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방법 논문

안

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55559

⸱

2017년 5월 8일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Public Health Research Institute Centre, New Jersey Medical School, Rutgers, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, NIAID, NIH

이 논문에서

요약

여기에서는 폐결핵 병변 및 충치에서 caseum에 대한 약물 결합을 측정하기위한 신속한 평형 투석 (RED) 방법에 대해 설명합니다. 프로토콜은 또한 caseum에 효과적인 대리 대리인 거품 마크로파지 파생 매트릭스와 함께 사용됩니다.

초록

결핵성 질병 퇴치는 복잡한 폐 병변의 여러 층을 침투 할 수있는 약물 요법을 필요로합니다. 충치 및 병변의 caseous 코어의 약물 분포는 일반적으로 persisters로 알려진 약물 내성 박테리아의 subpopulations을 보유하기 때문에 특히 중요합니다. 결핵 병변에서 약물 침투를 측정하기위한 기존의 방법 은 생체 분석 또는 영상 기술과 결합 된 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 생체 내 약물 동태 학 연구를 필요로한다. Caseum macromolecules에 결합하는 약물의 in vitro 측정은 이러한 결합이 caseum을 통한 약물 분자의 수동 확산을 방해하기 때문에 그러한 기술의 대안으로 제안되었다. 신속한 평형 투석은 혈장 단백질 및 조직 결합 연구를 수행하는 빠르고 안정적인 시스템입니다. 이 프로토콜에서 우리는 빠른 평형 투석 (RED) 장치를 사용하여 excis 인 caseum의 균질 액에 대한 약물 결합을 측정했습니다병변 결핵 감염 토끼 공동 에드. 이 프로토콜은 또한 caseum 대신 사용할 THP-1 식세포로드 지질에서 대리 매트릭스를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 caseum / 대리 결합 분석은 결핵 신약 개발에 중요한 도구입니다 및 기타 질병으로 인한 병변이나 농양의 약물 분포를 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.

서론

폐결핵병의 치료에는 약물을 여러 종류의 병변으로 효과적으로 분배해야합니다. Necrotic 병변과 충치는 약물 내성 또는 '영구'박테리아의 subpopulations을 보유 caseous 센터가 포함되어 있습니다. 1 , 2 공동 질환은 열등한 치료율과 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 3 , 4 이전의 연구들은 정량적 및 영상 기법을 사용하여 caseum을 투과시키는 능력이 약물 종류에 따라 크게 다르다는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 방법은 느리고 지루한 동물 감염 모델을 사용해야합니다. 생체 외 caseum에 대한 약물 결합을 측정하는 in vitro 분석이 설계되었습니다. 이 결합은 육아종 육아종의 약물 침투와 역으로 상관 관계가 있으며, 따라서예측 도구로 사용됩니다. 7

평형 투석은 혈장 단백질 결합 연구에 대한 금 기본 접근법으로 간주됩니다. 빠른 평형 투석 (RED) 장치는 그러한 분석을 수행하는 데 빠르고, 사용하기 쉽고 신뢰할 수있는 시스템을 제공합니다. 8 장치는 두 가지 구성 요소로 이루어져 있습니다. 일회용, 일회용 멤브레인의 수직 실린더로 분리 된 2 개의 챔버로 구성된 일회용 인서트. 한 번에 최대 48 개의 인서트를 고정 할 수있는 재사용 가능한베이스 플레이트가 있습니다. 투석막은 약물 - 고분자 결합 연구에 이상적인 8kDa 분자량 컷오프 (MWCO)를 가지고 있습니다. 멤브레인 격실의 높은 표면적 대 부피 비율은 신속한 투석 및 평형을 가능하게합니다. 인서트와베이스 플레이트는 최소한의 비특이적 결합을 위해 검증되었습니다. RED 장치와 생물 분석 기술의 결합은 p에서 약물의 결합되지 않은 분율을 정확하게 추정합니다lasma. 8 , 9

원래 혈장 단백질 결합을 측정하기 위해 고안되었지만 RED 장치는 균질 물질을 사용하는 여러 조직 결합 연구에 사용되었습니다. 이 프로토콜에서는 괴사 성 병변과 결핵에 감염된 토끼의 충치에서 절제 된 괴사 잔해 인 caseum에 대한 약물 결합을 측정합니다. 소포 성 물질의 무 세포 및 비 - 혈관 성질은 분석과 양립 가능한 균질 현탁액으로 균질화하는 것을 용이하게한다.

caseum이 생산이 어려우며 오기가 어렵다는 것을 감안할 때, 의정서는 포말 성 대 식세포로 준비된 대용 매트릭스와 함께 사용하도록 검증되었습니다. THP-1 단핵 세포 유래 대 식세포는 올레산으로 유도되어 여러 개의 지질을 축적하여 '거품'을 일으 킵니다. 이러한 지질로드 된 세포를 수확하고우리가 caseum에 대한 대용 물로 사용하는 행렬을 생성하기 위해 처리됩니다. 이 연구는이 대용 행렬에 대한 약물 결합이 caseum에 결합하는 것과 잘 연관되어 육아종 및 충치의 중대한 코어에서 약물 침투를 방해하는 생체 내 과정을 효과적으로 모방 함을 보여주었습니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 메릴랜드 주 베데스다의 NIAID (NIH) 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 수행되었습니다. 결핵과 관련된 모든 연구는 생물 안전성 봉쇄 수준 3 (BSL-3)의 실험실에서 수행되었습니다.

1. 토끼 감염 모델 및 Caseum 수집

  1. 이전에 설명한대로 코에 에어로졸 노출 시스템을 사용하여 M. tuberculosis로 뉴질랜드 흰 토끼를 감염시킵니다. 12 , 13 12-16 주 동안 감염이 진행되도록하십시오. 토끼에게 35 mg / kg ketamine과 5 mg / kg xylazine을 근육 내 주사하고, 0.22 mL / kg pentobarbital sodium과 phenytoin sodium을 정맥 내로 안락사시키고 부검을 진행하십시오.
  2. 족집게와 메스를 사용하여 가슴에서 폐를 제거하십시오.vity. 각 폐 엽으로부터 메스를 사용하여 개별 공동 큰 괴사 육아종 해부. 조심스럽게 캐비티 및 육아종 벽에서 caseum을 긁어. 사용 전까지 -20 ℃에서 2 ㎖의 스크류 캡 튜브에서 기록 및 저장 샘플을 단다.
  3. BSL-2 실험실에서 사용하기에 uninfectious 안전 렌더링하기 위해 드라이 아이스에 3 MegaRad에 감염 caseum 샘플을 감마 - 조사.

THP-1 세포로부터의 시험 관내 Caseum 대리 2 세대

  1. (80 ㎖ / 플라스크) T175 세포 배양 플라스크 RPMI 1640 배지 (2 mM의 L- 글루타민 및 10 % 소 태아 혈청)에서 THP-1 단핵 세포 성장. 3-4 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2 분위기에서 플라스크를 인큐베이션.
  2. 5 분 동안 150 XG 두 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 T175 플라스크로부터의 배양 물을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 RPMI 1640 매체 10ml에 펠렛을 정지.
  3. t의 45 μL를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 피펫이 배양 5 μLrypan 블루. 피펫에 의해 철저하게 섞는다. 혈구 10 μL 전송 및 광학 현미경 (배율 10 배)를 사용하여 (흠) 가능한 THP-1 단핵 세포 수를 계산. 배양액 1 ㎖ 당 생존 세포의 수를 계산한다. 1.25 × 106 세포 / ㎖의 최종 농도로 RPMI 배지로 희석한다.
  4. 대규모 세포 배양 판 (50 × 106 세포 / 플레이트)에 배양액 40 ㎖의로드. 100 μM PMA (포르 에탄올을 제조 12 myristate13 아세테이트) 40 μL를 첨가하고 세포 배양기에서 밤새도록 부착 할 수있다.
    참고 : PMA의 최종 농도는 100 nm의입니다.
  5. 0.1 M (968.3 μL 에탄올 즉 31.7 μL OA)의 농도로 순수 에탄올 올레산 (OA) (0.89 g / ml)로 희석. 10 mM의 농도로 신선한 예열 RMPI 매체에 상기 용액을 희석. RPMI 배지에서 0.4 밀리미터 (최종 작업 농도)이 OA 현탁액을 희석하여 37 ℃로 예열.
  6. 기존의 미디어와 비를 제거세포 배양 플레이트에서 첨부 된 세포와 부드럽게 THP - 1 macrophages (THP - M)에 0.4 MM OA 40 ML을 추가합니다. 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 품어.
  7. 40 배 배율의 광학 현미경을 사용하여 각 THP-M에서 수많은 지질 바디 함유 물의 존재를 시각적으로 확인합니다. 세포 배양 플레이트에서 모든 RPMI 매체를 제거하고 부드럽게 50 ML 혈청 피펫을 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 접착 세포를 씻으십시오.
    참고 : 지질 체는 THP-M의 세포질에 작고 깨끗한 구형 구조로 나타납니다.
  8. 각 플레이트에 5 MM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 40 mL를 넣는다. 37 ° C에서 15 분 동안 품어 라.
  9. 10 ML 혈청 피펫을 사용하여 전체 접시의 표면 위에 반복적으로 pipetting하여 거품 macrophages (FM)를 분리하십시오. 세포 현탁액을 50 ML 원추형 튜브에 전송하고 5 분 150 XG에서 스핀 다운.
  10. PBS (세 번째 PBS 세척) 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend사전 칭량 된 15-mL 원뿔 튜브로 옮긴다. 5 분 동안 150 xg에서 다시 스핀 다운하십시오. 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 뜨는을 기음과 폐기하십시오.
  11. FM 펠렛을 3 회 동결 - 해동시켜 세포를 녹이고 75 ° C에서 20-30 분 동안 배양하여 매트릭스의 단백질을 변성시킵니다. 사용 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 알약을 보관하십시오.

3. 신속한 평형 투석 (RED) 분석

  1. DMSO (dimethyl sulfoxide)에 모든 시험 화합물의 10 mM 저장 용액을 준비하십시오. 각 분석 전에 DMSO에서 500 μm의 작업 솔루션으로 희석.
  2. caseum 대리 대리인을 포함하는 튜브의 무게를 단다. 빈 튜브의 무게를 빼서 펠렛의 무게만을 뽑아 낸다. 튜브 당 2-3 금속 구슬을 추가하고 1 분 동안 1,200 스트로크 / 분의 조직 균질기를 사용하여 각 매트릭스의 10 배 희석 된 현탁액을 달성하기 위해 1 분 동안 caseum 또는 대리모 매트릭스를 PBS (1 : 9 w / v)에서 분출하십시오.
  3. 스파이크 6.5 μL의 5005 μM (≤1 % DMSO) 및 와동의 최종 농도를 달성하기 위해 643.5 μL의 균질 액에 시험 화합물의 μM 용액.
  4. RED 인서트를베이스 플레이트에 놓습니다. 각 RED 인서트의 기증자 챔버 (빨간 링)와 각 수신기 챔버에 PBS 350 μL에 마약 스파이크 매트릭스의 200 μL를 추가합니다. 각 시험 화합물에 대해 3 개의 인서트를 준비하십시오 (3 중 샘플). 플레이트를 접착 플레이트 씰로 밀봉하고 37 ° C에서 200 rpm (1 xg)으로 4 시간 동안 Thermomixer에서 배양합니다.
  5. 부화 후, 2-3 회 위 아래로 pipetting하여 기증자 및 수신기 챔버의 내용을 부드럽게 섞는다. 기증자 챔버에서 homogenate의 20 μL aliquots을 피펫과 1.5 ML 튜브 (1시 1 분)에 깨끗한 PBS 20 μL에 추가하십시오. 마찬가지로, 리시버 챔버에서 PBS 샘플의 20 μL aliquots을 피펫 깨끗한 homogenate (매트릭스 일치) 20 μL에 추가합니다. 8
    참고 : 매트릭스 일치는 ne를 제거합니다.정량 분석을 위해 2 개의 개별 보정 곡선 (균질 액 및 PBS 중)을 제조 할 수 있습니다. 도너 챔버의 내용물은 시간이 지남에 따라 침전 될 수 있습니다. 분액을 제거하기 전에 pipetting으로 내용물을 천천히 혼합하십시오.

4. LC-MS 정량 및 데이터 분석

  1. 각 튜브와 볼텍스에 500 ng / mL diclofenac 또는 10 ng / mL verapamil (내부 표준 물질)이 함유 된 1 : 1 메탄올 : 아세토 니트릴 160 μL를 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하여 침전물을 침전시키고 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석기 (LCMS) 분석을 위해 상층 액을 96- 웰 심층 플레이트로 옮긴다. 7
  2. 위의 샘플과 동일한 매트릭스 구성을 유지하면서 각 테스트 화합물에 대해 1 ~ 1,000 nM의 보정 곡선을 작성하십시오. LC-MS 방법을 사용하여 기증자 및 수용기 챔버의 시료에서 시험 화합물의 농도를 정량화합니다.
  3. 언 바운드 분율 ( f u ) 계산식 1을 사용하여 희석 된 매트릭스에서 약물을 계산하십시오. 식 2 ( D = 희석 계수 10)를 사용하여 희석되지 않은 매트릭스에서 f u 를 계산하십시오. 14
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
  4. 안정성 / 신진 대사 / 비특이적 결합 문제가있는 화합물을 확인하기 위해 식 3을 사용하여 각 화합물의 회복 (물질 수지)을 확인하십시오.
    참고 : 복구 속도는 일반적으로 70 %에서 130 % 사이입니다. 15 명
    figure-protocol-3

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결과

이 프로토콜을 사용하여 우리는 침투성 caseum에서 예상되는 효율성을 위해 수백 가지의 결핵 약물 개발 화합물을 테스트했습니다. 그림 1 은 RED 분석의 기본 개념을 시각화합니다. RED 인서트의 투석 막은 언 바운드 소분자가 기증자 우물에서 수용기 우물로 확산되도록하여 결국 두 구획 사이의 평형을 이룹니다. 단백질이나 지질과 같은 거대 분자에 결합 된 작은 분자는 기증자에 잘 포획됩니다. 두 구획의 시료를 정량 분석하면 caseum 또는 대리 기질의 각 작은 분자의 결합되지 않은 분율 ( f u )을 계산할 수 있습니다. 이 분획은 생체 내 caseum의 약물 침투와 직접적인 상관 관계가있는 것으로 나타났습니다. 7 그림 2는 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 질량 분석법metry 화상...

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토론

결핵에 감염된 환자의 폐 괴사 성 병변 및 충치는 약물 치료에 저항력이있는 세균 집단을 포함합니다. 이러한 구조물의 핵심은 세포 외 환경에서 이러한 잔류 물을 보유하는 데 특히 책임이있다. 이러한 원격 위치에 항균제를 유리하게 분배하는 것이 결핵약 효능의 중요한 결정 인자로 여겨진다. 이 프로토콜의 유효성을 검증하기 전에, 소변 병변에서 약물 발견 화합물의 분포를 예측할 수 있는 in vitro 기술은 존재하지 않았다. 결과적으로,이 중점 병변에서의 약물 분포 평가는 동물 감염 모델, 병변 중심 약동학 연구 및 MALDI 질량 분석 이미징 기술에 크게 의존했다. 5 , 17

시험 관내 분석에서 그는다시는 생체 내 약물 동력학 연구의 번거 로움과 비용없이 결핵 병변에 약물 침투를 예측하는 빠르고 효과적인 방법입니다. 프로토콜은...

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공개 사항

더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

Bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid 및 tedizolid를 제공 한 Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X 및 Trius Therapeutics에 감사드립니다. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li 및 Danielle Weiner는 MALDI 분석, 생물 분석 방법, caseum 대리인의 준비, 화학 합성 및 토끼 caseum의 분리에 대한 지원을 제공했습니다. 이 작업은 Bill and Melinda Gates Foundation, # OPP1044966 및 OPP1024050 보너스, V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072 및 Bill and Melinda Gates Foundation의 공동 기금 및 우수 센터를위한 Wellcome Trust의 기금으로 수행되었습니다 개발 도상 세계의 질병에 대한 리드 최적화를 위해 P. Wyatt에게

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
뉴질랜드 흰 토끼
Mycobacterium tuberculosisBEI 리소스NR-13647 
Ketathesia (케타민) 100 mg/mL C3NHenry Schein Animal Health56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mLHenry Schein Animal Health33198
Euthasol (펜토바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨) 용액 Virbac710101
THP-1 단핵 세포주ATCCATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)Fisher ScientificT-3400-175
RPMI 1640 매체 w/o 글루타민Fisher ScientificMT-15-040-CV
Hyclone 태아 소 혈청, 감마 방사선 조사 Fisher ScientificSH3091003IR
Hyclone L-글루타민, 200mMFisher ScientificSH3003401
Cellstar TC 접시, 145mm x 20mm, 통풍Fisher ScientificT-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Fisher ScientificBP685-1
에틸렌디아민테트라아세트산SigmaE6758
올레산 Fisher ScientificICN15178101
Pierce RED 장치 재사용 가능한 베이스 플레이트Fisher ScientificPI-89811
Pierce RED 장치 삽입물, 50개/박스 Fisher ScientificPI-89809
Pierce RED 삽입 제거 도구 Fisher Scientific89812
접착 플레이트 씰Fisher Scientific08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) 라이프 테크놀로지 10010-049
DMSO시그마472301
아세토니트릴시그마34998
메탄올시그마34860
베라파밀 하이드로클로라이드시그마V4629
디클로페낙 나트륨 염시그마93484
트리판 블루 솔루션, 0.4%Fisher Scientific15-250-061
에탄올, 200 proofFisher Scientific04-355-451
2010 Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
비드 밀 균질화 액세서리, 금속 벌크 비즈Fisher Scientific15-340-158
484R 코발트 60 조사기JL Shepard7810-484-1
INCYTO  C-Chip 일회용 혈구계Fisher Scientific22-600-100
정립 광 현미경LeicaDM1000
이진 액체 크로마토그래피 시스템Agilent1260다중 구성
질량 분석기AB Sciex4000
Covance-HN878

참고문헌

  1. Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
  2. Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
  3. Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
  4. Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
  5. Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
  6. Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
  7. Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
  8. Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
  9. Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
  10. Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
  11. Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
  12. Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
  13. Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
  14. Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
  15. Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
  16. Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
  17. Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).

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