조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.
서론
소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발.
개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 ,....
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프로토콜
모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다.
1. 계란 취급
- 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다.
- 인큐베이터에 세팅하기 전에 70 % 에탄올로 각 알을 닦으십시오.
- ~ 50 % 습도에서 38 ° C로 설정된 온도의 인큐베이터에서 양 옆에 1-2 개의 달걀을 놓습니다. 이것은 electroporation과 최적의 생존 능력을위한 적절한 배아 위치를 보장합니다.
참고 : 배양 48-52 시간 후, 계란은 햄버거 - 해밀턴 (HH) 단계 ~ 12-13 일에 electroporation 준비가 될 것입니다.
2. 준비
- 플라스미드 Mi싱
- DNA 혼합물 7 μL 당 0.1 μL의 빠른 녹색 1 μL (18 MΩ 탈 이온 및 증류수 H 2<....
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결과
우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A 에 나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporation 후 24 H 확인하고 그림 1B에 표시 됩니다. R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 플라스미드를 표적으로 주입하면 특정 청각 뇌간 영역, 즉 NM 및 NL (11) 에서 발현이 가능합니다. 그림 1C 는 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 조명 하에서 E12 태아의 체외 뇌간 슬라이스를 보여줍니다. 청각 영역은 윤곽이 그려져 있습니다. 형광 조명 ( .......
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토론
비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 수있는 배아를 주입. otocysts가 보이지 않는 경우 배아는 electroporation에 대한 올바른 발달 단계에 있지 않습니다. 둘째, 작은 피펫 팁을 사용하면 신경 튜브에 쉽게 침투하여 조직 손상을 줄일 수 있습니다. 그러나 깨진 팁은 DNA를 배출하기에 충분히 커야합니다. 셋째, R5 / R6 위에있는 전체 신경관 영역을 DNA로 채 웁니다 (빠른 녹색 솔루션의 확산으로 시각화 됨). 마지막.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 수정 화이트 레그혼 치킨 달걀 | Sunnyside Inc. (위스콘신주 | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, 단일 또는 이중 채널 |
| 전류/전압 자극기 | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil 주사기 바늘 | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 게이지, 67 mm 길이, (5개 팩) |
| 전극 홀더 | Warner Instruments | 64-1280 | MP 시리즈: 비전기적 압력 응용 프로그램 |
| 미세 전극 자극 | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| 공기 탱크/조절기 | NU 실험실 서비스 | 공기 건조 300 CF | |
| 패스트 그린 | 시그마 Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| 투명 플라스틱 테이프 | 스카치 | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| 계란 냉장고 | Vissani 와인 냉장고 | 13.3 - 16.1 ° C (56-61° F) | |
| 인큐베이터 | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% 습도 | |
| 해부 스코프 | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 현미경, 50.4X |
| 냉광원 | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | 모델: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | 두꺼운 벽의 붕규산염(치수) |
| 주사기 | 1 mL, 3 mL | ||
| 바늘 | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| 펜치 | 스톨팅 | No. 5 슈퍼 파인 Dumont | |
| 알 홀더 | 맞춤형 | 점토 베이스도 작동합니다 | |
| 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument | 모델 P-97 | |
| 주사기 필터 | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μ 중 |
참고문헌
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al.
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재인쇄 및 허가
