 1.5 커버슬립, 10 mm 유리 직경, 코팅되지 않은 | Matek | P35G-1.5-10-C | |
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| 토끼 안티 Dig 항체 | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 염소 안티 토끼 IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- 염소 안티 쥐 IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-염소 안티 마우스 IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent 현미경 A200 | Zeiss | Axiovision 소프트웨어 | |
| Q-dot 655 필터 | Chroma | 39107 |
참고문헌
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2....
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