방법 논문

특별 한 광학 전송 인간의 혈 청에 심장 Biomarkers 척도를 사용 하 여

DOI:

10.3791/55597

2017년 12월 13일

이 논문에서

요약

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이 작품에서는 특별 한 광학 전송의 원리에 의해 작동 하는 높은-품질 감지 배열을 조작 하는 nanoimprinting 리소 그래피 방법을 설명 합니다. 바이오 센서 낮은-비용, 강력 하 고 사용 하기 쉬운, 그리고 심장 분을 검출할 수 있다 임상 관련 농도 (99번째 백분위 수 차단 ∼10-400 pg/mL, 분석 결과 따라)에서 혈 청에서 나.

초록

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분석 결과 감도, 재현성, 및 인간 혈 청의 배경에 대해 analytes를 안정적으로 모니터링 하는 기능 포인트의 케어 (POC) 설정에서 임상 관련성을 바이오 센 싱 플랫폼에 대 한 중요 한 있습니다.

Nanoimprinting 리소 그래피 (NIL) 감지 영역 1.5 m m x 1.5 m m로 저렴 한 비용, 조작에 사용 되었다. 감지 표면 nanoholes, 약 140 nm2의 지역에 각각의 고 충실도 배열 되었다. 전무의 좋은 재현성 12 개별적으로 제조 된 표면에, 최소한의 칩 변형을 한 칩, 한 측정 전략을 가능 하 게. 이러한 지역화 된 nanoimprinted 표면 플라스몬 공명 (LSPR) 칩 안정적으로 bioanalyte에서에서 다양 한 2.5 biofluid에서 복잡 한 배경 가운데 75 ng/mL이 케이스, 인간 혈 청 농도 측정 하는 그들의 능력에 광범위 하 게 테스트 되었습니다. 없음 사용 차례로 필요가 현미경으로이 바이오 센서는 일반적으로 사용 가능한 실험실 광원 쉽게 인터페이스 될 수 있습니다 큰 감지 영역의 세대의 높은 정밀도. 이 바이오 센서에서에서 검색할 수 심장 분 혈 청 0.55 ng/ml, 탐지 (LOD)의 한도에서 높은 감도 가진 임상 관련입니다. 그들은 또한 낮은 칩 변화 (때문에 제조 프로세스의 높은 품질) 표시. 결과 널리 사용 되는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)와 commensurable-분석 실험을 기반으로 하지만 기술을 유지 한 LSPR 기반 감지 플랫폼 (즉, 적중이 소형화 및 멀티플렉싱, 그것의 장점 더 가능한 POC 응용 프로그램에 대 한).

서론

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특별 한 광학 전송 (EOT)에서 첫 번째 보고서 Ebbesen 외. 19981에 의해 출판 되었음 이후 화학 센서 nanohole 배열에 따라 수많은 조사의 주제 되었습니다. 빛 nanohole 구조의 서브 파장 크기의 주기적인 배열에 impinges, 향상 된 전송 특정 파장에서 발생 합니다. 이 사건 빛 블로흐 파 표면 polariton (BW-SPP) 또는 지역화 된 표면 plasmons (LSP)2커플 때 발생 합니다.

기본 물리 법칙 같은 정기적인 배열 바이오 센 싱은 간단 때 악용. 분자 또는 금속의 인터페이스 근처의 흡착 스펙트럼에서 전송 밴드의 위치를 이동 하는 차례로 금속 접촉 매체의 유전율을 변경 합니다. 나노-엔지니어링 모양, 크기, 및 분리 거리3,,45스펙트럼 자체를 조정할 수 있습니다. 디자인, 센서 EOT에 따라 분자 바인딩 이벤트의 조사 기간 동안 특정 할당6,,78 을 용이 하 게 그들의 스펙트럼에서 특성 밴드 있다. 이것은 중요 한 이점을 상용 표면 플라스몬 공명 (SPR) 플랫폼 이다.

센서 EOT를 사용 하 여 일반적으로 광학 조명을된 빔 감지 표면에 입사 되도록 정렬 광원을 포함 한다. 기술 공동 폴리머 템플릿 및 간섭 및 나노 리소 그래피, 등 대형 nanohole 서피스를 생성 하는 빈약한 재현성9. 정확 하 게 날조 EOT 현상 보여 큰 표면에 이러한 제한으로 인해 광학 현미경 광원 및 검출기를 올바르게 배치 하는 데 필요한 했다. 단순화 기술, 높은 품질 nanoimprinting 리소 그래피 (NIL)10 고용 되었다. 이 칩에 감지 표면에 대 한 보고 현미경에 대 한 필요성을 제거 대형 센서 표면11 (mm-규모)의 생산을 사용할 수 있습니다. 대신,이 센서는 표준 광섬유 케이블을 쉽게 인터페이싱 될 수 있습니다.

이 nanohole 배열에 대 한 전송 봉우리 근처-적외선 영역 (NIR)을 볼 수에 포함 됩니다, 그것은 완벽 하 게 수성 환경에서 생체에 대 한 바인딩 이벤트 감지에 적합 합니다. Nanohole 배열의 예상된 광 동작 시뮬레이션 했다. 결과 다음 표준 굴절 인덱스 (RI)의 액체와 연구를 통해 확인 됩니다. 이 배열 심장 분의 농도 측정 하는 데 사용 했다 나 (cTnI) 인간의 혈 청의 복잡 한 배경에서. cTnI는 급성 심근 경색의 진단 위한 임상 골드 표준입니다.

이 센서를 사용 하 여 감지 하 여 탐지 (LOD)의 0.55 ng/mL의 제한에서 인간의 혈 청에 cTnI는 임상 관련 계량 가능 하다. 검출은 가장 일반적으로 사용 되는 기술이 도메인, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 보다 훨씬 더 빠른. 또한, 감지 표면 수 쉽게 생성 및 따라서 재사용. 따라서,이 작품 복잡 한 biofluids 내에서 바이오 센 싱에 대 한 가능한 포인트의 케어 (POC) 기술로 nanohole 배열의 약속을 보여 줍니다.

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프로토콜

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1. 센서 및 데이터의 수집의 제조

  1. 니켈 금형의 준비
    1. 코트의 부정적인 전자 빔 220 nm 두께 층 600 µ m 두께 4에서 실리콘 웨이퍼에 저항. 전자 빔 리소 그래피 시스템을 사용 하 여이 웨이퍼에 디자인 된 nanohole 배열을 작성 합니다.
      1. 가속 전자 빔 쓰기, 각 300 µ m 필드 크기에 대 한 20 k의 낮은 dotmap (N)와 패턴 작성 (A) (즉, 거기 각 300 µ m2 지역에 매핑된 0.4 십억 점 고 각 점 안 전자 빔에 의해 노출도 됩니다 패턴 디자인에 따라). 110 µ C c m−2 에 저항에 대 한 전자 빔 레지스트 노출 복용량을 설정 하 고 800의 전류 (I)에 쓸 아빠
        참고: 전자 빔 글에 노출 복용량 (D)에 의해 제어 됩니다 각 점 (T), 계산에 대 한 노출 시간 figure-protocol-1 . 110 µ C cm−2에서 노출 복용량에 대 한 노출된 각 도트에 전자 빔 집 시간은 0.5 µ s12입니다. 배열 1.8 m m2의 영역을 캡처, 이후 300 µ m2 필드 영역 양식 1 큰, 골드 nanohole 배열에 함께 물 렸 다의 36 패치 총이 있습니다.
    2. 10 개발자 솔루션에 4 인치 실리콘 웨이퍼를 immersing 하 여는 저항을 개발 s 고 건조 한 공기에 웨이퍼.
    3. 실리콘 웨이퍼에 금속, 니켈, 구리, 알루미늄, 등의 씨앗 층을 예금 한다.
    4. 니켈 믹 목욕에서 도금 시스템에서 웨이퍼를 전기 도금. 두 단계에 전기를 실시 합니다. 첫 번째 단계, 지속적인 95 분에서에서 0.7 A dm−2;의 전류 밀도 사용 하 여 이 완전히 니켈으로는 nanopatterns를 채웁니다. 두 번째 단계에서 125 분, 지속 사용 12 A dm−2 로 최종 니켈 금형 두께 300 µ m에 도달 (20 nm). PH 값 3.5-3.8에이 고 온도 52-54 ° c.
    5. 부드러운 기계적인 힘을 적용 하 여 니켈 형 실리콘 기판에서 분리 합니다. 전자 빔 레지스트에서 잔류물을 씻어 하룻밤 긍정적인 감광 제 제거 시의 약 100 mL의 니켈 몰드를 담근 다.
    6. 3 h. 위해 100 ° C에서 플라즈마 에칭 시스템 10 sccm에서 O2 가스와 100 W 3 분에에서 그것을 청소 피드 니켈 형 오븐에 건조.
  2. 골드 nanostructure의 제조
    1. Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS)의 150 µ L에서 니켈 형에 코트는 80 ° c.에 자기 조립 단층 (SAM) 코팅 기계
      참고:이 nanoimprinting 단계 완료 후 감광 제 ("demolding")에서 금형의 분리 하면는 방지 접착 층을 형성할 것 이다. 기화 시간 180 이어야 한다 s, 반응 시간 되어야 900 s.
    2. 에 4-10 막대기의 압력 및 40 ° C의 온도에서 10 분에 대 한 나노-imprinter을 사용 하 여 사진 치료할 수 없음의 300 nm 두께 층으로 코팅 된 유리 웨이퍼 저항 nanopatterns 인쇄물
    3. 전송 형, 감광 제, 및 유리 웨이퍼 자외선 경화 시스템 및 30에 대 한 자외선 노출의 75 mW cm-2 와 photocure에 s.
      참고: 만약 모든 단계를 올바르게 따른, 니켈 형 한다 쉽게 될 demolded는 감광 제에서.
    4. 반응성 이온 에칭 (RIE) 시스템 수행 빈 엣지는 감광의 유리 기판 50 W 2에서 10 sccm의 O2 가스 흐름에 들여쓰기 영역에 유리를 노출 하는 s.
    5. 전자 빔 증 착 기계에 유리 웨이퍼에 크롬 (Cr) 금속 접착을 위한 5 nm 두께 층 및 plasmonic 센서에 대 한 금 (Au)의 100 nm 레이어를 입금. 1의 증 착 속도 사용 하 여 Cr 및 2 Å s− 1 Au Å s− 1 .
    6. O2 플라즈마 에칭 3 분 뒤에 아세톤에 15-s sonification 단계는 감광의 이륙을 수행 합니다.
    7. 샘플 5 m m × 5 m m 칩으로 주사위. Nanohole 배열에 중앙 2 m m × 2 m m 칩의 차지할 것입니다.
  3. 데이터의 수집
    1. 송신기 광 섬유의 끝을 통해 종료 하는 흰 빛의 광선 조명을 90 °에 센서 표면 (nanohole 배열)에 사고는 광학 측정으로 장치를 설정 합니다.
      참고: 라이트 온 nanohole 배열을 통해 전송 됩니다.
    2. 섬유 광학 수신기와 전송 된 신호를 수집 하 고 자외선 보이는 분 광 계 300 1000의 범위 내에서 운영으로 기록 nm.
    3. 소음 측정에서 낮은 최종 스펙트럼을 얻기 위해 20 양 평균 100 프레임에 각 프레임에 대 한 수집 시간을 설정 합니다.
    4. 플로팅 소프트웨어를 사용 하 여 이전에 확인 된 전송 봉우리 (로렌츠 기반 메서드를 사용 하 여)에 따라 데이터를 분석.

2. 센서 대량 감도 테스트

  1. 표준 리 액체는 RI에서에서 다양 한 1.31 1.39와 액체 셀으로 입금.
  2. 표준 리 액체에 센서 칩을 담가 그리고 하얀 빛의 광선으로 그것을 정렬. 전송 스펙트럼을 얻습니다.
  3. 표면 활성 청소 시 약 각 측정 후 센서 칩을 청소 하 고 질소 가스로 건조.

3. 센서 표면 수정

  1. 이전에 어떤 화학 수정 소 프로 파 놀, 아세톤, 그리고 이온된 수에 순차 침수로 센서 칩을 청소. 건조 질소 가스의 흐름에 실 온에서 건조.
  2. 0.4 m m 및 1.6 m m 10-카-1-decanethiol 1-octanethiol 12 시간 실 온에서의 ethanolic 솔루션에 센서 칩을 품 어.
    참고:이 것입니다 양식을 아민 반응 자기 조립 단층 (SAM).
  3. 에탄올을 사용 하 여 철저 하 게 헹 구 고 실 온에서 건조.
  4. 75mm sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo NHS)와 15 m m 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 혼합물을 확인 합니다. 이 혼합물을 15 분 동안에 칩을 담가.
    참고:이 carboxylic 그룹 SAM 활성화할 것 이다.
  5. 센서 표면에 pH 4.5 아세테이트 버퍼에서 200 µ g/mL 안티 분 항 체 솔루션의 50 µ L를 자리 하 고 30 분 동안 품 어.
  6. 15 분 동안 1 M HCl 방법 솔루션에 센서 칩을 immersing 하 여 unreacted 에스테 르를 비활성화 합니다.
  7. 이온을 제거 된 물으로 칩을 헹 구 고 실 온에서 건조 질소 가스의 흐름에 건조.

4입니다. cTnI 분석 결과

  1. 어떤 비 특정 바인딩 표면에 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션의 100 µ L를 탐지 하 여 차단 합니다.
15 분 동안 품 어.
  • (PBS) 염 인산 염 버퍼에 센서 칩 3 번을 씻어. 기록 전송 스펙트럼 측정 셀에 칩을 삽입 합니다.
    참고:이 참조 스펙트럼 이다.
  • 칩 표면에 표준 cTnI의 50 µ L를 자리 하 고 30 분 동안 습 한 환경에서 품 어.
  • 3 회 PBS 솔루션에 센서 칩을 씻어 고 전송 스펙트럼 기록 측정 셀에 삽입 합니다.
    참고: 이것은 후 바인딩 스펙트럼입니다.
  • 50mm 글리신-HCl (pH 2) 1 분 동안에 칩을 잠수함 고에 씻어 PBS 솔루션 세 번 재생성 칩 표면에. 재생 단계의 성공을 확인 하는 PBS에 전송 스펙트럼을 측정 합니다.
  • 5. 표면 플라스몬 공명 (SPR) 측정

    1. PBS-T 버퍼 SPR 시스템에서 다중화 된 SPR 센서 칩을 실행 합니다.
      참고: PBS T 버퍼의 구성 이며 20 mM 나 인산, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20. PH 7.4입니다.
    2. CTnI 표준 및 항 체을 사용 하 여 4 단계에서 설명한 대로.
    3. EDC (0.2 M) 및 sulfo NHS 5 분 수행 50 µ g/mL 항 체 560의 5 분 주입 (0.05 M)의 혼합물 및 5 분 주입 1 M HCl 방법 솔루션의 6 사용 가능한 채널 3을 활성화 합니다.
    4. 센서 칩으로 90도 회전 하 고 다른 농도에서 cTnI 표준 주입 (75, 30, 7.5, 그리고 2.5 ng/mL).
    5. 관찰의 SPR 판독을 통해 실시간으로에서 칩에 상호 작용에서 항 체를 활용 합니다.
    6. 50mm 글리신-HCl (pH 2) 1 분을 주입 하 여 칩을 다시 생성 합니다.

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    결과

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    측정을 위한 광 설치 그림 1A에 표시 됩니다. 실제 nanohole 배열의 이미지 그림 1B에서 제공 됩니다. 감지 프로세스를 운전 하는 물리학을 이해 하기 콤솔 시뮬레이션 소프트웨어는 수성 환경에서 plasmonic 필드의 분포를 시뮬레이션 하기 위해 사용 되었다. 시뮬레이션 결과 다음 실제 측정에 관련 되었다. 이전에 게시 연구 만든 가정 및 시뮬레이션11,13에 사용 된 매개 변수를 포함 합니다. Nanohole 배열 했다 다음과 같이 plasmonic 필드를 시뮬레이션 하는 데 사용 되는 실제 크기: p = 400 nm, D = 150 nm, 및 T = 100 nm. 흡수와 산란 효과 또한 계정14 때 찍은 전...

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    토론

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    사건과 nanostructures 빛 사이 상호 작용을 시뮬레이션 그 변화는 분석의 농도의 기능으로 기록 될 수 있습니다 (전송 스펙트럼)에 적절 한 피크를 확인할 수 있습니다. 그 변화는 분석을 추적할 수 있습니다 오른쪽 밴드의 선택에 중요 한 센서의 구조에 대해 밴드의 지역화는 중요 하다. 시각화는 시뮬레이션을 통해 달성 될 수 있다. 이것은 또한 analytes의 바이오 센 싱을 수 있도록 하는 최적의 구조 설계에 중요 한입니다. 으로 본 여기, 밴드 I 및 III 유리 금 인터페이스에 지역화 및 따라서 바이오 센 싱에 대 한 유용 하지 않습니다. 저명한 LSPR 구성 요소 밴드 II에서에서 관찰할 수 있습니다. 짧은 감퇴 길이 및 하 고는 nanoholes의 가장자리에 지역화 됩니다. 따라서,이 분석 농도 감지에 사용 되 고에 잘 빌려준다. 전체 배열 조작된 nanostructures의 품질 또한 수집 된 스펙트럼의 품질에 필수적 이다. 비균일 구조 유물을 소개 합니다.

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    공개 사항

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    저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

    감사의 글

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    AP 인정 교수 T Venkatesan, 감독, 누스 Nanoscience 및 나노기술 이니셔티브의 사무실 대리인 대통령 (싱가포르 국립 대학) (R-398-000-084-646)의 지원 합니다. CLD 지원의 싱가포르 교육부의 건강 국립 의료 연구 위원회 그것의 임상 과학자 자금 계획, NMRC/체코/035/2012, 그리고 싱가포르 국립 대학에서 인정합니다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    전자빔 리소그래피 설정Elionix ELS 700
    o-XyleneSigma Aldrich95662
    EB resistSumitomoNEB-22A2
    개발자 시약Shipley CompanyMicroposit MF 321
    전기도금 기계Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper Rohm and Haas 전자 재료  LLC마이크로포짓 제거제 1165
    에칭 시스템트리온 팬텀
    헵타데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로데실)트리클로로실란 Gelest (PA, USA)78560-44-8
    SAM 코터 주식회사 소로나AVC 150M
    광경화 NIL 레지스트마이크로 레지스트 기술 GmbHmr-UVCur21-300nm
    광 경화 시스템Dymax 모델 2000 Flood
    E-beam 증착기Denton Explorer
    UV-가시 분광계 Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    표준 굴절률 액체 Cargill Inc (Cedar Grove, USA)18032
    플로팅 소프트웨어OriginPro Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol Dojindo Laboratories (일본)C385-10
    1-옥탄티올 Sigma-Aldrich, MO, USA471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide 및 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide BioRad (CA, USA)1762410
    항트로포닌 항체 560Hytest (핀란드)4T21
    에탄올아민-HCl 용액BioRad (CA, USA)1762450
    표면 플라즈몬 공명 설정BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chipBioRadGLC
    Human cTnI standardPhoenix 제약EK -311-05
    Glycine-HClBioRad (CA, USA)1762221

    참고문헌

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    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).
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