Method Article

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석 Xenopus tropicalis

DOI:

10.3791/55652

⸱

May 25th, 2017

 , 
1Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anatomy, Brain Research Institute, Yonsei University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

Abstract

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혈관은 몸 전체에 산소와 영양분을 공급하며 혈관 네트워크의 형성은 엄격한 발달 조절하에 있습니다. 혈관의 효율적인 생체 내 시각화 및 그 복잡성의 신뢰할 수있는 정량화는 혈관 네트워크의 생물학 및 질병을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료 인 인간 혈장 아세틸 화 저밀도 지단백 DiI 복합체 (DiI-AcLDL)를 사용하여 혈관을 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하는 자세한 방법을 제공합니다. 혈관은 DiI-AcLDL을 배아의 심장 박동에 간단히 주입하여 표시 할 수 있으며 전체 배아의 혈관을 생체 또는 고정 배아에서 영상화 할 수 있습니다. 핵산의 표적 미세 주입 및 / 또는 약리학 적 시약의 배양 적용에 의한 유전자 교란과 결합하여, 혈관 발생에 대한 유전자 또는 신호 전달 경로의 역할을 수행 할 수있다정교한 유전자 조작 동물에 의지하지 않고 1 주일 이내에 징계 조치를 취했다. 잘 정의 된 Xenopus의 정맥 시스템과 그 고정 관념의 혈관 신생, 기존 혈관의 싹 트기 때문에 혈관의 복잡성은 섭동 실험 후에 효율적으로 정량화 될 수 있습니다. 이 비교적 단순한 프로토콜은 심혈관 연구 분야의 다양한 분야에서 쉽게 접근 할 수있는 도구가되어야합니다.

Introduction

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Vasculogenesis, 새로 태어난 endothelial 세포에서 새로운 혈관의 형성, angiogenesis, 선재 혈관에서 새로운 혈관의 형성은 배아 vasculature 1 모양의 두 개의 독특한 프로세스입니다. 이러한 과정에서의 조절 장애는 다양한 심장병 및 혈관의 구조적 비정상을 초래합니다. 또한, 종양 성장은 통제되지 않은 혈관 성장과 관련이있다. 이와 같이, 혈관 신생 및 혈관 신생의 기초가되는 분자 기작은 강렬한 연구 2 의 대상이다.

Xenopus 와 zebrafish는 몇 가지 이유로 vasculogenesis 및 angiogenesis 연구에 대한 매력적인 척추 모델입니다. 첫째, 그들의 배아는 작습니다. 따라서 전체 vasculature를 이미지화하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 둘째로, 배아 발달은 빠릅니다. 전체 vasculature가 발달하는 데에는 며칠이 걸리고, 그 동안에 개발 vascul ature를 이미지화 할 수 있습니다. 셋째, antisense morpholino nucleotides (MOs)를 발달중인 배아 또는 약물의 목욕 적용을 통한 미세 주입 (microinjection)과 같....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험은 연세대 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을받은 프로토콜을 따랐다.

1. Xenopus tropicalis 태아의 준비

참고 : Xenopus tropicalis 배아는 약간의 수정과 함께 이전에 설명한대로 생산되었다. Xenopus tropicalis 배아는 Nieuwkoop과 Faber 11 의 표에 따라 상연되었다.

  1. 배란 유도
    1. 프리 프라이밍 (pre-prime)을 위해서는 짝짓기 당일 전날 한 쌍의 개구리 (남성 1 명과 여성 1 명)의 등쪽 림프구에 인간 chorionic gonadotropin (hCG)을 주입하십시오. 암컷 개구리 당 20 개체, 수컷 당 10 개체를 주입합니다. 남자와 여자를 같은 수조에 밤새 머물게하십시오 (18 시간 이상 동안).
    2. 프라임을하려면 다음 날 200 개의 hCG를 미리 준비된 여성에게 주입하고 100 개의 hCG를 미리 준비된 여성에게 주입하십시오남성; 준비가 끝난 암컷은 약 3 시간 이내에 알을 낳기 시작할 것이고 하루 종일 그렇게 할 것입니다. 수컷과 암컷 쌍을 자연 교배를 위해 또는 ....

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Results

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실험 일정 (그림 1 및 2)

수정 직후, 유전자 발현을 조절하기 위해 표적화 된 미세 주입이 수행 될 수있다. 예를 들어, 내인성 Tie2 mRNA의 개시 코돈에 특이 적으로 결합하는 안티센스 MO가 입체 장애에 의해 Tie2 표적 mRNA의 번역을 억제하여 주입 될 수있다. MO는 성공적으로 주사 된 배아의 쉬운 육안 검사를 위해 플루오 레세 인에 접합 될 수있다. 또는 추적자 mRNA ( 예 : EGFP를 코딩하는 mRNA)를 MO와 함께 주입 할 수 있습니다. 또한, 부화 후 목욕 용품으로 약물을 치료할 수 있습니다 (초기 테일 버드 단계, NF 단계 26 주변). 0.1x MBS에 약물을 녹여 배아에 첨가하십시오. 초기 치료를 위해 배아는 한 쌍의 집게로 막으로부터 해방 될 수 있습니다. DiI-AcLDL은 혈관 형태의 역학을 조사하기 위해.......

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Discussion

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여기에 제시된 프로토콜은 Xenopus laevis 4 에서 혈관 형성 중 발달 과정을 조사하기 위해 Ali H. Brivanlou와 동료에 의해 처음 개발되었지만이 원고에 표시된대로 다른 작은 동물에도 적용 할 수 있습니다. 심장에 염료 주입은 수행하기 쉽고, 전체 혈관 네트워크는 공 촛점 현미경뿐만 아니라 형광 해부 현미경으로 이미징 할 수 있습니다. 염색이 배 발달 동안 심장으로 주입되면, 혈관 성장과 분지의 동력이 실시간으로 영상화 될 수 있습니다 4 . 잘 정의 된 정맥 네트워크, 특히 PCV와 주동맥 대부분의 ISV를 사용하여 혈관 신생에 대한 유전 적 또는 환경 적 섭동의 영향을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 DiI-AcLDL의 주입입니다 (4 단계). 성공적인 주사와 실패한 주사의 예를 제공합니다 ( Fi

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Levine et al. ,이 실험 방법을 설명하고 Xenopus laevis 에서 혈관 개발에 대한 포괄적 인 설명을 제공했습니다 . 우리는 실험실 구성원의 의견을 감사드립니다. 이 연구는 2015 년 미래의 연구 이니셔티브 (2015-22- 0095)와 과학, ICT 및 미래 기획이 자금을 지원하는 국립 연구 재단 (NRF)의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램 NRF-2013M3A9D5072551)

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35mm 페트리 접시SPL10035실가드 몰드 프레임
60mm 페트리 접시SPL10060배아 올리기 트레이
붕규산 유리셔터 기기B100-50-10주입 용 바늘
BSASigmaA3059-10G코팅 시약
CaCl2D.S.P.GR 시약0.1x MBS 구성 요소
CoverslipSuperiorHSU-0111520컨포칼 이미징
용 DiI-AcLDLThermo Fisher ScientificL3484용기 염색 용액
FBSHycloneSH.30919.02고환 보관용
광섬유 조명기세계 정밀 기기Z-LITE-ZLight
FicollSigmaF4375주입 버퍼
불타는 / 갈색 마이크로 피펫 풀러셔터 기기P-97주입 바늘 풀러
집게Fine Science Tool11255-20배아 부화 및
바늘 팁 절단
유리 바닥 접시SPL100350컨 포칼 이미징 hCG
MNS 한국개구리 프라이밍 용
HEPESSigmaH3375완충제
IncubatorLab. CompanionILP-02배아 배아 증강제
KClDAEJUNG6566-4400MBS 구성 요소
L15 매체Gibco11415-114고환 보관용
L-시스테인Sigma168149-100G젤리 제거 시약
MgSO4SigmaM7506MBS 구성 요소
MicrotubeAxygenMCT-175-C-S고환 저장용
MS222SigmaE10521마취 분말
NaCl대정7647-14-5MBS 성분
NaOHSigmaS-0899pH 조정 시약
파라포름알데히드SigmaP6148정착제
PBSBIOSESANGP2007pH 종이 이미징용 버퍼
SigmaP4536-100EApH
PICO-LITER 주입기Waner 기기PLI-100A주입용
핀서비스26002-10절개용
핀홀더Scitech Korea26016-12절개용
정밀 스테레오 줌 양안 현미경세계 정밀 기기PZMIII시력 검사용
표준 수동 제어 마이크로 매니퓰레이터 Waner instrumentsW4 64-0056마이크로 주입
SYLGARD 184 KitDow CorningDiI 주입
트랜스퍼 피펫한국 에이스 사이언티픽음. B78-400난자 및
배아 채취용
: , , , 확인용 (주)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascu....

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Xenopus tropicalisBlood Vessel VisualizationDiI AcLDL InjectionFluorescent Dye LabelingVascular Network AnalysisEmbryonic AngiogenesisConfocal MicroscopyVein Complexity IndexGene PerturbationPharmacological Application

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