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방법 논문

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

16.5K 조회수

DOI:

10.3791/55615

2017년 6월 23일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

초록

호중구의 이동과 주 화성은 우리 몸의 면역계에 중요합니다. 미세 유체 장치는 실시간 시각화, 화학 물질 농도 구배 생성의 정확한 제어, 시약 및 시료 소비 감소 등의 이점 때문에 호중구 이동 및 주 화성을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 최근에, 전체 혈액으로부터 직접적으로 통합되고 용이하게 작동되는 미세 유체 주 화성 분석 시스템을 개발하기위한 노력이 마이크로 유체 연구원에 의해 이루어졌다. 이 방향에서, 첫 번째 all-on-chip 방법은 작은 혈액량 샘플에서 호중구의 자기 음성 정화와 주 화성 분석을 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 방법은 25 분 내에 신속한 시료 - 결과 호중구 주 화성 시험을 허용합니다. 본 백서에서는 문제 해결 전략, limi에 대한 토론과 함께 온칩 주 화성 분석을위한 상세한 구성, 작동 및 데이터 분석 방법을 제공합니다미래 방향. 이 all-on-chip 방법을 사용하여 정의 된 chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) 및 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 환자의 객담을 테스트하는 호중구 주 화성 분석의 대표 결과가 표시됩니다. 이 방법은 많은 세포 이동 관련 조사 및 임상 적용에 적용 가능합니다.

서론

화학 주성은 용해성 화학 물질 농도 구배로 이동하는 세포 이동 과정으로 면역 반응 1 , 2 , 3 , 조직 발달 4 및 암 전이 5를 포함한 많은 생물학적 과정에 결정적으로 관여합니다. 호중구는 가장 풍부한 백혈구 하위 집합이며 신체의 타고난 숙주 방어 기능을 가능하게하고 적응 면역 반응을 중재하는 데 중요한 역할을합니다 6 , 7 . 호중구에는 고도로 조절 된 주 화성 기계가 장착되어있어이 운동성 면역 세포가 병원체에서 유도 된 화학 유인 물질 ( 예 : fMLP)과 호스트 유래 화학 유인 물질 ( 예 : 인터루킨 -8)을 통과 할 수 있습니다. 호중구의 이동과 주 화성은 다양한 생리 학적 문제를 매개한다.염증 및 암과 같은 질병 1 , 9 . 따라서, 호중구 주 화성의 정확한 평가는 호중구 생물학....

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프로토콜

모든 인간 샘플 수집 프로토콜은 위니펙의 매니토바 대학 (University of Manitoba)의 공동 연구 교수 윤리위원회 (Joint-Faculty Research Ethics Board)의 승인을 받았습니다.

1. 미세 유체 장치 제작 ( 그림 1A )

  1. 디자인 및 인쇄 투명 마스크.
    1. 이전에 자세히 설명한대로 장치를 설계하십시오. 그림 1A를 참조하십시오.
      참고 :이 장치에는 두 개의 레이어가 있습니다. 첫 번째 층 (4 μm 높이)은 그라디언트 채널 옆의 셀을 트랩하는 셀 도킹 차단 채널을 정의합니다. 두 번째 층 (높이 60μm)은 기울기 생성 채널, 세포 로딩을위한 포트 및 채널, 화학 물질 유입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 정렬 마크는 2 개의 층을 위해 설계된다. 두 번째 레이어의 경우, 업스트림 채널의 길이와 너비는 각각 60 mm와 200 μm입니다. 하류의 길이와 너비구불 구불 한 입력 채널은 각각 6 mm와 280 μm입니다.
    2. 고해상도 프린터를 사용하여 투명 필름 마스크에 첫 번째 및 두 번째 레이어 피....

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결과

호중구는 미세 유체 장치에서 직접 한 방울의 전체 혈액에서 부정적으로 선택됩니다. 분리 된 호중구의 순도는 Giemsa 염색에 의해 확인되었으며, 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보였다 ( 그림 2A ) 25 . 이것은 소량의 전혈에서 고순도의 효과적인 칩 중성구 분리를 나타냅니다. 또한, 도킹 구조는 화학 구배 ( 그림 2B ) 25 를 적용하기 전에 그래디언트 채널 옆의 셀을 효과적으로 정렬 할 수 있습니다.

기울기 생성은 연속적인 층류 화학 약품 혼합을 기반으로하며, 흐름은 입구 및 출구 용액의 서로 다른 레벨로부터의 압력 차에 의해 유도됩니다.......

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토론

이 논문에서는 호중구를 전혈에서 직접 분리하고 화학 주성 테스트를 단일 미세 유체 칩에 직접적으로 분리하는 상세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이 방법은 간편한 조작, 고순도 호중구의 부정적 선택, 신속한 샘플 - 결과 화학 주성 테스트, 감소 된 시약 및 샘플 소비 및 정확한 세포 이동 데이터 분석에서 유용한 기능을 제공합니다. 대략적으로, 입력 된 전체 혈액 샘플로부터의 호중구의 적어도 25 %가 장치의 도킹 구조에 효과적으로 들어가고, 우리는 칩식 Giemsa 염색에 의해 호중구 순도가 높다는 것을 발견했다.

이 개발 된 all-on-chip chemotaxis 분석 방법은 다양한 세포 이동 연구 및 임상 응용 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법의 연구 응용은 배지에서의 호중구 주 화성을 fMLP 구배와 비교함으로써 입증되었다. 마찬가지로,이 방법은 COPD spu에서 호중구 화학 주성을 시험하는데 사용될 수있다임상 진단을위한 세포 기능성 바이오 마커를 개.......

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공개 사항

공개 할 이익 충돌이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 부분적으로 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 및 캐나다 보건 연구원 (CIHR)의 연구비 지원에 의해 지원됩니다. 위니펙의 빅토리아 종합 병원 (Victoria General Hospital)과 위니펙의 세븐 옥스 종합 병원의 임상 연구 및 응용 연구소 (Clinical Institute of Applied Research and Education)에 감사드립니다. Hagit Peretz-Soroka 박사에게 분석 작동 전략에 대한 도움이되는 토론에 감사드립니다. 워털루 대학교 (University of Waterloo)의 캐롤린 렌 (Carolyn Ren) 교수와 닥터 (Xiaoming, Cody) Chen 박사는 촬영 과정에서 관대 한 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Device fabrication
Mask alignerABMN/A
SpinnerSolitec5000
HotplateVWR11301-022
플라즈마 세척기Harrick PlasmaPDC-001
진공 건조기Fisher Scientific08-594-15A
디지털 스케일OhausCS200
SU-8 2000 더 얇은MicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 포토레지스트MicrochemSU-8 2025
SU-8 개발자MicrochemSU-8 개발자
Si waferSilicon, IncLG2065
이소프로필 알코올Fisher ScientificA416-4
(트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸) 트리클로로실란겔레스트78560-45-9
폴리디메틸실록산
(PDMS)
엘스워스 접착제2065622
페트리 접시Fisher ScientificFB0875714
유리 슬라이드Fisher Scientific12-544-4
커팅 패드N/AN/A주문 제작
펀처해당없음 :사용자 정의
< strong>NameSource카탈로그 번호Comments
>On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher ScientificSH3002802
소 혈청 알부민
(BSA)
Sigma-AldrichSH3057402
FibronectinVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
자기 디스크인디고 기기44202-1직경 5mm, 두께
1mm 두께
FITC-덱스트란시그마-알드리치FD10S
로다민
시그마-알드리치
R4127-5G
Giemsa 염색 용액Rowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit
STEMCELL
Technologies Inc
19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Nikon Ti-U 반전 형광 현미경NikonTi-U
현미경 환경 챔버.InVivo ScientificN/A
CCD 카메라NikonDS-Fi1

참고문헌

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immun....

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재인쇄 및 허가

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