Method Article

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

DOI:

10.3791/55703

⸱

June 9th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA 손상 반응은 자발적으로 발생하거나, 유전 독성 스트레스에 의해 유발되거나, 또는 림프구에서 프로그램 된 DNA 붕괴의 문맥에서 나타나는 DNA 병변의 수리를 조율합니다. Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM 및 Rad3 관련 키나아제 (ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PKcs)의 촉매 서브 유닛은 DNA 손상의 유도시 활성화되는 첫 번째 물질이며, DNA 복구, 세포 사멸 및 세포 생존을 조절하는 네트워크의 중앙 조절 자. 종양 억제 경로의 일환으로 ATM과 ATR은 인산화를 통해 p53을 활성화시킴으로써 p53의 전사 활성을 조절합니다. DNA 손상은 또한 형광 현미경에 의해 시각화 된 DNA 손상 부위에 축적되는 DNA 손상 센서 및 수리 단백질의 복합체를 나타내는 소위 이온화 방사선 유도 초점 (IRIF)의 형성을 초래한다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 공동 위치 화는 반드시 d직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 형광 현미경 검사의 해상도가 제한되어 있기 때문에 가능합니다.

In situ Proximity Ligation Assay (PLA)는 전례가없는 특이성과 민감성으로 세포와 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 직접 시각화 할 수있는 새로운 기술입니다. 이 기술은 관심있는 단백질에 결합하는 특정 항체의 공간적 근접성을 기반으로합니다. 질문 단백질이 ~ 40 nm 내에 있으면 증폭 반응은 항체에 접합 된 올리고 뉴클레오타이드에 의해 촉발되고 증폭 생성물은 형광 표지에 의해 시각화되어 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치에 해당하는 신호를 생성합니다. 예를 들어 ATM과 p53 사이에 확립 된 기능적 상호 작용을 사용하여 PLA가 DNA 손상 반응의 핵심 부분 인 단백질 간의 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해 서스펜션 세포 배양에서 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA 손상은 단백질 - 단백질 상호 작용 및 DNA의 효율적이고 신속한 수리를 보장하는 번역 후 변형을 포함하는 고도로 규제 된 일련의 사건을 유발하여 게놈 무결성을 보호합니다 1 . 전형적으로, DNA 수리는 (공 초점) 형광 현미경에 의해 소위 이온화 방사선 유발 성 초점 (IRIF)의 형성을 모니터링함으로써 이온화 방사선에 노출 된 세포에서 연구된다. 많은 DNA 복구 및 DNA 손상 감지 단백질이 IRIF를 형성하는데, 이는 DNA 손상을지지하는 염색질 부위에서 핵 생성하는 단백질 복합체를 나타냅니다 2 , 3 . 시간 경과에 따른 IRIF의 위치와 해상도는 DNA 복구의 시공간적 조직에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 다양한 DNA 복구 경로의 참여를 나타낼 수 있습니다. DNA 손상의 특성과 손상이 이루어진 세포주기 단계에 따라 어떤 DNA 복구 경로가 활성화되는지가 결정됩니다. 포 예를 들어, DNA 복제 (S 상)에 적극적으로 관여하는 세포에서 상 동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 세포 복제의 G1 또는 G2 / M 상 세포에서 우세한 DNA 복구 경로 인 반면, homologous....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포 및 DNA 손상 유도 처리

  1. 20 % FCS, 50 μM β- 메르 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM에서 인간 BCR-ABL + B 세포 급성 림프 아교 성 세포주 BV173 또는 SUP-B15를 5 % CO2의 분위기에서 37 ℃. 5 ML / 잘 6 잘 접시에 2 X 10 6 세포 / ML에서 세포와 접시를 세고.
    참고 : 선택적으로, 다양한 원산지의 서스펜션 세포주를 사용할 수 있습니다.
  2. 세포주기의 G1 단계에서 BCR - ABL + B - ALL 세포를 체포하기 위해 5 μM의 imatinib methanesulfonate (STI571)를 첨가하고 하룻밤 동안 배양하십시오.
    1. 선택적으로, 세포주기 또는 BCR-ABL 음성 세포 유형에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구 할 때이 단계를 생략하십시오.
  3. 50 ng / ML neocarzinostatin (NCS)를 배양 물에 첨가하여 DNA 손상을 유도하고, 2 시간 동안 배양한다.
    1. 또는,0.5Gy / 분의 방사능 원을 사용하여 5Gy의 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

잔류 Ser15에서의 p53의 인산화는 ATM 키나제 활성에 의존하는 것으로 나타났다. 부유 세포 배양 물의 cytospin 조제에 대한 PLA 기술의 특이성을 증명하고 확인하기 위해, 세포주기의 G1- 단계에서 정지 된 BCR-ABL + B-ALL 세포의 2 시간 NCS 처리에 의한 DNA 손상 유도가 나타났다 예상대로 ATM과 phospho-Ser15-p53 사이의 특이 적 상호 작용을 일으켰다. Punctate PLA 신호는 NCS ( 도 1B )로 처리 된 세포의 대다수의 핵에서 관찰되었고, NCS로 처리하지 않은 세포에서는 신호가 검출되지 않았지만 ( 도 1A ), 세포 당 평균 7 PLA 신호가 관찰되었다 . DNA 손상 유도 전에 특정 ATM 키나아제 억제제 인 KU55933으로 세포를 전처리하면 PLA 신호의 수를 평균적으로 감소시켰다2 개의 PLA.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서에서 PLA는 현탁 세포 배양에서 단백질 간의 특이 적 상호 작용을 결정하고 시각화하는 데 사용될 수 있음이 입증되었습니다. 참고로 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA 복구 복합체의 연구에만 국한되지 않고 정지 세포 배양에서 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 데에도 적용됩니다. ATM 키나아제가 DNA 손상 유도제에 노출되었을 때 G1- 구속 된 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 인산화 된 p53과 상호 작용하는 것으로 나타났다. 이전에 PLA 기술은 ATM과 FOXO1 전사 인자가 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 상호 작용한다는 것을 보여주기 위해 사용되었지만,이 상호 작용은 FOXO1의 ATM 의존성 인산화를 초래하지 않을 가능성이 높습니다. PLA 데이터를 뒷받침하기 위해, 내인성 ATM / ATR- 인산화 단백질의 면역 침전에 의해, 확립 된 ATM 기질 p53 및 NBS1과 대조적으로, FOXO1은 D의 유도시 ATM에 의해 인산화 되지 않는다는 것이 확인되었다N.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guikema 연구소의 연구는 네덜란드 연구기구 (VIDI grant 016126355)와 Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (프로젝트 252)의 Innovational Research Incentives Scheme에 의해 지원됩니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BV173 세포주DSMZAC-20BCR-ABL+ B-ALL 세포주
SUP-B15 세포주DSMZACC-389BCR-ABL+ B-ALL 세포주
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco (Life Technologies)21980-032
Fetal Calf SerumSigma AldrichF7524lot #: 064M3396
L-glutamineGibco (Life Technologies)25030-024
페니실린/스트렙토마이신Gibco (Life Technologies)15140-122
imatinib methanesulfonateLC LaboratoriesI-5508DMSO에 용해, 10mM 재고 용액 준비
neocarzinostatinSigma AldrichN9162돌연변이 유발/기형 유발, 주의해서 다루
KU55933SelleckchemS1092DMSO에 용해, 5mM 원액 준비
Starfrost 현미경 슬라이드Waldemar KnittelVA11200 003FKB
PAP 펜 액체 차단제Sigma AldrichZ377821-1EA
Cytospin 깔때기Q Path Labonord SAS003411324
Duolink In Situ Red 스타터 키트 염소/토끼시그마 AldrichDUO92105다양한 종/조합에 사용 가능하며, FarRED, Orange 및 Green
goat-anti-ATMBethyl LaboratoriesA300-136APLA 등급에서도 사용 가능; 우리는 우리의 연구에서 lot#A300-136A-1을 성공적으로 사용했습니다
Rabbit-anti-phospho-Ser15-p53Cell Signaling Technology9284
와 함께 Vectashield 안티페이딩 마운팅 매체H-1200
Vectashield 페이드 방지 장착 매체Vector LabsH-1000
4% 파라포름알데히드 in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692다른 다양한 공급업체에서도 사용 가능
기 . 우리는 DAPI Vector Labs를 연구에서 성공적으로 사용했습니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716(2013).
  2. Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Proximity Ligation AssayDNA Damage ResponseATM p53 InteractionSuspension Cell CulturesProtein Complex VisualizationFluorescence MicroscopyCell Cycle ArrestAntibody CocktailsCytospin PreparationConfocal Imaging

Related Articles