수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

요약

이 프로토콜은 지속적으로 주변 조직을 방해하지 않고 플라나리아의 눈 (광학 컵)을 절제하는 방법을 보여줍니다. 어느 하나의 인슐린 바늘 및 주사기를 사용 또는 양쪽 눈은 눈의 재생, 영상 재생의 진화, 및 광 - 유도 행동 신경 기초 규제기구에 조사를 용이하게 절제 할 수있다.

초록

성체 줄기 세포 및 재생 메커니즘의 연구에서, 플라나리아 편형 동물은 생체 내 모델 시스템의 주식입니다. 이것은 그들의 풍부한 만능 줄기 세포 인구와 대부분의 동물에 대한 재앙이 될 것입니다 부상 후 모든 세포와 조직 유형을 재생하는 능력에 상당 부분 기인한다. 최근, 플라나리아는 눈 재생의 모델로 인기를 얻고있다. (두 조직 유형으로 구성 : 색소 세포 감광체) 전체에 눈을 재생하는 능력이 재생 시각 ​​시스템을 조절 메커니즘의 절개 허용한다. 눈 박리는 재생 만 크게 눈 조직에 한정된다 가장 중요한있는 눈 특정 경로 및 메커니즘을 조사하는 (예 잘린 또는 펀치 구멍 등의) 다른 기술에 비해 몇 가지 장점이있다. 이 비디오 문서의 목적은 확실하게 뇌를 방해하거나 주변 조직없이 플라나리아 광학 컵을 제거하는 방법을 설명하는 것입니다.웜 확립 콜로니의 유지 보수 처리도 설명된다. 이 기술은 수술 콜드 플레이트에 고정화 플라나리아의 광학 컵을 특종 31 G, 16분의 5 인치 인슐린 바늘을 이용한다. 이 방법은 다양한 애플리케이션을 가능하게 1 ~ 2 주 이내에 재생 눈으로, 단일 및 이중 눈 절제를 포함한다. 특히,이 절제 기술은 쉽게 재생 메커니즘과 진화, 눈 줄기 세포와 그 유지 보수 및 phototaxic 행동 반응과 신경 학적 기초의 더 나은 이해를위한 약물 및 유전자 (RNA 간섭) 화면과 결합 될 수있다.

서론

플라나리아는 성체 줄기 세포 매개 재생 연구를위한 강력한 모델 생물이다. 이 비 기생 담수 편형 동물은 중추 신경계와 뇌의 ^1을 포함한 모든없는 조직을 재생하는 능력을 가지고있다. (계내 혼성화, 면역 조직 화학, RNA 간섭 (RNAi의) 및 transcriptomics, 이러한 시퀀스 게놈 등)까지 거슬러 과거 10-15 년간 플라나리아 필드 1700 ^2, 기술적 진보로서 전공이 과거 모델 생물을 업데이트 한 . 특히, 플라나리아는 최근 눈 연구 ^3에 대한 새로운 모델로 인기를 얻고있다.

플라나리아는 두 조직 유형, 광 수용체 신경 세포와 색소 세포의 전형 눈을 가지고; 이는 눈 줄기 세포 인구의 특성을 활성화하고 동일한 유전자의 많은 척추 동물의 눈 드를 조절 것을 보여 주었다velopment은 플라나리아 ^{4, 5에} 보존되어있다. 시신경 컵 등쪽에 위치하고 있으며 광 수용체 뉴런의 흰색, 착색 수상 돌기 및 반 달 검은 색소 세포 구성하고, 눈은 광학 chiasm 통해 뇌....

프로토콜

1. 동물 문화와 처리

참고 :이 프로토콜은 Schmidtea의 MEDITERRANEA, 일반적으로 재생 연구에 사용되는 시퀀스 게놈 ^{(16), (17)와} 이배체 플라나리아 종을 사용합니다. 그러나, 분석은 Girardia의 tigrina 및 Girardia의 dorotocephala (이 상업적으로 사용할 수있는)와 같은 다른 종과 동등하게 성공적이다.

1. 초순수 (또는 여과 탈) 물에 0.5 g / L의 바다 염으로 만든 "웜 물"웜을 유지한다. 웜 물을 유지하기 위해 멸균 폴리 프로필렌 또는 유리 용기를 사용합니다. 참조 보충 파일 1 웜 물 준비에 대한 자세한 내용을.
   참고 : 비누와 같은 용기 (또는 기타 소모품) 청소 비누를 사용하지 마십시오 벌레에 독성; 대신 70 % 에탄올로 닦아 자연 건조 할 수 있습니다.
   1. 오염으....

결과

처음 1 ~ 2 시간 후 수술을 위해, 동물은 그대로 웜 (그러나 그들은 여전히 ​​이동합니다)에 비해 움직임을 감소 발생할 수 있습니다. 원하는 경우, 웜 (RNAi의 공급을 위해, 예를 들어) 수술 24 시간 이내에 먹을 것이다. 시간이 지남에 따라 같은 개인의 눈의 재생을 다음과 같은 경우 모두 수술 전에 (그대로)과 1 시간 후 절제 (고전력 증폭기)에서 각 웜의 사진을해야합니다. 사일 포스트 어블 (DPA)에 의해 재생 색소 세포를 표시하고, (14) 전체에 눈이 완전히 재생 된 것이다 DPA (도 3A-B)를 기준으로한다. 이것은 감광체 신경 및 뇌 (도 3c)에 그들의 신경 분포뿐만 아니라 시각 시스템 (도 4A-C)의 기능 회복을 포함한다. 성공적인 절제 뇌 (그림 4D-E)의 기본 조직을 방해,도 동물 (그림 5A)에<.......

토론

이것은 눈 박리 방법은 뇌 조직을 제외하고, 안구 조직에 주로 절단을 제한함으로써 (예컨대 펀치 구멍 등) 현재의 방법을 개선한다. 기술자 경험이 있지만 양심적 학부 학생들에게 microsurgeries 경험에서 연습으로,이 기술은, 대부분의 개인에 의해 수행 될 수있다. 이 기법은 이전에 면역하거나 눈 마커 (들) ^{(4, 5), (13)} 계내 혼성화 모든 눈 조직을 완전히 제거 (수)의 확인을 포함하여, 실험에 절제를 사용하여 여러 차례 실시하는 것이 권장된다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 조직의 밖으로 떠 서입니다. 너무 많이 또는 너무 적게하거나 조직을 제거하지 않는 것이 중요하다. 이 웜의 복부 측면에 관통 방지하기 위해 바늘로 너무 깊게 떠서하지 않음으로써 피할 수 있습니다. 니의 끝DLE는 약 0.4 mm 깊이 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인스턴트 오션 바다 소금	스펙트럼 브랜드	SS15-10	"10 갤런" 상자  (순중량 3 파운드)
Kimwipes EX-L 린트-프리 티슈 와이프	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 인치
Whatman #2 여과지	시그마	WHA1002125	Circles, 125 mm 직경, 흰색
Easy Touch 인슐린 주사기 (바늘 포함)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc 주사기, 31 G 5/16 인치 바늘
100 mm 페트리 디쉬	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm 페트리 디쉬	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  펜치	Fine Science Tools	11254-20	Inox, 직선 팁, 11cm
트랜스퍼 피펫	샘코 사이언티픽	225	눈금, 큰 전구, 7.5 mL, 비멸균
Parafilm M 파라핀 필름	브랜드	701606	4 인치 x 125 피트 롤
12-웰 미처리 조직 배양 플레이트	VWR	15705-059	미처리, 평평한 바닥, 멸균, 팔콘 브랜드
플라스틱 식품 용기 (콜로니용)	Ziploc	대형 직사각형	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
플라나리아 (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	"갈색" 플라나리아로 판매되며, 대부분은 G. tigrina (일명 Dugesia tigrina)이지만, 가끔은 G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala)입니다. 둘 다 작동합니다.
플라나리아(Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea은 상업적으로 이용할 수 없습니다. 현재 동물은 동물을 사용하고 여분의 동물을 키우는 실험실에서만 얻을 수 있습니다.
갈색 종이 타월	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold 종이 타월, 표백되지 않은
세척 병(지렁이물용), 옵션	VWR	16650-275	세척 병, 저밀도 폴리에틸렌, 넓은 입, 500mL
항 시냅신 항체, 선택 사항	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	상등액
Anti-arrestin 항체, 선택 사항	n/a	n/a	상업적으로 이용할 수 없습니다. 터프츠 대학교의 마이클 레빈이 준 친절한 선물
Nalgene Lowboy 카보이 (지렁이 물 저장용), 선택적	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  폴리프로필렌, 로우 프로파일로 플라스틱 콜로니 용기를 채우기 쉽게 해줍니다
맞춤형 펠티에 플레이트, 선택적	윌리엄스 머신, 폭스보로, 매사추세츠	해당 사항 없음	Junji Morokuma, Tufts University:  펠티에 플레이트는 표준 열전 히트 펌프로 구성됩니다 (예: All Electronics Corp 카탈로그 # PJT-1, 30 mm2).  정사각형 열 펌프는 얇은 거울 표면으로 덮인 다음 원형 플렉시 유리 형태(직경 ~50mm)의 30mm2 정사각형 구멍 내부에 배치됩니다. 이 형태는 히트 펌프와 두께가 비슷하며 원형 방열판 (직경 ~ 115mm)의 중앙에 툴링 된 우물에 플러시로 맞습니다. 형태/히트 펌프는  실리콘 베이스 방열판 화합물로 싱크대에 "고정"됩니다. 리드는 형태와 방열판을 통해 뚫린 구멍을 통해 나사산으로 연결됩니다. 방열판의 아래쪽 절반은 현미경의 베이스 플레이트 개구부에 맞는 "발"로 공구화되어 있습니다.
DC 전원(펠티에 플레이트용), B 및 옵션	; K Precision	1665	레귤레이트 저전압 DC 전원 공급 장치, 1-18V(DC), 1-10암페어.
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