JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

Summary

여기에서 우리는 초파리 유충의 차가운 통각을 연구하는 새로운 분석을 보여줍니다. 이 분석은 초점 유해 냉 자극을인가 할 수있는 맞춤식 펠티에 프로브를 이용하여 정량화하고 초기 특정 행동을 초래한다. 이 기술은 차가운 통각의 추가 세포 및 분자 해부를 허용합니다.

Abstract

어떻게 생물 감지하고 여전히 제대로 이해 유해 온도에 반응한다. 또한, 말초 신경 병증 또는 손상 유발 과민성 발생한 환자와 같은 감각 기계 과민성, 기본 메커니즘은 잘 특징 아니다. 유 전적으로 취급 용이 초파리 모델은, 유해한 열 감지에 필요한 세포의 유전자를 연구하는 데 사용 된 이는 관심의 여러 보존 유전자를 산출했다. 약간은 세포 및 유해 차가운 ​​감지에 대한 중요한 수용체에 대해 그러나 알려져있다. 초파리는 낮은 온도 (≤10 ° C)에 장시간 노출 살아남을하지 않으며, 유해 차가운 자극을가 감지 방법 행동 선호도 분석에 따뜻한 온도를 선호 멋진 피하고 가능한 피할 것,하지만 최근 조사되었다.

여기에 우리가 설명하고의 첫 번째 유해 감기 (≤10 ° C) 행동 분석의 특징초파리. 이 도구 및 분석을 사용하여, 우리는 질적 및 양적 차가운 침해 행동을 평가하는 방법 조사관을 보여줍니다. 이 질병, 부상 또는 감작의 맥락에서 아마도 일반 / 건강한 문화 조건에서 수행, 또는 할 수 있습니다. 또한,이 분석은 thermosensation 통증 또는 통각 과민에 영향을 줄 수있는 원하는 유전자형 선정 유충에 적용될 수있다. 고통이 더 가능성이 척추 동물을 포함한 다른 종, 통증 프로세스의 중요한 이해를 수집합니다 것입니다 열 통각을 연구하기 위해이 분석을 사용하여, 고도의 보존 과정 감안할.

Introduction

초파리는 새로운 보존 유전자와 복잡한 행동을 기초 신경 회로의 식별을위한 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 파리 정교한 유전 툴킷 통각 ^{5, 6, 7의} 세포 및 분자 염기 해부 정확한 유전 적 신경 조작 ^1,2,3,4 허용 간략화 신경계를 제공한다. ^유충 부드러운 촉감 ^{8, 9, 10,} 유해한 열 ^{11, 12, 13} 및 유해 자극 ^(4)의 기계적 감각에 대한 행동 분석 주어진 이러한 분석에 특히 유용 </sup> ^11은 이미 설립 투명 유충 표피는 표피와 하부 감각 뉴런의 라이브 영상 또는 고정을 허용하고있다. 최근 유해 감기위한 분석은 또한 우리는 여기에서 더 상세히 설명 ⁷ 개발되었다.

벌금, 원뿔 스쳐 차가운 프로브를 사용하여, 우리는 표시하거나 거친 기계적 또는 고온 자극 ^{(7), (8) 후, 11} 초파리 애벌레 전시 부드러운 터치 다음 정상 운동 동안 관찰 행동, 구별 차가운 별 반응 일련의 행동, 그 . 차가운 특정 행동은 강력한 전신 수축 (CT), U 자형 (미국)에 후방 세그먼트 (PR) 및 전방의 동시 인상 및 후방 세그먼트의 45-90º 인상을 포함한다. 이러한 행동의 유병률은 감소 온도 만의 각 피크 증가살짝 다른 추운 온도. 최근 연구는 CT의 응답이 유해 열이나 강한 기계적 자극 ^(7)에 응답 것보다 다른 주변 감각 신경에 의해 매개되는 것을 의미한다.

많은 척추 통각 수용기 같은 초파리 다수의 돌기 (MD) 말초 감각 신경 세포는 표피 ⁽¹⁾ 위에 arborize 수지상 복합 구조를 갖는다. MD 뉴런 복부 신경 코드 ^(14)에 자신의 축삭을 투영 모든 유충 바디 부분에 존재한다. MD 감각 신경 돌기의 형태에 기초하여 네 개의 서로 다른 클래스 (I-IV)로 분리하고, 감각 기능 ^{4, 9, 10, 15, 16, 17을} 변화 하였다. 클래스 IV 뉴런은 유충 횡 체 롤 응답 요구되지만고온 또는 열악한 기계적 자극 ⁴ 클래스 III 뉴런 부드러운 터치 응답 ^{(9), (10)에} 필요한 단지 초기 활성화되지 않고, 또한 냉간 유발 행동 반응 ^(7)에 요구한다. 모두 클래스 III 및 IV 클래스 신경 자극 ^{9, 10, 17, 19 7, 11, 18,} 유해하고 비에 유해한 행동 반응을 촉진하기 위해 이산 일시적 수용체 전위 (TRP) 채널을 사용한다. 또한, 애벌레 통각은 ²⁰ 세포 및 행동 수준 ^{12, 21,} 다음과 같은 부상을 민감합니다.

여기에 설명 된 분석은 허용 quantificatio보통, 하나의 잠재적 인 N은 상온 (18-22 ºC)에 유해 냉기 (10 ≤ ºC)까지 저온, 무해한 차가운 (11-17 ºC)로 행동 반응을 변경. 이 분석에 사용되는 저온 직접 클래스 III 감각 뉴런을 활성화하고 질적 양적 ^7을 분석 할 강력한 재현성 칼슘 증가 냉간 유발 행동 반응을 유도 할 수있다. 이 분석은 초기 통각, 통각 과민 또는 통각 소성 영향 유전 적 및 환경 두 인자를 결정하는 다양한 환경 조건에 노출 된 유충 (변경 영양, 부상되는 약물)에뿐만 아니라 거의 모든 유전형의 유충에 적용될 수있다. thermosensation 여러 종에 걸쳐 유비쿼터스 것을 감안할 때,이 분석은 통각의 연구를위한 유용한 도구를 제공하며, 새로운 유전자 대상 또는 개선 신경 세포의 상호 작용을 발견 할 수있다척추 동물의 통각에 대한 우리의 이해.

맞춤 제작 된 콜드 프로브 (콜드 프로브, 소재의 표 참조)를 통한 열 전도 알루미늄 샤프트와 원추형 팁을 냉각시키는 펠티에 소자를 제어 폐쇄 루프 온도를 이용한다. 서미스터는 알루미늄 원추형 팁 내부에 내장되고, 제어부의 실시간 온도를보고한다. 히트 싱크 팬 (열 제어 유닛 자재 표 참조)를 얻을 수있는 펠티에 효과의 열 부하 (QC)이므로 (22-0 °의 C)의 바람직한 온도 범위를 조절하는 열전 모듈에 부착된다. 콜드 프로브 팁의 유해 냉 자극 전후방 단부로부터 등거리 세그먼트 (들), 등쪽 정중선에 손으로 적용되는 유충 (약 A4 세그먼트,도 1a 참조). 차가운 자극에 대응하여, 유충은 일반적으로 10 초 컷오프에서 세 냉간 유발 행동 중 하나를 생산 : 몸 전체를수축 (CT), U 자형 (US) 또는 (결과 설명) 후부 세그먼트 (PR)의 인상에 전방 및 후방 세그먼트의 45-90º 인상. 이러한 행동의 아무도는 정상적인 연동 운동이나 먹이를 찾아 다니는 행동 중에 수행되지 않습니다. 이러한 동작은 부드러운 촉감 응답 및 높은 온도 또는 유해한 기계적 자극에 대한 반응 혐오 압연에서 구별된다.

Protocol

애벌레의 제조 1

1. 25 ºC 배양기에서 주식이나 유전 십자가를 올립니다.
   1. 십자가를 배양하는 경우, 20 ~ 25 명 처녀 여성과 일반 옥수수 가루 플라이 미디어를 포함하는 바이알 당 15 ~ 20 명의 남성을 사용합니다. 여성은 음식의 새로운 유리 병에 전송하기 전에 약 48 시간 동안 알을 낳기 할 수 있습니다.
2. 4-5 일 분 계란 바닥 후, 부드럽게 약해서 식품 및 유충에 물 스트림을 분출하여 원하는 유전자형 ^{3 차} 령 유충을 수집하고, 중소 깨끗한 페트리 접시에 내용물을 부어 (60mm X 15 mm).
3. 다음 부드럽게 테스트되는 큰 "방황 ^{3 차} 령"또는 작은 병약 유충 크기 배제하여 집게 나 붓 유충 정렬. 원하지 않는 유전자 마커 또는 분산을 포함 폐기 유충.
4. 실험자 전에 "블라인드"가 될 수 있도록 분류 유충이 배치됩니다 동료 실험실 구성원 레이블 요리 또는 용기를 가지고perimental 조건 또는 해당되는 경우 유충의 유전자형. 실험자들은 실험실 부재에 의해 생성 된 키를 이용하여 상기 실험 후 수집 된 데이터를 복호화하여 라벨을 적용 할 수있다.
5. scoopula를 사용하여 (35mm X 10mm 또는 60mm X 15mm)을 실온에서 물과 깨끗한 라벨 페트리 접시 가득 반쯤로 신선 식품의 다임 크기 양 옮긴다.
6. 집게 또는 붓을 사용하여 조심스럽게 음식에 정렬 된 유충을 이동 (시험이 20 분을 예상하는 경우 기아 또는 탈수를 방지하기 위해).

2. 콜드 프로브 분석

1. 이 원하는 온도로 냉각 할 수있는 몇 분을 허용 차가운 프로브 유닛을 켭니다. 낮은 온도로 설정하는 경우, 결로 가능성이 프로브를 따라 형성됩니다.
2. 실험실로 초과 수분을 닦아은 유충에 적용하기 전에 닦아주십시오. 즉시 사용, 장소는 모두 보온에 프로브에 뚜껑을 절연하고 깨끗한 팁을 유지하고 손상을 방지하기 위해하지 않는 경우.
3. 어두운 가동 비닐의 박편 상으로 ^중간의 제 ³ 령 유충을 배치 명 시야 현미경 (일반적으로, 노트북 바인더로부터 절단 작은 조각을 사용). 콘트라스트 시각화하고, 프로브와 올바르게 정렬 건드리지 않고 유충을 이동시키는 검은 비닐 AIDS.
4. 대비를 너무 빨리 건조되는 유충을 방지하기 위해 현미경 (자재 표 참조)과 중간 휘도 (50-75 %의 최대 휘도)로 광 유닛 (자재 표 참조)를 조정한다.
5. 그들은 결과를 혼동 수 있기 때문에 첫 정상 연동 운동을 나타내지 않는 유충을 폐기하십시오. 물을 페트리 접시 달리 유충 정상적인 운동을 억제 비닐로 버티로부터 유충 습윤되어야한다. 물은 유충의 주위에 웅덩이 안된다.
6. 고전으로 유충을 이동 비닐을 사용하여, 전후 몸통 축에 90도 각도로 충 향해 손에 프로브를 사전RECT 위치 (도 1A 참조).
7. 동양은 프로브의 팁은 부드럽게 프로브 현미경 단계에 약 45도 각도 유충의 중간 지느러미 표면을 가로 질러 누워있다.
8. 프로브 접촉시, 실험실 타이머를 시작합니다. 계속 전진 또는 후진시키면서 약간 애벌레 표피의 표면을 들여 충분한 하향 압력을 적용한다.
9. 최대 10 초 동안 또는 냉간 유발 행동 반응이 관찰 될 때까지 자리에 프로브를 잡고 – 둘 중 먼저 발생. 그런 다음 프로브를 제거합니다.
10. 관찰 된 행동 응답 및 응답 대기 시간을 기록합니다. 10 초 내에 응답하지 않는 애벌레는 "비 반응자"로 간주됩니다. 지연은 또한 대응 대해 응답 내성 / 진폭의 변화를 측정하는데 사용될 수있다.
11. 유충을 취소하고 다음을 준비합니다.
12. 시험 유충의 원하는 개수 (N 3 개 세트에 도달 할 때까지 반복 단계 2.3-2.11 = 20-40 유충 U이었다) 여기에 나오지도.

Representative Results

Discussion

여기에 설명 된 분석은 정 성적 및 정량적으로 여러 유전 배경, 환경 적 영향들, 및 / 또는 손상을 유도 조건에서 통각 유충 또는 통각 과민을 평가하는데 사용될 수있다. 이 분석은이 도구 냉 자극의 초점 응용이 가능하기 때문에 하나의 특히 저온에 응답 말초 감각 뉴런의 서브셋의 기능을 평가할 수있다. 흥미롭게도,이 추위 유발 행동은 열 ^{(7), (11)에} 의해 활성화보다 감각 뉴런의 다른 클래스를 활용하는 것,하지만 전체 열 통각 회로는 아직 완전히 이해되지 않습니다. 다른 많은 지역의 침해 분석과 마찬가지로이 분석은 추위 프로브의 응용 프로그램에 따라 사용자 사이에 약간의 변화에 ​​따라 달라질 수 있습니다. 그러나, (머리와 꼬리를 피할 수) 중반 몸에 감기 프로브의 특정 위치는 significa이 표시되지 않습니다차가운 반응 ⁷ NT에 미치는 영향. 연습과 반복이 간 사용자의 변동성을 최소화 할 수 있습니다.

우리는 이전에 초기 프로브 분석법 특징 및 CT ^{7 응답을} 생성하는데 필요한 특정 냉 감각 뉴런 응답 채널을보고 하였다. 여기에서 우리는 더 분석을위한 가장 최적의 시간 창을 결정하는 데 시간이 더 컷 – 오프 포인트에서 데이터를 분석, 정량화 및 다른 침해 조치로 분석 할 수있는 방법을 지연 데이터의 특징. 우리는 감기 유발 반응의 대부분이 10 초는 경제적이고 효과적 차단하고, 자극 응용 프로그램 10 초 이내에 발생하는 것으로 나타났다. 또한, 서로 다른 온도에서 서로 다른 반응의 견고성을 충분히 감사하기 위해, 여기에 다 같이 서로 다른 감기 유발 행동 서로 다른 온도에서의 피크는, 이러한 응답의 대기 시간이 개별적으로 분석하는 것이 중요합니다 주어진. 우리는 또한 행동 인 항문에 따라 보여yzed, 어떻게 유충의 크기 감기 유발 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 모든 행동 실험에서 일관성있는 애벌레 크기를 유지하는 것은 필요합니다. 마지막으로, 우리는이 분석은, 유충에 차가운 자극의 위치에 따라 다양하게 나타납니다 감기 통각에 관여 감각 뉴런의 세트를 식별하거나 배제하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

지금 기준 차가운 통각 분석이 존재하는지, 우리는 고통의 생물학에 대한 더 복잡한 질문을 손상 및 / 또는 과민성의 방법을 통합 할 수 있습니다. 예를 들면, 악의 또는 유해한 열 측방 체 롤 응답은 특정 유전자 매개체 및 TRP 채널 ^{12, 20, 21 일을} 필요로 표피에 UV 손상 후 증감되는 것이 알려져있다. 감작 된 차가운 반응에 표피 결과와 유사한 유전 적 경로 여부 유사한 UV 손상이 참여 여부는 알 수 없습니다. 마찬가지로, <em> 초파리 쉽게 상처 ^{(23), (24)을} 유도 또는 통각 신경 및 회로는 형태 학적 및 유전자 변화를 심문하는 데 사용할 수있는 의약품 ^{(25), (26)에} 노출시키기 위해 조작된다.

이 분석을 이용하여 고려되어야 통계적 테스트가 있습니다. 우리가 가장 일반적으로 사용되는 통계적 테스트는 다중 비교를위한 페로 니 보정, 또는 카이 제곱 테스트와 피셔의 정확한 테스트입니다. (- 3H,도 4G – 4H 및도 5b도 3e에 IE) 막대 그래프 형태로 평균 대응 비교할 때 이러한 테스트가 사용된다. 선 그래프의 형태로 축적 지연을 비교를 위해, 우리는 긴 랭크 (벽난로-콕스) 시험 ^{27, 28} 및 Gehan-Breslow – 윌 콕슨 사용둘 다 전형적으로 생존 분포를 비교하기 위해 사용되는 시험 ^{29, 30.} 우리는 반복 세트 사이 평균의 표준 오차의 계산 할 수 있도록 각 유전자형 / 실험 20 ~ 40 애벌레의 3 개 세트 제안한다.

결론적으로, 이러한 분석은 유해 냉 자극의 정확한 적용을 허용하고 초파리 유충의 결과 행동 반응을 특징으로하고있다. 가 여전히 많은 우리는 파리 또는 척추 동물의 통각에 필요한 세포 및 유전자에 대해 알고하지 않습니다. 이 분석을 통해, 하나는, 기준 통각에 대한 중요한 보존 유전자 신속하게 선별 할 수있는 매우 다루기 쉬운 초파리 시스템을 활용 통각 회로를 식별하고, 통각 과민을 유발하는 조직 손상 후 발생하는 세포 및 유전자 변화를 평가할 수 있습니다. 궁극적으로,이 분석은 시스템에 통증이 생물학에 대한 고통 필드 이득 귀중한 정보를 도움이됩니다쉽게 더 복잡한 동물 모델에 적용 할 수 있습니다.

Materials

Cold Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Part numbers and construction details can be provided on request
Thermal Control Unit	TE Technology	Custom Built enclosure	Part numbers and construction details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries.	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott North America, Inc.	Schott A08575
Forceps	FST	FS-1670	Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae
Paintbrush	Dick Blick Art Materials	06762-1002	Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use.
35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish	Falcon	351008
60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish	Falcon	351007
Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches)			Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe
Fisherbrand Scoopula Spatula	Fisher Scientific	14-357Q	Used to move food
Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture