Method Article

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

DOI:

10.3791/55575

⸱

April 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 2Inflammation Research Center, VIB, 3Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, 4Cancer Research Institute Ghent (CRIG), 5Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 6Helmholtz Center for Infection Research, 7Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 배아 또는 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 유전자 공학은 주어진 단백질의 기능 연구를 위해 수 있습니다. 단백질은 세포 골격을 이루는 종종 번역 후 변형에 의해 영향을받을 수있는 다수의 기능 영역들로 구성된다. 조건부 또는 구성 적 녹아웃 (KO) 마우스에서 전체 단백질의 고갈이 고려 기능적 다양성 및 규제를받지 않는다. MESC 라인 FLPe 재조합 매개 카세트 교환 (RMCE)을위한 도킹 사이트가 ROSA26 (R26)의 궤적 내에 삽입되는 유도 마우스 모델은 이전에보고되었다. 여기, 우리는 멀티 도메인 단백질의 서로 다른 기능의 분자 해부를 허용하는 구조 기능 접근에보고한다. 이를 위해, RMCE 호환 마우스는 KO 마우스를 교차해야하고 RMCE 호환 KO의 mESCs는 격리해야합니다. 다음으로, 추정 구조 구조의 패널의 RMCE targeti 통해 R26 로커스에 도입 될 수있다NG. 후보 구조 cDNA를 쉽게 재조합 복제를 사용하여 대상 벡터의 RMCE 사이트 사이에 삽입 할 수 있습니다. 다음에, 코 mESCs는 FLPe 재조합 발현 플라스미드와 함께 타겟팅 벡터로 형질 감염된다. RMCE는 ROSA26 도킹 사이트에서 프로모터 이하 네오 마이신 - 내성 유전자를 재 활성화하고 정확한 표적화 이벤트를 선택할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 100 %에 가까운 높은 타겟팅 효율이 반 고 스루풋 추정 방식 다중 구조 구조의 삽입을 허용 얻어진다. 마지막으로, R26 기반 구조 구조의 다수는 부모 KO의 mESCs에서 관찰 된 표현형을 구출하기 위해 자신의 능력을 테스트 할 수 있습니다. 우리는 P120의 카테닌 (p120ctn) 표현형 판독으로 배아 체 (교환 사채)에서 내배엽 분화를 사용 KO의 mESCs의 원리 증명 구조 기능 연구를 제시한다. 이러한 접근 방식은 중요한 영역의 식별, 추정 다운 스트림 경로, 질병 관련 지점을 수 있습니다주어진 단백질 KO의 표현형의 기초가 돌연변이.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

포유류의 게놈은 약 20,000 단백질 코딩 유전자를 포함하는 것으로 추정된다. 스 플라이 싱 및 번역 후 변형은 상기 단백질 레퍼토리를 증가시킨다. 단백질은 모듈 식 구조 (1)을 가지고 있고 종종 서로 다른 단백질 복합체에 자신의 모집 및 여러 세포 과정 2에 참여를 허용 여러 상호 작용 도메인을 포함한다. 한 가지 예는 p120ctn라는 다기능 단백질이다. p120ctn Ctnnd1는 유전자에 의해 코딩 및 N 말단 및 C 말단 영역에 의해 측면 큰 중앙 딜 반복 영역으로 구성된다. p120ctn의 딜 도메인이 세포 - 세포 부착에 관여하는 고전 cadherins의 고도로 보존 된 막 근접 영역에 결합 할뿐만 아니라, 전사 리프레 가이 소 (海)에 결합한다. p120ctn의 N- 말단 도메인은 다른 키나제, 포스파타제, 작은 RhoGTPases, 및 미세 소관 - 연관된 페이지와 상호 작용roteins 3. 흥미롭게도, 스 플라이 싱의 결과, p120ctn 이성체 네 대체 개시 코돈 (4)로부터 생성 될 수있다. 이 개시 코돈 '가장 -5- 번역 및 전장 N 말단 부분을 포함한다으로 p120ctn 이....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스에 대한 모든 실험은, 기관, 국가 및 유럽의 동물 규정에 따라 실시 하였다.

RMCE 호환 KO의 mESCs 1. 분리

  1. 이러한 ROSALUC 마우스 10 ROSA26-IPSC 마우스 (21) 등 RMCE 호환 마우스와 이형 KO 쥐 품종. 두 RMCE 호환 마우스는 혼합 129 / C57BL6 / 스위스 배경에 유지되었다.
    참고 : 이형 KO 마우스를 교차은 동형 접합 KO 마우스의 배아 치사를 극복하는 것이 좋습니다.
  2. R26의 궤적 (12)의 RMCE 카세트를 포함하는 이형 KO 마우스를 선택 PCR을 사용합니다.
  3. 이형 KO 마우스와 RMCE 호환, 이형 KO 마우스 새끼를 낳 및 RMCE 호환, 동형 접합 KO의 배반포을 격리 할 것.
    1. 저녁 시간 교배를 설정하고 교미가 다음 날 아침에 플러그를 확인하십시오.
      참고 : 플러그는 남성의 응고 및 기공 땀샘에서 응고 된 분비물로 만들어진다.이 플러그는 여성의 질을 작성하고 8 지속 - 번식 후 24 시간. 전원 사용 여성은 0.5 DPC (일 포스트 교미) 배아를 운반하는 것으로 간주됩니다.
      1. ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RMCE 호환 KO MESC 라인을 분리하는 절차는 그림 2에 도시되어있다. 두 연속 breedings는 RMCE 호환 KO의 배반포를 얻기 위해 필요합니다. 첫째, 이형 KO 마우스는 RMCE 호환, 이형 KO 마우스를 얻기 위해 RMCE 호환 마우스와 교차된다. 이러한 마우스는 RMCE 호환 3.5 DPC, 동형 KO의 포배를 얻었다 다른 이형 KO 마우스와 교배 시간 제한 사용된다. 멘델의 유전 법칙에 의해 예측 된 바와 같은 배아를 획득하는 확률은, 팔의 하나이다. 따라서, 효율적인 MESC 분리 프로토콜이 필요합니다. pluripotin 기반 또는 2I 기반 프로토콜을 사용하여, 각각 약 94 % (N = 114 포배) 및 64 % (N = 22 포배)의 효율과 함께, RMCE 호환 p120ctn KO의 mESCs 포함 mESCs 라인을 분리 할 수있다 12,

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 MESC 분리 방법은 사용하기 쉬운 및 배반포의 미세 같은 고급 기술이나 장비를 필요로하지 않습니다. 따라서,이 기술은 과학계의 큰 비율에 액세스 할 수 있습니다. 기본 세포 배양 경험을 가진 사람은 ICM의의 outgrowths을 전파하고 mESCs 라인을 설정할 수 있습니다. 그러나 배반포의 세척 및 처리는 연습이 필요합니다. 구강 내에 피펫 포배를 전송하는 데 사용되는 마이크로 피펫, 마이크로 피펫 홀더, 튜브, 흡입기 및 마우스 피스 (28)로 구성된다. 마이크로 피펫을 몇 초 동안 파스퇴르 피펫의 최고의 부분을 가열 화염으로부터 피펫을 제거 양단 당겨 맞춤 제작 될 수있다. (- 200 내지 100㎛) 배반포보다 약간 큰 직경을 선택 바늘. 바늘 증류수 (3X)과의 EtOH (3x)로 세척 후에 재사용 될 수있다. 우리의 경험에 의하면, pluripotin 기반 MESC 분리의 효율은 2 이상을 비교한다프로토콜 12 나는 기반........

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 우수한 기술 지원을 Jinke D' Hont, 프레 더 리크 반 Rockeghem, 나탈리 Farla, 켈리 레메어 및 Riet 드 RYCKE 감사합니다. 우리는 또한 전문가의 도움에 대한 염증 연구 센터의 Bioimaging 핵심 시설에서 EEF Parthoens, Evelien 반 Hamme, 아만다 Goncalves은 감사합니다. 우리는 가치있는 토론에 대한 우리의 연구 그룹의 구성원을 인정합니다. 이 작품은 벨기에의 과학 정책에 의해 지원되었다 (Belspo Interuniversity 명소 폴란드 - 상 IAP VII-07 DevRepair, https://devrepair.be) 퀸 엘리자베스 의료 재단, 벨기에 (GSKE 2,008에서 2,010 사이에 의해;에 http : // www가 ) - gske.be을 .fmre하고, 겐트 대학, 벨기에 (http://www.ugent.be/en/ghentuniv)의 공동의 연구 작업 (GOA 01G01908)에 의해. SG는 플랑드르 연구 기금 (FWO-V)의 박사후 연구원이다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ROSALUC 생쥐사내냉동 정자 사용 가능
R26-iPSC 사내냉동 정자 요청 시 사용 가능
혈관 프로브Fine Science Tools10160-13교미 플러그
M2 매체Sigma-AldrichM7167분취량을 만들고 -20°C에 보관; C
세밀한 집게 (Dumont #5 표준 팁 학생용 집게)Fine Science Tools11251-10사용 전에 70% EtOH로 스프레이 (고압멸균 금지)
23 G 바늘Fine-ject8697
1-mL 주사기Soft-ject6680
60-mm 세균 등급 플레이트 (플러싱용) GosselinBB60-01
집에서구강 피펫토론 참조
마우스 배아 섬유아세포(MEFs, TgN(DR4)1 Jae 균주)ATTCSCRC-1045
TgN(DR4)1 Jae 마우스The Jackson Laboratory3208
Mitomycin C Sigma-AldrichM0503
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco14190-094
Tg(DR4)1Jae/J 마우스4개의 약물 선택 가능 유전자와 DR4 MEFS를 포함하는 JAX 3208 마우스는 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신 및 6-티오구아닌에 대한 내성을 부여합니다
0.1% 젤라틴시그마-알드리치G13930.5g을 500mL 증류수에 녹인 후 오토클레이브를 사용하여 4°C에서 보관합니다.
트립신 (0.25%) Gibco25200-056
2 &뮤; M 플루리포틴케이맨 화학10009557
pRMCE-DV1BCCM/LMBP 컬렉션 LMBP 08870공개 BCCM/LMBP 컬렉션에서 사용 가능(http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1BCCM/LMBP 컬렉션 BCCM/LMBP 컬렉션에서 사용 가능한LMBP 08195
pCAG-FlpE-IRES-퓨로-pA Addgene20733
열 충격 유능 DH5α 박테리아 집에서
Gateway pDONR221 벡터Thermo Fisher12536-017카나마이신 저항성 유전자를 포함하고
BP clonase II 믹스Thermo Fisher11789-020
LR clonase II 믹스Thermo Fisher11791-020 
루리아 육수 (LB) 
암피실린 
Applied Biosystems 3730XL DNA 분석기Thermo Fisher3730XL
G418Thermo Fisher11811-023
Lipofectamine 2000 transfection 시약Thermo Fisher11668027
Lipofectamine LTX transfection 시약Thermo Fisher15338100
Effectene transfection 시약Qiagen301425
GATEWAY pENTR 1A 벡터Thermo FisherA10462재조합 호환 벡터
마우스 단클론 항-p120ctn 항체BD Transduction Laboratories610134
마우스 단클론 항-Ecadherin 항체BD Transduction Laboratories610181
General equipment
멸균 해부 도구자궁 해부를 위한 세밀한 가위와 펜치
멸균 피펫: 5 mL, 10 mL 및 25 mL
15-mL 및 50-mL 원뿔형 원심분리 튜브
96-웰 배양판, V자형 바닥 및 평평한 바닥) 
문화 접시 : 24 웰, 12 웰 및 6 웰
멀티 채널 피펫 (피펫 30, 50, 100 및 200 μ 엘) 
멸균 다중 채널 저장소
층류 공기 흐름
37 °에서 인큐베이터에 대한 접근; 5% CO2
반전 현미경
벤치탑 원심분리기
투과광이 있는 실체 현미경에 접근 
Culture media
MEF Medium4°C에 보관; C; 37 °에서 30분 따뜻하게; C
Dulbecco를 사용하기 전에 s 변형 된 독수리' s medium (DMEM)Gibco41965-062
10% 소 태아 혈청 (FBS)Sigma-AldrichF-7524
L-glutamine (2 mM)Gibco25030-024 
나트륨 피루베이트  (0.4 밀리미터)깁코11360-039 
페니실린 (100 U/mL)Gibco15140-122 
스트렙토마이신(100 µ g/mL)Gibco15140-122 
SR 기반 mESC 매체4°에 저장됨; C; 37 °에서 30분 따뜻하게; C 사용 전
DMEM/F12Gibco31330-0381:1 비율로 혼합
15% 녹아웃 세럼 대체품 (SR)Gibco10828– 028
L-글루타민 (2 mM)Gibco25030-024 
0.1 mM 비필수 아미노산 Gibco11140-050
페니실린 (100 U/mL)Gibco15140-122 
스트렙토마이신(100 µ g/mL)Gibco15140-122 
&베타;-메르캅토에탄올(0.1mM) 시그마-알드리치M 3148 
2,000 U/mL 재조합 마우스 LIF (IRC/VIB 단백질 서비스 시설)
FBS 기반 mESC 배지 (SR 기반 mESC 배지와 유사)4°C에 보관; C; 30°C에서 37분 따뜻하게; C 사용 전
Knockout DMEMGibco10829-018 
15% FBSHycloneSH30070.03E
Differention Medium4°C에 저장; C; 37 °에서 30분 따뜻하게; C 사용 전
Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco21980-032 
15% FBSHycloneSH30070.03E
5% CD 하이브리도마 매체(1x) 액체   깁코11279-023 
2 mM L-글루타민Gibco25030-024 
0.4 mM 1-티오글리세롤시그마-알드리치M-6145
50 & g/mL 아스코르브산Sigma-AldrichA-4544 
페니실린 (100 U/mL)Gibco15140-122 
스트렙토마이신(100 µ g/mL)Gibco15140-122 
2i
1 μ M Erk 억제제 PD0325901 축삭 Medchem축삭 1408
3 μ M Gsk3 억제제 CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
요청 시 만든칼슘 또는 마그네슘이 없는 . 공개(http://bccm.belspo.be) 만든은 있습니다. , , , 에 대한 접근에 대한 접근에 대한 접근

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F.

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