여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.
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방법 논문
Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화
이 논문에서
요약
초록
DNA 손상 반응은 자발적으로 발생하거나, 유전 독성 스트레스에 의해 유발되거나, 또는 림프구에서 프로그램 된 DNA 붕괴의 문맥에서 나타나는 DNA 병변의 수리를 조율합니다. Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM 및 Rad3 관련 키나아제 (ATR) 및 DNA 의존성 단백질 키나제 (DNA-PKcs)의 촉매 서브 유닛은 DNA 손상의 유도시 활성화되는 첫 번째 물질이며, DNA 복구, 세포 사멸 및 세포 생존을 조절하는 네트워크의 중앙 조절 자. 종양 억제 경로의 일환으로 ATM과 ATR은 인산화를 통해 p53을 활성화시킴으로써 p53의 전사 활성을 조절합니다. DNA 손상은 또한 형광 현미경에 의해 시각화 된 DNA 손상 부위에 축적되는 DNA 손상 센서 및 수리 단백질의 복합체를 나타내는 소위 이온화 방사선 유도 초점 (IRIF)의 형성을 초래한다. 그러나 IRIFs에서 단백질의 공동 위치 화는 반드시 d직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 형광 현미경 검사의 해상도가 제한되어 있기 때문에 가능합니다.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA)는 전례가없는 특이성과 민감성으로 세포와 조직에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 직접 시각화 할 수있는 새로운 기술입니다. 이 기술은 관심있는 단백질에 결합하는 특정 항체의 공간적 근접성을 기반으로합니다. 질문 단백질이 ~ 40 nm 내에 있으면 증폭 반응은 항체에 접합 된 올리고 뉴클레오타이드에 의해 촉발되고 증폭 생성물은 형광 표지에 의해 시각화되어 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치에 해당하는 신호를 생성합니다. 예를 들어 ATM과 p53 사이에 확립 된 기능적 상호 작용을 사용하여 PLA가 DNA 손상 반응의 핵심 부분 인 단백질 간의 직접적인 상호 작용을 연구하기 위해 서스펜션 세포 배양에서 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다.
서론
DNA 손상은 단백질 - 단백질 상호 작용 및 DNA의 효율적이고 신속한 수리를 보장하는 번역 후 변형을 포함하는 고도로 규제 된 일련의 사건을 유발하여 게놈 무결성을 보호합니다 1 . 전형적으로, DNA 수리는 (공 초점) 형광 현미경에 의해 소위 이온화 방사선 유발 성 초점 (IRIF)의 형성을 모니터링함으로써 이온화 방사선에 노출 된 세포에서 연구된다. 많은 DNA 복구 및 DNA 손상 감지 단백질이 IRIF를 형성하는데, 이는 DNA 손상을지지하는 염색질 부위에서 핵 생성하는 단백질 복합체를 나타냅니다 2 , 3 . 시간 경과에 따른 IRIF의 위치와 해상도는 DNA 복구의 시공간적 조직에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 다양한 DNA 복구 경로의 참여를 나타낼 수 있습니다. DNA 손상의 특성과 손상이 이루어진 세포주기 단계에 따라 어떤 DNA 복구 경로가 활성화되는지가 결정됩니다. 포 예를 들어, DNA 복제 (S 상)에 적극적으로 관여하는 세포에서 상 동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 세포 복제의 G1 또는 G2 / M 상 세포에서 우세한 DNA 복구 경로 인 반면, homologous....
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프로토콜
1. 세포 및 DNA 손상 유도 처리
- 20 % FCS, 50 μM β- 메르 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 스트렙토 마이신이 보충 된 IMDM에서 인간 BCR-ABL + B 세포 급성 림프 아교 성 세포주 BV173 또는 SUP-B15를 5 % CO2의 분위기에서 37 ℃. 5 ML / 잘 6 잘 접시에 2 X 10 6 세포 / ML에서 세포와 접시를 세고.
참고 : 선택적으로, 다양한 원산지의 서스펜션 세포주를 사용할 수 있습니다. - 세포주기의 G1 단계에서 BCR - ABL + B - ALL 세포를 체포하기 위해 5 μM의 imatinib methanesulfonate (STI571)를 첨가하고 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 선택적으로, 세포주기 또는 BCR-ABL 음성 세포 유형에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구 할 때이 단계를 생략하십시오.
- 50 ng / ML neocarzinostatin (NCS)를 배양 물에 첨가하여 DNA 손상을 유도하고, 2 시간 동안 배양한다.
- 또는,0.5Gy / 분의 방사능 원을 사용하여 5Gy의 ....
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결과
잔류 Ser15에서의 p53의 인산화는 ATM 키나제 활성에 의존하는 것으로 나타났다. 부유 세포 배양 물의 cytospin 조제에 대한 PLA 기술의 특이성을 증명하고 확인하기 위해, 세포주기의 G1- 단계에서 정지 된 BCR-ABL + B-ALL 세포의 2 시간 NCS 처리에 의한 DNA 손상 유도가 나타났다 예상대로 ATM과 phospho-Ser15-p53 사이의 특이 적 상호 작용을 일으켰다. Punctate PLA 신호는 NCS ( 도 1B )로 처리 된 세포의 대다수의 핵에서 관찰되었고, NCS로 처리하지 않은 세포에서는 신호가 검출되지 않았지만 ( 도 1A ), 세포 당 평균 7 PLA 신호가 관찰되었다 . DNA 손상 유도 전에 특정 ATM 키나아제 억제제 인 KU55933으로 세포를 전처리하면 PLA 신호의 수를 평균적으로 감소시켰다2 개의 PLA.......
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토론
이 보고서에서 PLA는 현탁 세포 배양에서 단백질 간의 특이 적 상호 작용을 결정하고 시각화하는 데 사용될 수 있음이 입증되었습니다. 참고로 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA 복구 복합체의 연구에만 국한되지 않고 정지 세포 배양에서 다른 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화하고 정량화하는 데에도 적용됩니다. ATM 키나아제가 DNA 손상 유도제에 노출되었을 때 G1- 구속 된 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 인산화 된 p53과 상호 작용하는 것으로 나타났다. 이전에 PLA 기술은 ATM과 FOXO1 전사 인자가 BCR-ABL + B-ALL 세포에서 상호 작용한다는 것을 보여주기 위해 사용되었지만,이 상호 작용은 FOXO1의 ATM 의존성 인산화를 초래하지 않을 가능성이 높습니다. PLA 데이터를 뒷받침하기 위해, 내인성 ATM / ATR- 인산화 단백질의 면역 침전에 의해, 확립 된 ATM 기질 p53 및 NBS1과 대조적으로, FOXO1은 D의 유도시 ATM에 의해 인산화 되지 않는다는 것이 확인되었다N.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
Guikema 연구소의 연구는 네덜란드 연구기구 (VIDI grant 016126355)와 Stichting Kinderen Kankervrij KiKA (프로젝트 252)의 Innovational Research Incentives Scheme에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BV173 세포주 | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL 세포주 |
| SUP-B15 세포주 | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL 세포주 |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | DMSO에 용해, 10mM 재고 용액 준비 |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | 돌연변이 유발/기형 유발, 주의해서 다루 |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | DMSO에 용해, 5mM 원액 준비 |
| Starfrost 현미경 슬라이드 | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP 펜 액체 차단제 | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin 깔때기 | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red 스타터 키트 염소/토끼 | 시그마 Aldrich | DUO92105 | 다양한 종/조합에 사용 가능하며, FarRED, Orange 및 Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA 등급에서도 사용 가능; 우리는 우리의 연구에서 lot#A300-136A-1을 성공적으로 사용했습니다 |
| Rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | |
| 와 함께 Vectashield 안티페이딩 마운팅 매체 | H-1200 | ||
| Vectashield 페이드 방지 장착 매체 | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% 파라포름알데히드 in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | 다른 다양한 공급업체에서도 사용 가능 |
참고문헌
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716(2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2....
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재인쇄 및 허가
