방법 논문

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

DOI:

10.3791/55700

⸱

2017년 8월 3일

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

이 논문에서

요약

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우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.

초록

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부고환은 정자 성숙과 생식 건강에 필수적인 기관입니다. 부고환 상피 세포는 분자와 형태 학적 특징뿐 아니라 생리 학적 특성에서도 뚜렷한 복잡하게 연결된 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 차이점은 부고환 내강에서 사후 정자의 발달에 필요한 미세 환경을 함께 구성하는 다양한 기능을 반영한다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특성에 대한 이해는 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서 정자 및 생식 건강에서의 기능을 밝히는데 중요하다. 그들의 기능적 특성은 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 부고환 상피 세포는 단일 세포의 세포 성질 및 막 특성을 측정하기위한 도구 인 패치 클램프 기술을 사용하여 연구 할 수있다. 여기서 우리는 세포 분리 및 전체 세포 패치 클램프 기록 방법에 대해 설명합니다쥐 cauda epididymides에서 일차 분리 된 상피 세포의 전기적 특성을 확인하십시오.

서론

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남성 생식 기관의 부고환은 모자이크 상피 세포 층이 늘어서있는 기관입니다. 다른 상피 조직에서와 마찬가지로, 주요 세포, 클린 세포, 기저 세포 및 면역계 및 림프계로부터의 세포를 포함하는 부고환 상피의 다양한 세포 유형은 세관 최전선에서 장벽으로서 기능하도록 협조 된 방식으로 작용하며, 정자 성숙 및 생리학을위한 세포 지원 1 , 2 , 3 . 따라서 이러한 상피 세포는 재생산 건강에 필수적인 역할을합니다.

상피 세포는 일반적으로 전위가없는 Na + 또는 Ca 2+ 채널이 없기 때문에 탈분극 자극에 반응하여 모든 또는 전혀 작용하지 않는 전위를 생성 할 수없는 비 흥분성 세포로 간주됩니다 4 , 5 . 그러나, 상피 세포는 유니분비 및 영양소 운반과 같은 전문화 된 생리적 인 역할을 조절하는 이온 채널 및 운반자 세트 6 . 따라서 상이한 상피 세포는 특징적인 전기적 특성을 갖는다. 예를 들어, 주요 세포는 유체 및 염화물 수송을위한 CFTR을 표현하고 칼슘 재 흡수를위한 TRPV6를 발현하지만, 맑은 세포는 내강 산성화 1 , 7 , 8 , 9에 대해 양성자 펌프 V-ATPase를 발현합니다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특징을 조절하는 일부 전달자와 이온 채널이보고되었지만 부고환 상피 세포의 기능적 성질은 아직 많이 밝혀지지 않았다 10 , 11 , 12 , 13 .

ㅁㅁ올 셀 패치 - 클램프 기록은 흥분성 및 비 흥분성 세포의 본질 특성을 조사하기위한 잘 확립 된 기술이며 특히 이종 세포 샘플에서 주로 해리 된 세포의 기능을 연구하는데 유용합니다. 전압 클램프는 단일 막 14 및 15 의 수동 막 특성 및 이온 전류를 측정하는 데 사용됩니다. 수동 막 특성에는 입력 저항 및 커패시턴스가 포함됩니다. 전자의 매개 변수는 고유 멤브레인 컨덕턴스를 나타내지 만, 후자는 세포막의 표면적 (이온 채널 및 운반자가있는 인지질 이중층, 세포 외 및 세포 내 매체를 분리하는 얇은 절연체로 사용됨)을 의미합니다. 막 커패시턴스는 세포막의 표면적에 직접적으로 비례합니다. 입력 저항에 의해 반사되는 멤브레인 저항과 함께 멤브레인 시정 수 which는 세포막 전위가 이온 채널 전류의 흐름에 얼마나 빨리 반응 하는지를 나타낼 수 있습니다. 이와 관련하여, 세포에 적용된 일련의 전압 단계로부터의 전류 응답 특성을 조합함으로써, 생물 물리학 적 동력학 및 세포의 특성이 15 , 16 , 17 , 18로 결정된다 .

본 논문에서는 rat cauda epididymis로부터 상피 세포를 분리하는 절차와 whole cell patch-clamp를 사용하여 해리 된 세포 혼합물에서 각기 다른 세포 유형의 막 특성을 측정하는 단계를 설명한다. 우리는 부고환의 주요 세포가 명확한 막 전기 생리학 적 성질을 나타내며 컨덕턴스가 다른 세포 유형으로부터 쉽게 확인 될 수 있음을 보여줍니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 지역 및 국제 요구 사항을 충족하는 ShanghaiTech University 기관 동물 사용 및 사용위원회의 지침에 따라 수행됩니다.

1. 실험 동물

  1. 8-12 주 사이에 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐 (~ 300-450 g)를 사용하십시오. 쥐의이 나이에, 정자는 cauda epididymides에 도착했습니다.

2. 쥐 Cauda Epididymides에서 상피 세포의 분리

참고 : 달리 명시되지 않는 한 무균 조건에서 다음 단계를 수행합니다.

  1. 해부기구 및 시약 준비
    1. 해부 도구를 70 % 에탄올에 담가 소독하고 공기를 건조하게하십시오.
    2. 온난 욕을 켜십시오 (32 ° C); 1 % (v / v) 항체가 보충 된 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (RPMI) 500 mL를 준비하고 예열하십시오.tic (100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 최종 스트렙토 마이신)로 표지하고 "RPMI (+ P / S 1 : 100)"로 표시 하였다. 깨끗한 공기 흐름 제어 작업장에서이 단계를 수행하십시오.
    3. 비 필수 아미노산 (0.1 mM)과 피루브산 나트륨 (1 mM)을 함유하고 5-α-dihydrotestosterone (1 nM), 10 % 태아 소를 첨가 한 1 x 500 mL Iscove Modified Dulbecco 's Medium (IMDM) 혈청, 1 % (v / v) 항생제 (100 U / mL 페니실린 및 100 ㎍ / mL 최종 스트렙토 마이신)로 표지하고, "Full-IMDM"으로 표지 하였다. parafilm으로 50 mL 분취 량을 만들고 밀봉하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 무균 상태를 사용하십시오.
    4. 콜라게나 제 타입 I 및 콜라게나 제 타입 II를 RPMI (+ P / S 1 : 100)에 용해시켜 콜라게나 제 효소 분해 용액을 제조하여 용액 중의 각 콜라게나 제를 1 mg / mL로 만든다. 0.22 μm의 막을 통해 여과하고 "Collagenase Solution"으로 표시하십시오. 사용하기 전까지 실온 (RT)을 유지하십시오. 효소 용액의 부피 조절효소의 중량; 한 마리의 쥐에서 양 cauda epididymides에 필요한 최소한의 부피는 2 mL입니다.
    5. RPMI (+ P / S 1 : 100)로 35mm 접시를 채 웁니다.
  2. 쥐 cauda epididymides의 해부
    1. 동물이 꼬리 - 꼬집음 자극에 반응하지 않을 때까지 나트륨 pentobarbital 85 MG / kg의 IP를 사용하거나 isoflurane 챔버를 사용하여 동물을 희생; 자궁 경관 탈구로 따라 가라.
    2. 하복부를 70 % 에탄올로 소독하고 두 개의 고환을 하복부에 부드럽게 밀어 넣은 다음 하악 복부를 음낭 근처로 연다.
    3. epididymal fat을 집어 내고 생식 기관 (고환, epididymides 및 vas deferens) 전체를 해부하고 RPMI (+ P / S 1 : 100)로 접시에 담그십시오.
    4. RPMI (+ P / S 1 : 100)로 접시에있는 생식 기관을 무균 작동 스테이션으로 옮긴다.
    5. 결합 조직과 지방 조직 및 에피로부터 코다 (cauda) epididymides를 해부한다.didymal 캡슐. 1 mL의 부고환을 1.5 mL 튜브에 Collagenase Solution ~ 0.2 mL와 함께 놓습니다. 깨끗한 공기 흐름 조절 작업 스테이션에서이 단계를 수행하십시오.
  3. 쥐 cauda epididymides에서 단일 세포의 해리
    1. 조직이 풀과 같은 액체가 될 때까지 미세 가위를 사용하여 Collagenase Solution의 부고환을 잘라내십시오. 1.5 mL 튜브의 (~ 0.8 mL) 효소 용액으로 가위를 부드럽게 헹굽니다.
    2. 튜브를 금속 Thermomixer 위에 37 ℃에서 30 분 동안 놓고 1,000 rpm의 진동 속도로 놓습니다.
    3. RT에서 30 xg로 3 분간 효소 - 조직 혼합물을 원심 분리하고 대부분 정자가 들어있는 끈적 끈적한 상층 액을 버린다.
    4. 펠렛을 1 ML Full-IMDM에 Resuspend하여 모든 효소 활성을 끄십시오. 49 ML RPMI (+ P / S 1 : 100)가 들어있는 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하십시오.
      참고 : 선택 사항으로, 일정한 분무기가있는 100μm 메쉬 막을 통해 세포 현탁액을 걸러냅니다이온으로 큰 세포 집합체를 피할 수 있습니다. 그러나 성장 세포 monolayers에 대한 세포 현탁액이 필요한 경우 메쉬 필터를 사용하지 마십시오.
    5. 10 분 동안 실온에서 30 xg에서 세포 혼합물을 원심 분리하십시오; 상청액을 따라 내었다.
    6. 효소 처리 epididymal 조직 혼합물에서 단일 세포를 해리 적어도 5 분 동안 부드러운 발정과 1 ML 전체 IMDM에 펠렛을 Resuspend.
  4. 무균 상태에서 다른 세포의 상피 세포 분리
    1. 32 ° C 5 % CO 2 의 배양기에서 적어도 8 시간 또는 하룻밤 동안 Full-IMDM이 들어있는 10cm 페트리 접시에 세포 현탁액을 배양합니다.
    2. 100 % 알콜에 담그면 멸균 된 커버 슬립을 미리 준비하십시오. 공기를 건조시키고 소량의 배양액에 담그십시오. 6cm 문화 요리 또는 24 잘 접시의 단일 우물에 coverslips을 놓으십시오.
    3. 다음날 아침, 부드럽게 세포 suspen을 수집하여 dissociated 상피 세포를 수확대부분 상피 세포로 이루어져있는 페트리 접시의 시온. RT에서 30 xg로 5 분간 세포 현탁액을 원심 분리 한 다음 상층 액을 버린다.
    4. ~ 2 ML 전체 IMDM에 세포 펠렛을 Resuspend.
    5. 수확 한 세포 현탁액 0.2 ML 각 멸균 coverslip의 중심에 씨앗.
    6. 세포가 유리 coverslips에 느슨하게 고착 수 있도록 적어도 10 분 동안 액체 방울에 정착 세포하자. 조심스럽게 10 ML 접시의 가장자리에 1 ML 전체 IMDM을 추가하거나 0.3 ML 전체 IMDM 24 잘 접시의 각 우물에; 세포를 방해하지 마라.
    7. 패치 클램프 실험까지 32 % C 5 % CO 2 인큐베이터에서 coverslips에 고립 된 단일 세포를 유지.

3. 녹음 솔루션 및 Micropipettes

참고 : 패치 클램프 실험의 경우 최상의 품질의 화학 물질과 용액을 사용하십시오.

  1. 원액 준비
    1. 스톡 저장을 위해 모든 병을 오토 클레이브하고 사용하기 전에 0.22 μm의 멤브레인을 통해 모든 스톡 용액 (부식성 용액 제외)을 걸러 낸다.
    2. 실온에서 미리 모든 원액을 준비하고 4 o C에서 보관하십시오 : 5 M NaCl; 1M KCl; 100 밀리미터의 MgCl 2; 100 mM의 CaCl2를; 200 밀리미터의 NaH 2 PO 4; 100 mM EGTA (pH 7.0, KOH). 부식성 용액으로 5 M NaOH, 1M HCl 및 1M KOH 스톡을 취급하십시오.
  2. 표준 외부 기록 생리 식염수 용액 (PSS)의 제조
    1. 패치 - 클램프 기록의 아침에 주식 솔루션을 RT로 따뜻하게합니다.
    2. CaCl 2를 제외하고 원하는 최종 부피에 따라 각 원료에서 피펫을 만듭니다. 예 : PSS 500mL를 준비 할 때 : 140mM NaCl = 5M 14mL; 5 mM KCl = 2.5 mL의 1M; 100 mm의 1.2 밀리미터의 MgCl 2 = 6 ㎖; 200 mM의 1.2 밀리미터의 NaH 2 PO 4 = 3 ㎖.
    3. 더블 추가(ddH 2 O)를 최종 부피 400 mL가되도록 가하여 평형화한다.
    4. 0.9 g의 포도당과 1.19 g의 HEPES를 칭량하고 용액 혼합물에 완전히 용해시킨다.
    5. 교반과 함께 CaCl 2 주식 (2.5 MM = 12.5 ML 100 MM)을 추가합니다.
    6. 최종 볼륨의 99 %까지 추가하십시오.
    7. NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
    8. 삼투압을 확인하고 필요한 경우 5 M NaCl 또는 포도당을 사용하여 조정하십시오.
    9. 실린더에서 최종 용적 500 mL에 ddH 2 O를 첨가한다.
  3. 마이크로 피펫 내부 용액 준비 (저 EGTA K + 기반 용액)
    1. 원하는 최종 부피 및 농도에 따라 각 스톡에서 시약의 정확한 부피를 측량 또는 피펫 팅하십시오 ( 예 : ~ 30 mL의 부피로 50 mL 저 EGTA K + 기반 세포 내 용액 준비 용). ddH 2 O : 100 mM K- 글루코 네이트 = 1.17g; 35 mM KCl = 1M 1.75 mL; 2 밀리미터의 MgCl 2 = 1 mL의100 mM; 0.1 mM EGTA = 100 mM의 0.05 mL; 10 mM HEPES = 0.072 g.
    2. 최종 부피의 ~ 95 %에 물을 충분히 넣고 용액을 실온에서 평형을 유지하도록합니다. 솔루션이 명확한 지 확인하십시오.
    3. 용액을 계속 저어 주면서 KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정한다.
    4. 0.078 g Mg-ATP가 녹아 완전히 용해 될 때까지 용액에 넣는다.
    5. 얼음 위에 용액을 놓고 삼투압 측정을 위해 작은 분액을 사용하십시오. 일반적으로 용액은 ~ 290 mOsmol을 측정하므로 조정할 필요가 없습니다. osmolarity가 280-295 mOsmol과 크게 다르면 새로운 해결책을 준비하십시오.
    6. 최종 부피에 ddH 2 O를 첨가한다.
    7. 용액을 500 μL 분취 액으로 나누고 0.2 μm 주사기 필터로 필터를 단단히 밀봉하고 즉시 -20 ° C 이하에서 보관하십시오.
    8. 패치 클램프 실험 날짜에 얼음 속의 세포 내 용액의 한 분량을 해동시키고 패치 클램프 실험 동안 차가운 상태로 유지한다.성능 저하를 방지하십시오.
  4. 유리 모세 혈관에서 패치 pipettes (피펫 풀러 사용자 설명서) 다음 5 - 10 M의 micropipette 크기를 얻기 위해 세포 내 솔루션으로 가득 때 당겨.

4. 패치 클램프 실험 설정 및 셀로 전체 셀 구성 설정

  1. 패치 클램프 실험 설정하기
    1. 패치 클램프 설정 (컴퓨터, 컴퓨터 제어 증폭기, 디지타이저 등 )을 켜십시오 .
    2. 패치 클램프 소프트웨어 ( 예 : AXON pCLAMP10 또는 HEKA PatchMaster)를 열고 전기 생리 학적 기록을위한 프로토콜을 설정하십시오. 신호 필터는 1-3 kHz에서 로우 패스하고 디지타이저는 10-20 kHz에서 설정하십시오.
    3. 카메라, 마이크로 매니퓰레이터 및 광원을 켜십시오.
    4. 컴퓨터 제어 증폭기가 켜지면 접지 된 패치 클램프 장치를 손으로 만져 실험자 몸을 접지시키고,전기 충격으로부터 보호하기 위해 헤드 스테이지에 손을 대십시오.
    5. RT에서 표준 PSS ~ 1 ML로 가득 레코딩 챔버 유리 coverslip에 culturing 상피 세포를 전송합니다. 패치 클램프 실험 전에 조심스럽게 피펫을 사용하여 적어도 2 번 입욕 PSS를 변경합니다.
      참고 : 선택적으로 계획된 실험에 따라 표준 PSS 또는 다른 외부 솔루션으로 관류 시스템을 채 웁니다. 패치 - 클램프 실험을 시작하기 전에 현미경에 장착 된 기록 챔버 (RC - 26G 또는 RC - 26GLP)를 ~ 2mL / 분의 속도로 PSS로 몇 번 충만하십시오. 관류 시스템을 따라 갇힌 기포가 없는지 확인하십시오.
    6. 보기 및 차동 간섭 대비 광학 시스템을 갖춘 10X 및 40X 대물 렌즈를 사용하여 거꾸로 현미경에서 세포를 선택합니다. 녹음을 위해 큰 단일 고립 세포를 찾으십시오. 고립 된 부고환 상피 세포를 구형으로 거친 m으로 동정세포막의 한쪽 끝에있는 마이크로 빌리 (microvilli)와 세포 내 내용물의 분극 된 분포 ( 그림 1 ).
    7. 1 ML 주사기 (집에서 만든 nonmetallic microsyringe 바늘)를 사용하여 내부 솔루션 (낮은 EGTA K + 기반 솔루션, 단계 3.3 참조)와 micropipette을 작성하십시오. micropipette에 공기 방울이 없어야 micropipette의 저항력을 높일 수 있습니다. 내부 용액이 마이크로 피펫 홀더 내에 염화물로 코팅 된 은색 와이어 전극을 침몰 시키도록 충분한 용액을 사용하십시오.
    8. micropipette를 전극 홀더에 장착하고 낮은 양의 압력 (~ 0.2 ML 주사기 볼륨)을 적용합니다. 이후 단계에서 세포막을 만질 때까지 낮은 양성 압력을 계속 유지하십시오.
  2. 녹음 용 셀로 전체 셀 구성 설정
    1. micromanipulator의 최고 속도로 목욕 솔루션에 피펫을 담가. 피펫 찾기디지털 카메라에 연결된 화면의 팁; micromanipulator 속도를 중간 높이 모드로 천천히하십시오.
    2. 컴퓨터 제어 증폭기에서 생성 된 전압 단계 ( 예 : 5mV, 100ms)를 적용하여 데이터 획득 인터페이스 명령 ( 예 : AXON 시스템의 멤브레인 테스트)을 사용하여 마이크로 피펫 저항 (5 - 10MΩ)을 빠르게 점검하십시오. 저항이이 범위를 벗어나면 새로운 마이크로 피펫으로 변경하십시오.
    3. 현미경에 올려 놓은 목표물 아래로 움직이기 시작하십시오. 점차적으로 선택한 세포쪽으로 micropipette을 안내합니다. 먼저 피검자의 목적을 먼저 낮춘 다음, 마이크로 피펫이 선택된 셀의 중앙 표면 위에 올 때까지 초점면으로 마이크로 피펫을 내립니다.
    4. 소프트웨어의 지휘관 인터페이스에서 "pipette offset"명령을 사용하여 피펫과 목욕 용액 사이의 액체 접합 전위를 0으로 취소하십시오.
    5. 컴퓨터 제어 증폭기 통신 설정전압 - 클램프와 멤브레인 테스트를 "목욕"모드로 설정하십시오.
    6. 세포의 더 명확한 전망을위한 좋은 초점, 그리고 낮은 중간 속도로 micromanipulator를 사용하여 점차적으로 micropipette을 낮추십시오.
    7. micropipette가 세포에 가까울 때 (멤브레인 테스트 명령에 의해 트리거되었을 때 감소 된 전류로 나타남) 즉시 낮은 양성 압력을 제거하고 약한 음압 (0.1 mL 주사기 볼륨)을 적용하여 gigaseal (> 1 GΩ) .
    8. 멤브레인 테스트로 저항을 모니터링하십시오. 저항이 500MΩ 이상 1GΩ 미만인 경우 음극 전위 (일반적으로 -60mV로 설정된 유지 전위)를 적용하면 기가 제형을 형성하는 데 도움이됩니다. micropipette의 일시적인 용량 성 전류를 보상하십시오.
    9. 씰이 1 GΩ 이상이고 안정적이라면 (소프트웨어 인터페이스에서 볼 수 있듯이) 세포 멤브레인을 깨기 위해 간단하고 강한 흡입력을가하십시오. 그에게 보상을주지 마라.저항 및 셀 커패시턴스를 감소시킨다.
    10. 성공적인 전체 셀 구성을 달성 한 직후에 -60mV의 유지 전위에서 10mV 과분극 단계 (최소 시간 간격, 20ms 지속 시간, 20kHz 신호 샘플)를 적용하십시오.
    11. 전압 모드를 영 전류 모드로 전환하고 소프트웨어 인터페이스의 판독 값을 표시하거나 셀의 멤브레인 전위 판독 값에 대해 갭이없는 기록 (10-60 초)을 수행하십시오.
    12. 신속하게 다시 전압 모드로 전환하고 계획된 실험에 따라 전압 프로토콜을 적용하고 현재 응답을 측정합니다. 녹음 중에 내장 된 누설 전류에는 뺄셈이 적용되지 않습니다.
    13. 녹음 중에 응답의 안정성 또는 셀의 다른 매개 변수를 모니터링합니다. 예를 들어 "멤브레인 테스트"명령 인터페이스를 사용하여 입력 저항 (R i ), 직렬 저항 (R s ) 및 셀프로토콜 전환 동안 "셀"모드에서의 멤브레인 테스트에서의 멤브레인 커패시턴스 ( Cm ).
      참고 : 입력 저항의 갑작스런 하락은 일반적으로 느슨한 패치를 나타내며, 직렬 저항의 극적인 증가는 세포 내 세포 기관 또는 막 단편에 의한 마이크로 피펫 팁 막힘을 나타낼 수 있습니다. 기록하는 동안 정기적으로 마이크로 피펫 위치를 모니터링하여 표류가 발생하는지 확인하십시오. 이로 인해 패치가 손실 될 수 있습니다. 드리프트가 문제가되면 조심스럽게 마이크로 피펫과 패치 셀을 기록 챔버의 바닥에서 들어 올리십시오. 이 단계는 때로는 패치 손실을 초래할 수 있으며,이 경우 전체 셀 패치 클램프 절차를 반복해야합니다.

5. 세포의 수동 전기 생리 학적 특성 분석

  1. 패치 - 클램프 실험에서 데이터를 얻은 후 Clampfit 소프트웨어에서 gap-free 데이터를 열고 평균을 측정합니다각 세포에 대한 잔류 막 전위에 대한 값. 또는 전류 모드에서 제로 전류 전압에서 표시된 값을 사용하십시오. 액체 접합 전위 (이 연구에서는 12.4 mV)로 값을 보정하십시오.
  2. 셀에서 얻은 10-mV 과분극 단계 (ΔV)에서 데이터를 열고 단계 전 (Δ I 단계 ) 동안 전류 차이를 측정하고 방정식을 사용하여 입력 저항 (R i )을 계산합니다.
    figure-protocol-1
  3. 셀 커패시턴스 ( Cm , pF 단위)를 계산합니다 (전압 스텝 트리거에서 발생한 초기 과도 전류 감소 동안 멤브레인 커패시터 전류 아래 총 면적을 통합하여 10mV 과분극 단계에서 동일한 전류 데이터 사용). 셀의 총 누적 된 전하량 (Q, pA • ms 단위)을 구하십시오. 다음 방정식을 사용하십시오.
    figure-protocol-2
  4. 시간 상수 쇠퇴 전류 ( T , ms / in)를 얻기 위해 표준 지수 알고리즘으로 10-mV 음 단계의 초기 과도 전류를 피팅하여 각 셀 의 직렬 저항 (R s ) 값을 계산하고 다음 방정식 :
    figure-protocol-3

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결과

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래트의 카우 epididymides에서 상피 세포의 분리 기술의 효소 분해 과정은 이전 연구 9, 12에서 수정 된 프로토콜이다. 이 방법은 90 % 이상의 생존력과 표면 수포 나 부어 오름이없는 단일 세포의 혼합물을 생성합니다. 이질적인 세포 혼합물은 이전에 설명한 바와 같이 주로 주요 세포, 맑은 세포 및 기저 세포로 구성됩니다 1 . 이 프로토콜에서는, 부고화 상피 세포의 비교적 순수한 샘플은 접시에 비 상피 세포 (예 : 섬유 아 세포와 부드러운 세포)의 접착을 허용하기 위해 페트리 접시에 하룻밤 일차 해리 세포를 배양하여 얻을 수 있습니다 그림 1A (수확 전)에 나와 있습니다. 세포 유형은 현미경으로 그들의 표현형에 의해 예비 적으로 구별 될 수있다그들의 특정...

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토론

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이 프로토콜에서, 쥐 cauda epididymides의 효소 분산 일관되게 건강한 상피 세포를 생산. 패치 - 클램프 실험을위한 부고환 상피 세포의 품질은 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려있다. 예를 들어, 낮은 원심력 (30 xg)에서 세포 혼합물의 원심 분리는 정자 및 부고환 내강을 제거하는 데 중요합니다. 부고환 상피 세포는 세포 배양에서 정자가 있으면 건강하지 못하게된다. 또한, 해리 된 세포 혼합물을 페트리 접시에서 수 시간 동안 배양하는 것은 섬유 아세포 및 평활근 세포를 제거하기위한 중요한 단계이다; 비 - 상피 세포는 배양 접시에서 더 빨리 부착하여 현탁액에 상피 세포를 남겨 두며 상피 세포는 부드러운 흡인으로 다시 수확 할 수 있습니다. 또한 콜라게나 제 소화 및 미세 유리 피펫으로 분쇄하는 것은 두 가지 중요한 단계입니다.세포 분리 절차 동안 단일 세포. 마지막으로 부고환 세포의 효소 소화는 패치 - 클램프 실험에 중요하다. 왜냐하면 비효율적 인 효소 활성에 의한 과소 소화 또는 장기간 배양에 의한 과...

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공개 사항

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본문에 대한 도움이되는 의견을 보내 주신 크리스토퍼 안토 스 박사님 께 감사드립니다. 이 작품은 위니 award에게 수여 된 상하이 테크 대학교 (ShanghaiTech University)로부터의 창업 자금과 중국 국립 자연 과학 재단 (NNSFC no. 31471370)의 자금 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier분자 장치 - AxonMulticlamp 700B 패치 클램프 증폭기
디지털 수집 시스템분자 장치 - AxonDigidata 1550 컨버터
현미경OlympusBX-61WI
MicromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
녹음 챔버 및 인라인 히터Warner InstrumentsTC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifierHarvard Bioscience - HEKAEPC-10 USB 이중
현미경OlympusIX73
MicromanipulatorSutter InstrumentsMPC-325
녹음 챔버 및 인라인 히터Warner InstrumentsTC-324C
Other Instrument
Micropipette PullerSutter Instrument P-1000
녹음 챔버워너 인스트루먼트RC-26G 또는 집에서 만든 챔버
보로실리케이트 모세관 유리와 필라멘트셔터 악기 / 하버드 장치BF150-86-10
진동 절연 테이블TMC 63544
디지털 CamareHAMAMASTUORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
강력한>분리용 시약
RPMI 1640 매체Gibco22400089
Penicillin/StreptomycinGibca15140112
IMDMATCC 2005년 30월 
IMDMGibcoC12440500BT
Collagenase ISigmaC0130
Collagenase IISigmaC6885
5-&-alpha;-dihydrotestosteroneMedchemexpressHY-A0120
소 태아 혈청염소자리FBS-12A
Micropipette 내부 용액 (K + 기반 용액) (pH 7.2, 280-295 mOsm) < / strong>
KCl, 35mMSigma / 다양한V900068
MgCl2< / sub> · 6H 2 < / sub>O, 2mMSigma / 다양한M2393
EGTA, 0.1mMSigma / 다양한E4378
HEPES, 10mMSigma / 다양한V900477
K-글루코네이트, 100mM시그마/다양한P-1847
Mg-ATP, 3mM시그마<A9187
강>표준 외부 기록 생리염 용액(PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM시그마/다양한V900058
KCl, 4.7mM시그마 / 다양한V900068
CaCl 2,< / sub> 2.5mM시그마 / 다양한V900266
MgCl 2 < / sub> · 6H 2 < / sub>O, 1.2mMSigma / 다양한M2393
NaH 2< / sub>PO4, 1.2mMSigma / 다양한V900060
HEPES, 10mMSigma / 다양한V900477
포도당, 10mM시그마 / 다양한V900392
< 강>pH 조정 용< / 강>
NaOH시그마 / 다양한V900797순도 > = 97 %
KOH시그마 / 다양한60371순도 > = 99.99 %
<다양한

참고문헌

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