방법 논문

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

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DOI:

10.3791/55585

⸱

2017년 4월 17일

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

이 논문에서

요약

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

초록

지질 방울은 비리의 형태 형성의 추정되는 사이트로, 다른 병원균의 다양한 가장 눈에 띄게 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 복제에 중요합니다. 양적 지질 방울 프로테옴 분석에 지역화 또는 바이러스 감염과 같은 조건에서 지질 방울에서 변위 단백질을 식별 할 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 HCV 감염 다음과 같은 지질 방울 프로테옴의 변화를 특징 짓는 데 사용 된 프로토콜을 설명합니다. 우리는 세포 배양 (SILAC)에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨 사용하여 질량 분석에 의해 단백질을 정량하는 "무거운"아미노산 셀 중 하나 명 인구의 전체 프로테옴 레이블을 붙입니다. 도 1 및 저장성 완충액에 용해 기계적 : 지질 방울 분리를위한 두 개의 세포 집단 (즉, HCV 감염 / "광"아미노산 및 비감염 제어 / "무거운"아미노산 1) 혼합한다. 핵 및 세포 D를 제거한 후저속 원심 분리에 의해 ebris은 지질 방울 - 관련 단백질은 등장 완충액 세 세척 단계 다음에 두 단계 이후의 초 원심 분리에 의해 농축된다. 지질 방울 분획의 순도는 상이한 세포 내 구획을 인식하는 항체로 웨스턴 블 롯팅하여 분석한다. 지질 방울 - 관련 단백질 후 쿠마시 염색 하였다 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리된다. 트립신 소화 후에, 펩티드는 액체 크로마토 그래피 - 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS / MS)에 의해 정량화된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 프로 또는 바이러스 호스트 요소를 나타낼 수 HCV 감염시 지질 방울에 모집 단백질을 확인했다. 우리의 방법은 병원체 감염, 환경 스트레스, 약물 치료와 같은 다른 세포 및 배양 조건의 종류에 적용될 수있다.

서론

지질 방울 높은 중성 지질 코어 이루어지는 동적 세포질 (핵) 세포 소기관이다 (중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)) 임베디드 단백질 1 인지질 단층에 의해 둘러싸인. 모든 종류의 세포는 지질 방울을 생산하지만, 크기, 지질 성분, 단백질 장식 다양합니다. 지질 소적 에너지와 막 전구체 저수지 또는 단백질 침착 물로서 작용 등 다양한 기능을 수행. 또한, 지질의 흡수를 통해, 그들은 신호 분자로서 세포에서 리포 독성 (lipotoxicity), 박리 보호 지질 및 단백질 분해하고 소포체 (ER) 스트레스 반응에 관여하는 2. 따라서, 단백질의 호스트 지질 방울에 결합하여 다른 세포 소기관과 함께 자신의 생성, 파괴, 인신 매매, 및 상호 작용을 제어합니다. 그 중 (PLIN1-5) 선의의 지질 방울 결합 단백질의 perilipin 가족F "> 3.

지질 생합성 액적 가능성 중성 지질 렌즈 최근 효모 4 좋게 가시화하는 처리를 형성 ER 상주 효소 막 이중층 내에 축적 중성 지질 합성을 촉매 소포체에서 시작한다. 굽힘 막과 높은 포스 폰산 및 디아 실 글리세롤의 수준은 다음 지질 액적 생성 (5)에 필요한 코어 중성 지질 및 인지질 차폐 동시로 합성 인지질 생합성에 관여하는 단백질을 유도하는 것으로 생각된다. 응급실에있는 횡단 도메인을 품고 효소는이 과정을 촉진. 큰 지질 방울에 확장은 양친 매성 나선 항구 따라서 지질 방울에 ER에서 여행 할 수 지질 합성 효소의 다른 클래스의 활동을 필요로한다. 지질 방울로부터 지질의 동원은 triglycerid의 지역의 활성화를 통해 발생E 및 디아 실 글리세롤 리파제는 트리글리세리드 지방 분해 효소 (ATGL) 및 호르몬 민감성 리파아제 (HSL) 또는 다량 및 microlipophagy autophagic 또는 상이한 경로에 의해 자식 작용은 6 매개 샤페론. 지질 방울 및 ER (베타 - 산화 및 지질 합성) 같은 미토콘드리아와 같은 다른 세포 소기관과 상호 작용하지만, (지질 합성과 단백질 밀수)도 리 소솜, 엔도 솜 및 세포 내 박테리아 (7)에 의해 유도 된 액포로. 실제로 박테리아, 바이러스, 심지어 기생충은 그들 HCV (8) 사이에 복제 및 지속성에 대한 지질 방울을 대상.

HCV 감염은 9 학년 당 약 50 만 명이 사망를 차지, 전 세계적으로 간 관련 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. HCV 감염의 진정한 수를 알 수 있지만, 최근의 추정치는 130 것을 제안 - 150,000,000명이 만성적으로 감염된다. 어떤 VACCIN 없습니다전자는 존재하지만, 최근에 승인 된 직동 항 바이러스 극적으로 표준 인터페론 기반 치료에 비해 치료 반응을 증가시킨다. 그러나 전 세계적으로 환자의 치료는 가능성으로 인해 새로운 치료제의 매우 높은 비용으로 제한됩니다. 모든 개인의 약 절반이 만성 지방간 질환 (지방간), 간세포의 지질 방울의 과도한 축적을 특징으로하는 조건을 개발 HCV에 감염. 흥미롭게도, 지질 방울도 추정되는 바이러스 성 조립 사이트 (10), (11)의 역할, HCV 복제 같은 중요한 세포 소기관을 나타났다.

HCV에 감염된 세포에서, 바이러스 단백질 코어 및 NS5A는 디아 실 글리세롤 아실 트랜스퍼 라제 1 (DGAT1)의 억제제로서, 중성 생합성에 따라 공정에서 지질 소적에 지역화 지질 방울과 후속 HCV 입자 제조 12 피킹 악영향 > 13, 14, 15. 또한, 코어 또는 NS5A 중의 지질 방울 - 결합 도메인의 돌연변이 HCV 조립체 (16), (17)을 억제. 코어 및 NS5A는 밀접하게 16 방울 지질과 관련된 세포막에, 다른 모든 바이러스 성 단백질뿐만 아니라 바이러스 성 RNA 복제 단지를 모집. 모든 바이러스 단백질의 공동 작업은 전염성 바이러스 자손 (10), (11)의 성공적인 생산을 위해 필요합니다. 구조적 단백질은 비리 온의 일부분이며, 비 구조 단백질은이 과정에 필요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 촉진한다. 흥미롭게도, 선의의 지질 방울 - 결합 단백질 PLIN3 / TIP47 모두의 HCV RNA 복제 및 비리 온 (18)의 릴리즈 19에 필요 20. 이러한 최근의 발전에도 불구하고, 특히 HCV 복제의 후기 단계 동안 바이러스 - 호스트 상호 작용의 기계적인 세부 사항은, 잘못 정의 된 남아 있고, 지질 방울의 정확한 기능은 알 수 없습니다.

여기서는 연관된 단백질의 정량적 질량 분석을위한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 지질 방울-fractionates 공동 효율적인 HCV 성숙 (21)에 요구되는 호스트 단백질로서 HCV 감염 동안 지질 방울 프로테옴의 큰 변화 및 식별 넥신 A3 알았다.

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프로토콜

세포 배양에서 아미노산으로 안정 동위 원소 표지 (SILAC) 용 매체 1의 제조

주 : 여기에서, SILAC 단백질 정량 키트 - DMEM이 SILAC 표지에 사용 된 13 C 6 아르기닌 L 염산 50 mg의 보충. 투석 된 소 태아 혈청 (FCS)을 SILAC 단백질 정량 키트가 제공된다.

  1. DMEM 배지에서 각각 50 ㎖ 병을 제거하고 투석 된 FCS 50 mL를 첨가.
  2. 13 C 6 L 라이신 2HCl 50 mg의 배지 1 ㎖의 13 C 6 L 염산 아르기닌 50mg을 녹인다. 철저하게 혼합하고, DMEM + FCS 매체에 아미노산을 추가합니다.
  3. 1X 펜 / 연쇄상 구균 및 1X L 글루타민 대체를 추가합니다. 멸균 필터 0.45 μm의 필터를 사용하여 기록 매체. "무거운"SILAC 매체로 병 레이블.
  4. L- 아르기닌 염산 50 mg의 L- 라이신 2HCl-50를 사용하여 1.3 mg의 -은 "광"배지를 제조하기 위해 반복 단계 1.1. "같은 병 레이블광 "SILAC 매체.

2. SILAC 라벨링 및 아미노산 설립 제어

  1. 를 Trypsinize 세포 (1X 트립신 EDTA) 및 스플릿 1 × 배지 2 ㎖, 웰은 "무거운"SILAC 배지 하나는 "광"하나를 포함하는 6 웰 배양 접시에 2 웰에 5 개 Huh7.5 세포 SILAC 매체.
  2. 문화 적어도 6 통로 용 셀 (분할 비 : 1 : 6); 6 개 통로 후 "무거운"아미노산의 혼입이 95 % 이상이어야한다.
  3. 수확은 "무거운"1 × 106 세포 - 및 "라이트"라벨이 지정된 세포군 혼입 효능을 분석한다. 1X PBS에서 세포를 세척하고 160 XG에서 5 분, 4 ° C 원심 분리하여 세포 펠렛.
  4. MS 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충 된 50 mM 트리스 -HCl pH 7.4, 1 mM의 EDTA)을 150 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 30 분간 얼음에 세포를 배양한다. 를 Lyse는 C4 ℃에서 초음파 처리하여 학습 학생.
    참고 : 다음 여기에 사용되는 초음파의 설정은 다음과 같습니다 타이머 개최; 출력 제어부, 8; 듀티 사이클이 80 %; 2 X 30 펄스.
  5. 11,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거한다. 새로운 튜브로 상청액을 옮기고 세제 호환 단백질 분석하여 단백질 농도를 결정한다.
  6. 95 °에서 6X 샘플 완충액 (375 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 25.8 % 글리세롤, 123 ㎎ / ㎖ SDS, 청색 600 ㎍ / ㎖의 브로 모 페놀 60 μL / ㎖ β 머 캅토 에탄올), 종기 단백질 75 μg의 믹스 C 5 분, 약 1 시간 동안 완충액 180 V에서 (3.02 g / L 트리스 염기, 18.8 g / L 글리신, 1 g / L SDS)를 실행하거나 제조에 따른 SDS에서 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리 '지시.
  7. 콜로이드 쿠마시 염색 액으로 겔을 전송. 각 레인에서 같은 단백질 밴드를 절제. 트립신 단백질을 소화하고 MS의 analysi 의해 혼입 효능을 분석S는, 22로 설명했다.

SILAC 표지 Huh7.5 세포의 3. 지질 방울 절연

  1. 셀들 중 하나 개 집단 감염 (즉, "빛"아미노산으로 표시된 것) (즉, JC1 NS5AB-mKO2-BSD가 MOI 1) 37 ℃에서 4 시간 동안 21 바와 같이 바이러스 축적량 배양하여 HCV 리포터 바이러스 .
    참고 : JC1 NS5AB-mKO2-BSD (21) 이전에 설명, 중복 NS5A-NS5B 분열 사이트 간의 블라스트 저항 유전자 (BSD) 다음 감염률을 모니터링하는 형광 기자 (단량체 Kusabira 오렌지 2, mKO2)를 나르는 HCV 바이러스입니다, (23). HCV과 협력 BSL2 + (USA) 또는 S3 ** (독일) 바이오 안전성 수준 봉쇄과 실천이 필요합니다. 대신 HCV 감염의 세포가 다른 병원균에 감염 될 수있다.
  2. HCV에 감염된 "빛"세포와 비감염 & #를 확장34]. 무거운 "세포 배양액의 계대 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 분취 량을 수정하고 21 바와 같이, 형광 마커 단백질의 유동 세포 계측법 (예 mKO2)하여 HCV 감염 비율을 결정하며 . JC1 NS5AB-mKO2-BSD의 HCV 균주를 사용하는 경우, HCV 양성 세포에 대해 선택하는 "광"배지에 10 ㎍ / ㎖의에 블라스트의 S를 추가 감염률 지질 방울 분리 주 대 90 % 이상이어야한다.
  3. 지질 액적 분리에 앞서 1 개 (D)은 PBS,를 Trypsinize "가벼운"및 "무거운"배지에 재현 탁하여 세포를 세척하고, 노이 바 우어 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. 시드 150 cm2로 세포 배양 접시에 각각의 인구의 7 × 106 세포. "빛"과 "무거운"세포 인구 당 적어도 5 개 요리를 준비합니다. 배양액 / 접시 O / N 30 ㎖의 세포.
  4. 매체를 제거하고 1X PBS로 세포를 씻어. 1 배에서 세포를 분리PBS는 셀 스크레이퍼를 사용하여.
  5. 노이 바 우어 카운팅 챔버를 이용하여 두 세포 집단을 카운트하고, 50 mL의 원심 분리 튜브에 동일 셀 번호 풀. 160 XG에서 5 분, 4 ° C 원심 분리하여 세포 펠렛.
  6. PBS를 제거하고 슈 크로스 완충액 (0.25 M 수 크로스, 1 mM의 EDTA, 1mM의 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일 보충)의 1 mL의 세포 펠렛을 재현 탁. 꽉 끼는 다운스 균질화하여 세포 현탁액을 옮기고 얼음 200 스트로크 용균.
    참고 : 트리 판 블루 염색법을 사용하여 완전한 세포 용해를 확인합니다.
  7. 1.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에 이동 해물 1000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 핵 및 세포 파편을 스핀.
  8. 원심 분리 후, 입력 제어 -20 ℃에서 이후 핵 분획을 25 μL (PNS)의 분취 량을 저장한다.
  9. 3 mL의 원심 분리 튜브 (11 X 60mm)의 하단에있는 PNS 분획의 나머지를 올려 놓고 ~ 지질 방울 세척 완충액 (오버레이와 4 ML의 TOT를AL) (50mM의 인산 칼륨 완충액 pH 7.4, 100 mM의 염화칼륨, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드).
  10. 100,000 XG에 2 시간, 4 ° C에 대한 원심 분리기. (- 지질 방울의 양에 따라 500 μL, 250)는 튜브의 상부로부터 절곡 무딘 캐뉼라를 사용하여 부동 지질 방울 분획 수확. 원심 분리 튜브 (11 X 60mm)의 지질 방울 분획 배치 지질 방울 세척 완충액 (~ 3.5 ㎖; 4 ㎖의 합계)를 오버레이하고, 원심 분리 단계를 반복한다.
  11. 튜브의 상부로부터 절곡 무딘 캐뉼라를 사용하여 부동 지질 방울 분획을 수확하여 새로운 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 지질 방울 옮긴다. 21,000 XG, 4 ℃에서 20 분 동안 지질 방울 세척 완충액 스핀 500 μL를 추가한다.
    참고 : 지질 방울 버퍼의 상단에 떠있는 흰색 밴드로 나타납니다.
  12. 겔 로딩 피펫 팁을 사용하는 직하 세척 완충액을 제거하고,이 세정 공정을 세 번 반복한다.
  13. 겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 세척 완충액의 최종 제거한 후, NP-40 용해 완충액 10 μL (50 mM 트리스 -HCl, pH 7.4, 150 mM의 염화나트륨, 1 % NP-40 5 μL 지질 방울 분획 믹스 ) 프로테아제 억제제 칵테일 보충. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. 세제 호환 단백질 분석으로 단백질 수준을 결정하고; 단백질의 적어도 35 μg의 MS 분석은 필요하다.
  14. -20 ° C에서 지질 방울 분수를 저장합니다.
  15. 4X 로딩 염료와 지질 방울 분획의 해당 볼륨을 섞는다. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 품어. 5 분 동안 95 ° C에서 끓인다.
  16. 제조업체의 프로토콜에 따라 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리한다. 콜로이드 쿠마시 염색 액으로 겔을 전송. 겔로부터 모든 단백질 밴드를 절제. 트립신의 겔 소화 24 <후/ SUP> 시료를 증발시켜 0.1 % 포름산 그들을 용해. LC-MS / MS로 분석한다.
    주 : 여기에서, LC-MS / MS는 극자 비행 시간 형 질량 분석계 (Q-TOF) 또는 선형 트랩 사중 극자 (LTQ) orbitrap 질량 분광기 분석을 수행 하였다. 두 장비는 나노 UPLC 시스템에 ESI 소스와 결합되었다. 데이터 분석 LC-MS / MS (21), (22)을 기술 된 바와 같이 수행 된 Q-TOF에 orbitrap과 질량 분석기에서 분석한다. 인간의 각질과 함께 샘플을 오염하지 않도록 상당한주의를 기울입니다. 항상 각질없는 피펫 팁 및 튜브를 사용합니다. 각질없는 화학 물질 층류 후드 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에 증류수와 에탄올 모든 표면 및 장치를 청소합니다. 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오.

지질 방울 순도 4. 분석

  1. 지질 방울 분획 1 씩 희석 : 2 입력 분획 NP-40과 1시 10분리스 (단계 3.9 참조)버퍼이다. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. 세제 호환 단백질 분석과 단백질 수준을 결정합니다.
  2. 6X 샘플 완충액으로 단백질의 동일한 양을 혼합하고 감염성 물질로 작업하는 경우, 바이러스를 비활성화하는 얼음상에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다. SDS-PAGE로 진행하고 90 분 동안 80 V에서 탱크 블 롯팅에 의해 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 옮긴다.
    주 : 완충액 (TBS-T (10 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 -20) 중 5 % 무 지방 건조 우유 분말) 블로킹 막을 차단 한 후, (지질 방울 마커에 대한 항체와 함께 배양 예 , PLIN1, PLIN2 또는 PLIN3)와 다른 세포 내 구획 (마커의 예 이차 HRP 결합 항체이어서 CALR, MnSOD 또는 튜 불린). 단백질의 검출을위한 화학 발광을 사용합니다.

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결과

지질 방울 비리 어셈블리의 추정 ​​사이트와 같은 HCV 감염에 매우 중요하지만, 형태 형성과 비리의 출구의 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 이 과정에 관여하는 신규 한 호스트 종속 요소를 식별하기 위해 HCV에 감염된 세포를 21 (도 1a)의 양적 지질 방울 프로테옴 분석을 수행 하였다. 우리는 지질 소적의 정제를위한 프로토콜을 확립하고 일상적 지질 방울 결합 단백질 PLIN2 / ADRP 및 PLIN3 / TIP47과 미토콘드리아 용 마이크로 튜브에 대한 이러한 β-tubulin의 다른 세포 구획 마커의 고갈 MnSOD 강한 농축 검출 또는 ER (도 1B, C)에 대한 칼레 티 큘린 / calnexin. 우리는 동위 원소 라벨을 사용하여, 특별히 모집 확인 된 단백질을 안정적으로 Huh7.5 세포 (그림 1D)와 지질 방...

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토론

여기서, 우리는 바이러스 감염 등 다양한 배양 조건에서 지질 소적과 연관된 단백질의 농축 및 고갈 비교 정량 지질 방울 프로테옴 분석 지질 방울을 분리하는 프로토콜을 기술한다. 다른 방법으로, 프로테옴 분석 전체 피크 강도에 기초하여 라벨없는 정량화하여 수행 될 수있다. 이 메소드는 동적 범위 제한이 없으며 대사 문제를 피할 수있다. SILAC 접근법의 장점은 샘플 전에 지질 방울 분리를 풀링하고, 따라서 결과가 다이제스트, 샘플 준비의 오류와 무관하고, LC-MS / MS 분석이다. 우리는 매우 정량적 지질 방울 프로테옴 분석을 위해이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.

유도 또는 단백질의 발현을 억제, quantitativ 의해 발현 수준의 분석을 반영 할 수있는 보충 또는 MS 분석에서 관찰 지질 방울 - 관련 단백질의 고갈로E 및 RT-PCR (바람직) 웨스턴 블 롯팅을 의뢰한다. 웨스턴 블 롯팅 및 BODIPY 또는 LD540, 기재 (2...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리의 JFH1 구성, T. 와키 타 (국립 연구소의 JC1 구조에 대한 R. 문헌 [Bartenschlager (하이델베르크 대학)의 Huh7.5 세포에 대한 CM 라이스 (록펠러 대학교), J 맥로치랜 (의학 연구위원회 (Medical Research Council) 바이러스학 단위) 감사합니다 HCVcc 리포터 작 제물에 대한 감염증의 JFH1 일본) 및 B. 웹스터 WC 및 그린 (바이러스학 글래드스턴 연구소 면역학). 이 작업은 DFG 자금 지원 하였다 (HE 6889 / 2-1 (EH), 337 / 15-1 2,013 INST 및 이달 337 / 16-1 2,013 (HS)). 하인리히 Pette 연구소, 실험 바이러스학에 대한 라이프니츠 연구소는 자유와 한자 동맹의 도시인 함부르크와 건강의 연방 교육부에 의해 지원됩니다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SILAC 단백질 정량 분석 키트 - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-아르기닌-HCl 50  mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x 집중Roth GmbHA152.2 
10x SDS-트리스-글리신 - 완충기Geyer Th. GmbH & 주식회사 KG A1415,0250 
글루타맥스 (100x)라이프 테크놀로지스 350500038 
세포 배양을 위한 페니실린/스트렙토마이신 솔루션Sigma-Aldrich Chemie GmbH P4333-100ml 
DPBS 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수Sigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
트립신-EDTA시그마-알드리치 케미 GmbH T3924-100ML 
염화나트륨 BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
프로테아제 억제제 칵테일 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-Sucrose BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
염산(HCl) 37% 순수 Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC 단백질 분석 바이오-라드 콜라보라토리스 GmbH 500-0116 
글리세롤AppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
브로모페놀 블루AppliChem GmbHA2331
β-Mercaptoethanol AppliChem GmbHA4338
블라스티시딘인비보젠ant-bl-1 
염화칼륨 AppliChem GmbHA1039
페닐메탄설포닐 플루오라이드 AppliChem GmbHA0999
인산칼륨 일염기성 시그마-Aldrich Chemie GmbH 
수소인산이칼륨Sigma-Aldrich Chemie GmbH P3786 
디티 AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Nonfat dried milk powderAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 &마이크로; gabcamab47639
칼레티큘린, pAb 200 &마이크로; g엔조 생명 과학 GmbH ADI-SPA-600-F 
안티-&베타;-Tubulin 시그마-알드리치 케미 GmbH T6074 200&마이크로; 엘  
에탄올 앱솔루트 (EtOH)Geyer Th. GmbH & 주식회사 KG A3678,0250  
안티 MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
안티-마우스 HRP써모 피셔 피어스32430
안티-래빗 HRP써모 피셔  Pierce32460
Amersham 하이퍼필름 ECLGE 헬스케어28906836
Lumi-Light 웨스턴 블로팅 기판Sigma-Aldrich Chemie GmbH 
96웰 세포 배양 플레이트Greiner Bio-One GmbH 655 180쪽;
테루모 주사기 1 mL테루모SS-01T
필트로푸르 BT 50, 500 mL, 0.45 &마이크로; 엠 사르스테트 83.1823.100 
Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔, 모든 kD 분해능 젤Bio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
6웰 세포 배양 플레이트Greiner Bio-One GmbH 657160 
접시 Nunclon 150/20 피셔 사이언티픽 GmbH 10098720 - 168381 
셀 스크레이퍼neoLab Migge GmbH C-8120 
튜브, 50 mLGreiner Bio-One GmbH 227261 
SafeSeal 튜브 RNase-free 사르스테트 72.706.400 
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참고문헌

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