방법 논문

DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

DOI:

10.3791/55634

⸱

2017년 5월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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생물학적 시료에서 줄기 세포 집단의 특성 분석 및 분리를 허용하는 방법은 암 및 그 이상에서 줄기 세포 표적 처리의 발전에 중요합니다. 여기에서 우리는 염료에 의해 유발 된 부작용 표현형을 사용하는 암 줄기 세포 분리를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

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암은 줄기 세포 중심 질병이며이 세포의 박멸이 주요 치료 목표가되었습니다. Cancer Stem Cells (CSCs)의 취약성을 해독하고 적절한 분자 표적을 확인하는 것은 세포주 및 생체 외 종양 조직과 같은 이종 시료에서 특유한 차별을 허용하는 방법에 의존합니다. 유동 세포 계측법 / FACS는 단일 세포 수준에서 생물학적 시료를 다중 매개 변수 분석하는 강력한 기술이며 하류 분석을 위해 살아있는 세포를 회수 할 수있는 최신 방법입니다. 알데하이드 탈수소 효소 효소 활성의 검출뿐만 아니라 CD44 및 CD133과 같은 표면 마커는 종종 FACS에 의한 종양 샘플로부터의 CSC를 정의하고 분류하는데 사용되어왔다. 방법 론적 세부 사항에서 여기에 묘사 된 보완적인 접근법은 ABC 약물 전달체에 의한 기능성 염료 압출을 사용하며, 이는 측면 집단 (SP)으로 일반적으로 불리는 형광성 세포의 개별 집단을 확인합니다. SP암세포는 표준 줄기 세포 특징을 나타내고, 염료 압출 약물 전달체 (가장 빈번하게 ABCB1 / P- 당단백 / MDR1 / CD243 및 ABCG2 / Bcrp1 / CD338)를 억제하는 제제를 사용하여 폐색되고 기능적으로 확인 될 수있다. 또한 SP 분석법은 표면 항원 염색, 알데하이드 탈수소 효소 검출 및 사상 세포 판별 ( 예 : 7-AAD 또는 propidium iodide (PI))과 같은 다른 유동 세포 계측법 평가와 호환됩니다. 따라서 우리는 표현형 매개 변수가 아닌 기능적으로 기계적으로 CSC 식별, 격리 및 하위 특성화를위한 가치 있고 광범위하게 적용 가능한 방법을 설명합니다. 원래 Hoechst 33342를 트리거링 염료로 사용해 왔지만 여기에서는 보라색 레이저 소스가 장착 된 모든 유동 세포 계측기에서 분해 할 수있는보다 최근의 Violet 염료 기반 SP 표현형에 초점을 맞 춥니 다.

서론

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1 차 암 치료법의 효능은 질병의 유전 및 분자 이해의 진보와 치료 용 항체 및 소분자 억제제와 같은 표적 약물의 출현으로 인해 지난 10 년 동안 상당히 향상되었습니다. 대조적으로, 전이성 및 재발 성 질환은 여전히 ​​치료가 불가능하고, 이환률 및 사망률은이 임상 환경에서 여전히 높습니다. CSCs는 종양 내의 분명한 하위 집단을 대표하고 clonogenicity / tumorigenicity, 다중 약물 저항 및 비대칭 세포 분열과 같은 표준 줄기 세포 특성을 부여받습니다. 따라서 CSC는 전이성 진행과 종양 이질성을 촉진 할뿐만 아니라 환자가 재발하는 경향이있는 치료 중에도 지속됩니다. 그러므로 치료 CSC 제거는 질병 재발을 예방하고 암의 장기 치료를 가능하게하는 중요한 의학적 필요성이다. .

취약성 식별 및 CSC 퇴치 전략의 설명은 후속 발현 프로파일 작성 및 / 또는 기능 조사를 위해 생물학적 샘플로부터 정제 할 수있는 방법에 크게 의존합니다. 차례로, 그러한 방법은 이들 세포에 특이적인 표면, 세포 내 또는 기능성 마커에 의존한다. CSC 특이적인 표면 마커는 CD44, CD133, CD24 및 CD90을 포함하지만 이에 국한되지 않고 유방암 및 대장 암을 포함한 다양한 종양 개체에서 CSC 개체군을 확인하는 데 사용되었습니다. 또 다른 마커, 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 세포 내 국소화를 보여 주며 효소 전환이 빛을 생성하는 각각의 기질을 제공하여 기능적으로 검출 될 수 있습니다. 이 검사를 사용하여 CSC 집단은 다양한 종양 개체에서도 확인되었습니다. 일반적으로 SP 분석이라고도하며 여기에서 묘사 된 보완적인 방법 ethodological 세부 정보, 형광 염료 줄기 같은 세포의 작은 인구를 식별하는 ABC 약물 전송에 의한 활성 염료 유출을 활용 6 , 7 , 8 . 이를 위해, 주어진 샘플을 수동 확산을 통해 모든 세포로 들어가는 친 지질 성 DNA 결합 형광 단의 존재 하에서 배양하고, 결합을 위해 핵 및 미토콘드리아 DNA를 표적으로한다. ABC 약물 전달체 발현이없는 비 -CSCs는 형광을 감소시키는 염료를 축적하는 반면, CSC는 형광을 감소시키는 염료를 능동적으로 압출한다. 약물 전달체 활성의 약리학 적 억제는 SP 표현형을 폐기하고 기능적으로 확인하며 대조 목적으로 사용해야한다. SP 특성을 나타내는 CSC 개체군이 난소 암 9 , 10 , 전립선 암 11 ,> 12, 유방암 13 , 폐암 14 , 자궁 내막 암 15 , 신경아 교종 16 , 17 및 뼈 육종 18 . 중요한 물질은 비록 특정 종양 세포 판별 전략 (특정 숙주 세포 집단이 SP 특성을 나타낼 수 있음)과 같은 추가적인 문제를 제기하지만, SP 분석은 암 세포주와 원발 종양 조직 모두와 양립 할 수 있습니다 19 , 20 .

두 가지 가장 확립 된 SP- 부여 약물 전달체는 ABCB1 / P- 당단백 / MDR1 / CD243 및 ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8,9,21; 그러나 다른 약물 전달체도 SP 표현형 ( 예 : ABCB5)의 분자 결정 인자 일 수 있습니다 22 . ABCB1ABCG2의 활성이 fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 로 특이 적으로 제거 될 수있는 반면, 베라파밀로 효과적으로 차단 될 수있다. SP 분석의 특별한 강점은 다른 염색 ( 예 : 표면 마커 및 ALDH)과 결합 할 수 있으며 살아있는 세포 복구가 가능하므로 하위 기능 조사와 호환된다는 것입니다. 더욱이, SP 검출은 CSC 집단 중 ABC 약물 전달체의 높은 보존으로 인해 광범위하게 적용 가능하다.

원래 SP 검출은 Hoechst 33342를 유발 염료로 사용하여 수행되었습니다 24 . 이 염료는 우수한 해상도를 달성하지만 자외선 레이저 여기가 필요합니다. 따라서 그 적용 성은 하이 엔드 유동 세포 계측기에 자연적으로 제한됩니다. DyeCycle Violet (DCV) 25 의 도래는 새로운 Avenu(자외선 레이저 소스가 DCV-SP 세포를 분해하기에 충분 함)가 부족한 표준 유동 세포 계측기구에이 방법의 적용 가능성을 확장시켰다. 중요하게도 Hoechst 33342와 DCV는 일반적인 펌프 특이성을 공유하므로 두 염료 모두 동일한 세포 집단을 식별해야합니다.

여기서는 DCV 기반 SP 분석에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제공하여 독립적 인 실험실에서 쉽고 빠르게 재생산 할 수 있습니다. 따라서 우리는이 유용한 세포 생물학적 방법의 최적화 및 표준화에 기여해야하는 CSC 연구원을위한 자료로 우리의 논문을 인식합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 표준 기관의 윤리적 검토위원회 지침을 완전히 준수합니다. 여기에 묘사 된 프로토콜을 사용하여 인간 또는 동물 조직을 조사하는 경우 연구자는 해당 기관 또는 국가의 관련 검토위원회의 승인을 받아야합니다.

주의 : 생물학적 시료의 안전한 취급에 대한 표준 예방 조치가이 프로토콜에 적용됩니다. 여기에는 장갑과 실험복을 착용하고 가능한 한 바이오 안전성 캐비닛 아래에서 작업을 수행하는 것이 포함됩니다.

1. 세포의 준비

  1. 암 세포주
    1. 적절한 매체 ( 예 : 10 % ( V / V ) FBS, 2 MM L - 글루타민과 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충 RPMI 1640) 10-30 ML 37 ° C에서 각각의 인간 또는 마우스 암 세포주를 문화와 수확 0.05 % 트립신 -EDTA 또는 다른 일부 de-att로 소화를 사용하는 아 집단 ( 즉, 70-90 %)에서의 세포감사 절차. 카운팅 챔버와 트리 판 블루 얼룩을 사용하여 세포 수를 결정하고 생존력을 확인하십시오. 생존 세포의 비율은 85 %를 초과해야합니다.
      참고 : SP 구획을 ​​포함하는 인간 암 세포주의 예에는 MCF7 / HTB-22 및 SKBR3 / HTB-30 (유방암), A2780 및 SKOV-3 / HTB-77 (난소 암) 및 A549 (폐암) 26이 포함 됩니다.
  2. 생체 외 종양 조직
    1. 신선한 외과 종양 표본을 가져 가거나 또는 이식 가능한 또는 유 전적으로 조작 한 마우스 종양 모델에서 종양 조직을 수확하십시오. 200-1,000 mg의 조직을 가져 와서 기계적 분해 ( 예 : 가위 또는 메스 사용) 및 효소 분해 ( 예 : collagenase / dispase / DNase 칵테일 사용)를 통해 단일 세포 현탁액을 생성하십시오.
    2. 샘플을 70 μm 컷오프 여과기로 여과하십시오. 셀 수를 결정하고 카운팅 챔버 및 트리 팬 (trypan)을 사용하여 생존력을 확인하십시오ue 염색법.
      참고 : 소화 칵테일에는 종종 200 μg / mL 콜라게나 제 P, 0.8 U / mL 디스 패제 및 25 μg / mL DNase I가 포함되며 배양 시간은 일반적으로 20 - 50 분 사이입니다. 이상적으로, 조직 분해는 조사중인 조직에 대해 최적화 된 프로토콜 27 , 28 , 29에 따라 수행 됩니다.

2. 샘플 테스트

  1. 신선한 배지에서 세포 농도를 1 x 106 세포 / mL로 조정하십시오 (염료 압출은 활성 에너지를 소비하는 과정에서 중요합니다). 마지막으로, 1mL의 샘플을 일반 유동 세포 계측법 / FACS 둥근 바닥 튜브 ( '테스트'로 표시)로 옮긴다.
    참고 : 최적의 결과를 얻으려면 세포 농도를 적정해야합니다 (예 : 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 106 세포 / mL). 그러나보다 낮은 세포 농도더 높은 해상도 19 . 최대 수의 SP 세포가 회수되어야하는 분류 용도에 대해서만 세포 농도를 1 x 107 세포 / mL까지 증가시키는 것이 좋습니다.
  2. 10 μM의 DCV를 샘플에 첨가하고 부드럽게 볼 텍싱하거나 3 ~ 5 배 재현하여 잘 섞는다. 억제 컨트롤로 진행하십시오.
    참고 : 최적의 결과는 트리거링 염료 (예 : 2.5; 5; 10; 20 μM)의 적정에 따라 달라질 수 있지만 일반적으로 염료 농도가 높을수록 해상도가 더 높아집니다.

3. 억제 컨트롤

  1. 염료 함유 세포 현탁액 250 μL를 새로운 유동 세포 계측법 / FACS 둥근 바닥 튜브 ( '대조군'으로 표시)에 옮긴다. 50 μM의 verapamil 또는 20 μM의 FTC를 첨가하고 pipetting으로 잘 섞는다.
    참고 : Verapamil과 FTC는 SP 분석을 위해 가장 잘 확립 된 억제제이지만 다른 유출 펌프 특성y : 베라파밀은 ABCB1과 ABCB5를 포함한 몇 가지 ABC 약물 전달체를 억제하는 반면, FTC는 ABCG2 6 , 19 에 특이 적이다. 개별 샘플의 SP 상태가 알려지지 않은 경우 별도의 튜브에서 verapamil과 FTC를 모두 사용하는 것이 좋습니다.

4. 염색

  1. '테스트'및 '컨트롤'튜브를 모두 막아서 37 분간 37 ° C에서 어두운 곳에서 90 분 동안, 15 분마다 부드럽게 교반하십시오. SP 세포에서 염료 압출의 대부분은 처음 45 분 이내에 발생하지만 비 SP 세포 (해상도에 기여)의 염료 축적은 75-90 분 19 후에 최대입니다.
  2. 얼룩이 완료되면, 3-4 ML 얼음으로 차가운 PBS에 세포를 씻어 100 μL (PBS뿐만 아니라)의 볼륨에 펠렛을 resuspend. 세포를 어둠에 보관하고 얼음 위에서 식힌 다음 추가 마커를 염색합니다. 또는 직접적으로 flow cytometric ana를 수행하십시오용해.

5. 다른 마커에 대한 비용

  1. DCV - 스테인드 세포에 fluorochrome - 복합 항체의 원하는 패널을 추가 잘 혼합하고 4 ~ 20 분 동안 암흑에서 C를 품어. 3 - 4 ML 얼음으로 차가운 PBS에 세포를 씻어 죽은 세포 차별로 진행합니다.
    참고 : DCV와 쉽게 호환되고 보상을 필요로하지 않는 항체는 PerCP 또는 PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 및 BV786 . DCV와 호환되지만 보상이 필요할 수있는 형식에는 FITC, Alexa Fluor 488, PE 및 BV650이 포함됩니다. 사실상 DCV와 호환되지 않는 형식으로는 BV421, V450 및 V500이 있습니다.
  2. 특정 제조 업체가 권장하는 농도로 DCV로 염색 된 세포에 7-AAD (또는 PI)를 첨가하고 어둠 속에서 5 ~ 10 분 동안 표본을 품을 수 있습니다. 70 μm 컷 - 오프 strainers 통해 샘플을 필터링하고 흐름 cytometric 분석을 진행합니다.

6. 플로우 사이토 메트릭 분석

참고 : 샘플 준비가 완료되는 즉시 모든 염색계가 설정되도록 염색 과정 중에 각 유세포 분석기를 켜는 것이 좋습니다. 여기에는 시스템 성능 추적 및 탱크 재충전과 같은 표준 유지 관리 절차도 포함됩니다.

  1. 유동 세포 계측기에서 세포를 취득하고 bivariate FSC / SSC 도트 플롯 (그림 1B)에서 그들을 게이트. FSC의 다른 신호 ( 즉, 높이, 너비, 면적)를 비교하여 doublets 및 aggregates를 제외합니다 (그림 1C).
    1. 죽은 세포 마커가 포함 된 경우, 생존 가능한 세포 분획 ( 예 : 7-AAD- 음성)에 게이트가 삽입됩니다 ( 그림 1D ). '파란색'및 '빨간색'DCV 방출에 대해 이중 변이 점 그림에서 생존 가능한 단일 세포를 시각화합니다. 이를 위해 y 축 ( 예 : 450/50)에 '파란색'형광 채널을 표시하고 '적색 '형광 채널 ( 예 : 525/50).
    2. 두 채널을 선형 모드로 전환하고 SP가 왼쪽 하단 사분면의 플롯 측면 에 위치하도록 검출기 전압을 그에 따라 조정합니다. 반대로, non-SP는 세포주기 분포 (G1 및 G2)를 반영하는 플롯의 오른쪽 위 사분면에 위치합니다. SP를 게이트하고 획득을 중지하십시오 ( 그림 1E ).
      참고 : DCV 정의 SP 세포는 보라색 레이저 여기 소스 ( 예 : 405 nm 레이저 라인)가 장착 된 유동 세포 계측기를 사용하여 감지 할 수 있습니다. 방출 된 형광은 선형 모드와 2 변수 도트 플롯에 표시된 2 개의 개별 채널에서 측정되는 것이 SP 분석의 특유한 것입니다. DCV의 '청색'방출은 약 450 nm에서 측정되며 ( 예 : 450/40 표준 필터로 측정) DCV의 '적색'방출은 약 510-585 nm에서 측정됩니다 ( 예 : 510/50, a 525/50 또는 585/15 필터) 19 . 분석의 특수한 화학적 특성으로 인해 SP와 비 SP 세포 사이의 분리는 일반적으로 '적색'형광 채널 19 에서 더 높습니다.
  2. 금지 컨트롤을로드하고 데이터를 획득하십시오. SP 세포는 이제 사라 졌거나 실질적으로 감소되었습니다 ( 그림 1F ). 필요한 경우이 데이터를 기반으로 SP 게이트를 수정하십시오.
  3. SP 세포에 의한 표면 마커 발현을 조사하기 위해, x 축 상에 DCV의 '적색'형광을 남겨두고 대수 모드 ( 예 : APC)에서 y 축 상에 각각의 형광 채널을 표시한다. 대응 검출기 전압을 조정하고 연구 마커 (들) ( 그림 1G )에 대한 긍정적 인 얼룩이 SP 세포의 분율을 게이트. SP 세포에 의한 특정 마커의 동시 발현은 플롯 30 의 좌측 상부 사분면에서 각각의 신호를 산출한다.
  4. 기록데이터를 수집 및 / 또는 정렬 할 수 있습니다.

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결과

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A2780 세포의 대표적인 SP 분석은 이전에 세포의 1 % 미만을 차지하는 SP를 보유하고있는 것으로 보이는 인간 난소 암 세포주 9) . 세포를 10 % ( v / v ) FBS, 2 mM L- 글루타민 및 1x 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 1640에서 37 ℃에서 배양하고, 0.05 % 트립신 -EDTA로 처리하여 85 % 컨 플루 언시에서 수확 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 70 μm cut-off strainers로 여과 하였다. 세포 수는 계수 챔버를 사용하여 결정되었고 trypan blue 염색법과 1 x 106 세포 / mL (신생 배지)를 어두운 곳에서 37 ℃에서 90 분 동안 10 μM DCV로 염색 하였다. 병행하여, 동일한 분량을 정확히 같은 조건하에 20 μM FTC의 존재하에 배양 하였다. 세포를 4 mL PBS로 세척하고 ABCG2에 대한 APC- 접합 항체를...

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토론

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암의 임상 관리의 진행은 또한 CSCs를 타깃으로하는 치료 양식 개발에 달려있다. 생물학적 시료로부터 CSCs의 신뢰성있는 분리를 가능하게하는 방법은 적합한 표적의 동정을 가속화 할 것이므로이 노력에서 매우 중요합니다. SP 분석은 ABC 약물 전달체를 발현하는 CSC 집단을 확인하기위한 확립되고 가치있는 기술이며 DCV의 구현은 표준 유동 세포 계측 도구에 대한 적용 가능성을 확장 시켰습니다. 기계적으로, SP 구별은 ABC 약물 전달체에 의한 활성 염료 유출을 이용하여 낮은 형광에 기초한 CSC를 검출하여 대응하는 비 SP에 잔류하는 꼬리의 측면 에서 특징적인 위치 파악을 수반한다. 중요한 것은 DCV 기반의 SP 검출은 강력하고 직접적인 방법으로 가장 중요한 단계는 (i) 세포 준비 (ii) 염색 과정 (iii) 적절한 억제제 선택(iv) 유동 세포 계측 분석. 염료 압출은 활성 에너지를 소비하는 과정이기 때문에 특히 좋은 세포 생존력으로 시작하는 것이 적절합니다. 생존 가능한 (약물 전달...

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공개 사항

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저자는 선언 할 이해 관계가 없습니다. 원고 작성에는 비 저자가 개입하지 않습니다.

감사의 글

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Maximilian Boesch는 Austrian Science Fund FWF의 Erwin Schrödinger Fellows (승인 번호 J-3807)의 지원을받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Vybrant DyeCycle VioletThermo Fisher ScientificV35003사용 준비 완료
베라파밀 하이드로클로라이드Sigma-AldrichV4629에탄올에 용해
Fumitremorgin CSigma-AldrichF9054DMSO
7-AAD (또는 프로피듐 요오드화물 - PI)에 용해BioLegend420403즉시 사용 가능
표준 세포 배양 시약(예: , 배지, FBS, L-글루타민, 항생제, PBS, 트립신-EDTA, etc.)다른 공급업체
샘플/관심 세포(예: , 인간 또는 쥐 암 세포주, 인간 또는 쥐 종양 조직)다른 공급업체
세포 분석 기기(FACS; 분석기 또는 세포 분류기)다른 공급업체바이올렛 레이저 소스 필요
FACS 튜브 (둥근 바닥)다른 공급 업체캡이있는 튜브 권장
70 µ m 컷오프 스트레이너공급업체선택적이지만 권장되는
소화 효소 혼합물(<예: >, 콜라겐분해효소/디스파제/Dnase)공급업체조직 해리에만 관련
표면 마커에 대한 플루로크롬 접합 항체공급업체 옵션
ALDEFLUOR KitSTEMCELL 기술01700옵션
유마다 마다 관심

참고문헌

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