방법 논문

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

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DOI:

10.3791/55711

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2017년 5월 4일

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

이 논문에서

요약

여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.

초록

건강 악성 조직 중 어느 하나에서 이종 세포 집단은 상기 DNA 결합 염료 훽스트 33342. 셀이 "측면 인구"유출하는 차동 기능을 특징으로 세포 집단을 포함 할 수있다 훽스트 33342 후 유세포 방법을 이용하여 식별 될 수있다 염료는 자외선 (UV) 레이저에 의해 여기된다. 많은 세포 유형의 측면 인구는 stem- 또는 전구와 같은 세포가 포함되어 있습니다. 그러나 모든 종류의 세포는 식별 측면 인구가 있습니다. 다니오의 레 리오 (rerio), 제브라 피쉬는 T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL)의 생체 내 모델의 강력한을 가지고 있지만 이러한 제브라 피쉬 T-ALLS가 있는지 여부 측면 인구는 알 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 제브라 피쉬 T-ALL의 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우선, 제브라 피쉬의 T-ALL은 하나의 세포 단계의 배아로 TOL2 플라스미드의 미세 주입을 통해 생성됩니다. 종양 무대로 성장했으면하는 그들은 항문의 절반 이상으로 확장T-ALL 세포를 수확 할 수 있습니다. 그 다음, 세포를 Hoechst 33342로 염색하고 측면 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 검사한다. 이 방법은 zebrafish T-ALL 연구에 광범위한 응용이 있습니다. 제브라 피쉬에는 이러한 측면 세포가 암 줄기 세포와 유사한지를 확인하는 알려진 세포 표면 마커는 없지만 생체 내 기능 이식 분석이 가능합니다. 또한, 단일 세포 transcriptomics이 측면 인구 세포의 유전 특징을 식별하는 데 적용 할 수 있습니다.

서론

측면 집단 분석은 세포막상의 ATP 결합 카세트 (ABC) 전달체 단백질의 높은 수치로 인해 DNA 결합 염료 Hoechst 33342를 유출시키는 조직 내 특정 세포의 증진 된 능력을 이용합니다. Hoechst 33342 염료를 유출하는 세포는 염료가 UV 레이저로 여기 된 후 이중 파장 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 분석법은 처음에 마우스 조혈 줄기 세포 (HSC) 1 을 확인하는 데 사용되었지만 이후 많은 조직과 암에서 줄기 / 전구 세포 집단을 확인하는 데 사용되었습니다 (참고 문헌 2 참조). 그러나 모든 세포 집단이 부수적 인 집단을 가지고있는 것은 아니며, 모든 부 모집단이 줄기 / 전구 세포를 위해 풍부하지는 않습니다.

제브라 피쉬는 인간의 암을 연구하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 3 , 4 , 전통적인 murine암의 델. Zebrafish의 배아는 외부 형질 전환 및 암 개시 및 진행을 포함한 병리학 적 과정의 생체 내 관찰을 용이하게 수정 된 광학적 분명합니다. 현재까지, 측면 인구 분석은 잠재적 인 줄기 또는 전구 세포만을 조혈 모세포를 식별하는 제브라 피쉬의 신장 골수에 적용, 그리고 어떤 제브라 피쉬 암 모델 5, 6되었습니다 감지합니다.

T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)는 형태 학적으로 인간 T-ALL 7, 8, 11 유전자와 유사하다. T-ALL은, 인간의, 소아 10 ~ 15 %와 모든 경우 9 성인의 25 %를 차지하는 공격적인 악성 종양이다. T-ALL의 치료가 개선 된 반면, 재발은 여전히 ​​일반적이며 예후와 연관되어 있습니다. T-ALL 종양은 heterogene입니다조직 구성 단위 및 백혈병 개시 세포 (저소득) 등 다양한 종양 세포의 소집단가 포함되어 있습니다. 저소득 그들의 단일 세포에서 종양 전체를 자라게 할 수있는 능력, 및 종양 세포 집단 내 저소득의 주파수에 의해 정의는 제한 희석 이식 분석 (LDA)을 통해 수신자로 변화하는 셀 용량을 이식하여 계산 될 수있다. LDA 실험은 저소득 8, 10, 11의 주파수를 계산하기 위해 제브라 수행 하였지만, 이러한 판정은 제 지나고되고 저소득의 잠재적 분리를 허용하지 않는다. 따라서, 방법은 전향 적으로 암 줄기 세포의 활동에 대한 풍부한 인구가 부족한 분리합니다. 식별 및 지브라 피쉬 T-ALLS 측으로부터 세포 집단을 분리하는 것은 이러한 결함을 해결하기위한 첫 단계이다.

여기에 제시된 프로토콜은 효율적으로 zebr에서 T-ALL 종양을 생성하는 방법에 대해 설명합니다(tol2-mediated transgenesis)를 이용하여 T-ALL 종양 세포를 수확하고 Hoechst 33342로 염색하여 세포의 부작용을 확인한다. 제브라 피쉬 T-ALL 에 대한 미래 의 생체 내 실험 은 측면 세포가 LIC를 강화 시키거나 다른 줄기 - 또는 전구체 - 유사 성질을 갖는지 여부를 포함 할 수있다.

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프로토콜

제브라 피쉬의 모든 절차는 시카고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시카고 대학은 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받았으며.

Zebrafish의 1. 생성 및 분리 찬란 레이블이 T-ALL 세포

  1. 동계 제브라 피쉬 배아에 미세 주입
    1. 녹색 형광 단백질 (rag2 : GFP) C-myc 유전자 및 rag2 : 시판되는 키트를 사용하여, 원형 rag2 격리 TOL2의 트랜스 (플라스미드 DNA의 소스 재료의 도표 참조) (12)에 의해 인식 된 역전 된 말단 반복 부를 포함하는 플라스미드 DNA를 상기 DNA를 용출 멸균한다.
      참고 : GFP는이 연구에서 사용되지만, 어떤 형광 단백질이 작동합니다.
    2. PCS2 - 트랜스 준비 (TOL2) RNA
      1. t 참조 (시판 키트를 사용하여 TOL2 플라스미드 DNA를 분리플라스미드 DNA의 소스 재료의 그 테이블) (12) 및 멸균의 DNA를 용출시킨다.
      2. 플라스미드를 선형화하는 적절한 버퍼를 NotI 제한 효소 5 개 유닛으로 1 시간 동안 37 ° C에서 TOL2의 DNA 1 μg의 부화. 20 분 동안 65 ° C에서을 NotI을 열 - 불 활성화.
      3. 시판 RNA 전사 세트 (13)를 사용하는 선형화 된 DNA로부터의 SP6 RNA 폴리머 라제와 RNA를 TOL2의 전사. -80 ° C에서 단일 사용 씩의 RNA를 저장합니다.
    3. C-myc의 플라스미드 DNA, 250 ng의 rag2 : GFP 플라스미드 DNA, RNA의 TOL2 150 NG 및 페놀 레드 0.5 μL rag2 250 NG를 첨가하여 얼음에 주입 혼합을 준비한다. 핵산 분해 효소가없는 물 10 μL에 볼륨을 조절합니다.
    4. 이전 맛 음료 다음, 유리 모세관으로부터 뽑아 마이크로 인젝터와 바늘을 이용하여 단일 세포 단계 동계 지브라 피쉬의 배아 세포에 주입 혼합 ~ 1 거리 nL 주입lished 방법 8, 14.
      참고 : 처녀 생식 (15)에 의해 생성 된 동계 제브라 피쉬는 이식 후 유전 적 이질성과 면역 거부 반응을 제거하기 위해 여기에 사용됩니다. 그러나, 야생형 제브라 또는 임의의 변형이 사용될 수있다.
    5. 24 시간 및 48 시간 후 주사 16 죽은 낙후 또는 잘못된 배아를 제거한다.
    6. 주입 후 6 일째에 물고기 시스템에 주입 된 물고기를 놓고 표준 프로토콜 6 항 키우기.
  2. 주입 지브라 피쉬 검사 및 종양 성장을 모니터링
    1. 8 이십일일 후 분사에서 epifluorescent 현미경 (: 40분의 470, 발광 대역 50분의 525 여기 대역)을 이용하여 GFP 형광을위한 배양 접시와 화면 배아 매체의 액적 단일 주입 유충 놓는다.
      참고 : 시간 Zebrafish의 유충ave는 rag2 : c-myc와 rag2 : GFP를 모두 통합하여 녹색 형광성 흉선 (양성 어류)을 가지며 이미 흉선을 넘어 악성 녹색 형광 세포의 확장을 나타낼 수 있습니다. GFP + 흉선이있는 모든 물고기는 GFP + T-ALL을 개발합니다. 플라스미드의 통합을 입증하지 않는 유충은 녹색 형광 세포 (음성 생선)를 갖지 않을 것이다.
    2. 다른 탱크에 (형광 부족에 따라) 부정적인 물고기를 분리하고 사후 28 일 및 35 일에 다시 물고기를 모니터하십시오. 주사 후 28 일 및 35 일에, 선별 전 물고기 시스템 물에서 0.02 % 완충 된 트리 세인 (MS-222)으로 물고기를 마취시킨다.
    3. 일주일에 세 번씩 종양 성장을 모니터링하기 위해 형광성으로 분류 된 흉선 또는 형광성 종양에 양성인 각 제브라 피쉬 애벌레를 개별 탱크에 놓습니다.
  3. 일차 종양 어류에서 형광 표지 된 T-ALL 세포의 수집
    1. 적어도 0.9 20 ㎖의 인산염 완충 식염수 (FBS / PBS)에서 10 %의 열 - 불 활성화 된 우 태아 혈청으로 준비한다.
    2. 헤파린 나트륨의 한 바이알 (300 개)에 FBS / PBS 1 ㎖를 추가한다.
    3. 선택 물고기 몸의 50 % 이상에서 종양 베어링, 또는 그 물고기는 어려움 먹고 수영을 가지고. tricaine 또는 얼음물에 담가을 했나봐하여 물고기를 희생. 아가미의 움직임과 심장 박동의 부족 (a)에 의해 죽음을 확인합니다.
    4. 물고기의 머리를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다.
    5. 과도한 적혈구를 제거하기 위해 헤파린 용액과 물고기의 구멍을 씻으십시오.
      1. 피펫을 사용하여, 물고기의 체강 내에 헤파린 용액 (단계 1.3.2에서 제조) 100 μL를 주입. 밖으로 유출 모든 액체를 제거합니다 (그것은 혈액 세포를 포함) 및 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫.
      2. 다시 몸을 씻어 신선한 피펫 팁을 사용합니다. 적어도 세 세척을 수행하거나 밖으로 유출 액체는 BL의 무료 나타날 때까지짐 우드.
      3. 이를 추가 분석에 사용되지 않으므로, 단계 1.3.5.1 및 1.3.5.2에 세척 모든 액체 폐기.
    6. 백혈병 세포를 수집합니다.
      1. 물고기의 체강 내에 FBS / PBS 100 ㎕를 주입한다.
      2. 종양 세포를 밀어 / 짜내 피펫 팁과 물고기의 몸의 외부에 부드러운 압력을 적용합니다.
        주 :이 단계는 해부 현미경을 사용하여 수행되는 경우 체강 흘리 종양 세포가 명백 할 것이다.
      3. 각 액상 세포 수집은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 세척 하였다.
      4. 단계를 반복 1.3.6.1-1.3.6.3 종양 세포의 대부분은 (일반적으로 5 ~ 10 회)를 수집 할 때까지. 동일한 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 모든 종양 세포를 수집한다. 실온에서 세포를 유지합니다.
    7. 부드럽게 세포 덩어리 해리하도록하여 피펫 팅 단계 1.3.6에서 수집 된 종양 세포를 섞는다. 4 통해 세포 현탁액을 필터0 ㎛의 메쉬 필터. FBS / PBS 100 μL와 필터 1-2 회 반복한다. 실온에서 세포를 유지합니다.
    8. 새로운 튜브에 트리 판 블루 18 μL (0.4 %로 1:10으로 희석하고 여과)하여 세포 현탁액 2 μL를 섞는다. 로드 혈구 10 μL와 격리 된 종양 세포의 수를 계산하는 라이브 (비 블루) 형광 세포의 수를 계산합니다.
      참고 : 비 블루 GFP - 부정적인 세포가 가능성이 정상이 아닌 악성 T 세포이며, 계산되어서는 안된다. 적어도 2 × 106 세포 훽스트 33342로 세포를 염색하기 위해 요구된다.

훽스트 (Hoechst) 33342 2. 염색 찬란 레이블이 T-ALL 세포는 사이드 인구를 식별하는

  1. 1 ㎎ / ㎖의 농도를 작동하도록 클레아없는 H 2 O로 훽스트 33342 1:10 희석. 4 ℃에서 어둠에서 염료를 저장한다.
  2. 디메틸 설폭 사이드 1 ㎖ (DMSO) 49.1 mg을 용해시켜 베라파밀의 100 mm의 용액을 제조 하였다.
    참고 : 베라파밀은 ABC 트랜스 포터의 억제제 및 측면 인구 실험을위한 중요한 컨트롤입니다. 샘플 베라파밀를 추가하면 훽스트 33342 염색을 유출하는 ABC 수송의 기능을 억제한다. 베라파밀이 샘플에 추가 될 때 따라서, 진정한 측면 인구는 사라집니다.
  3. 28 ° C에 수욕을 설정합니다.
  4. 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS) 튜브 셀 솔루션을 추가하여 어두운 곳에서 샘플 및 제어를 준비한다.
    1. 106 개 세포를 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342 및 FACS 튜브 DMSO 2.5 μL를 첨가하여 샘플을 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다.
    2. FACS 튜브 베라파밀 106 셀, 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342, 100 mM의 2.5 μL를 추가하여 제어를 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다.
      참고 : 10 개 6 세포의 최소 / 샘플 권장되지만 더 세포를 염색 특히 측면의 populat 경우 바람직이온 전지는 추가 분석을 위해 정렬된다. 106 개 세포 / ㎖를 초과하고, 15 ㎍ / ㎖의에 훽스트 33342 농도를 유지하지 않는다. 10 × 106 세포를 염색하는 경우, 총 반응 부피 10 ㎖이다.
  5. 120 분 동안 어둠 속에서 28 ° C의 수조에서 인큐베이션.
  6. 배양 후, 얼음에 즉시 세포를 배치하고 어두운에 보관하십시오.
  7. 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ml로 세척 하였다.
  8. 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁.
  9. 세포 정렬 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
  10. 정렬 셀 FBS / PBS 각각 1 mL의 요오드화 프로피 듐 (PI) 재고 2 μL (1 ㎎ / ㎖)을 첨가하기 전에 15 분 (최종 농도 2 ㎍ / ㎖). 잘 섞다.

3. FACS 찬란 레이블이 T-ALL 세포 인구 내에서 사이드 인구를 찾기

  1. Hoechst 33342 염료 여기를위한 UV 레이저와 PI 자극 및 GFP + T-ALL 세포의 검출을위한 488 nm 레이저가 장착 된 셀 분류기에서 얼룩진 제브라 피쉬 T-ALL 세포 현탁액을 분석하십시오.
  2. 살아있는 GFP + T-ALL 세포의 게이트를 결정하십시오.
    1. 파편을 게이트 아웃하려면 FSC (forward scatter) 및 SSC (side scatter) 영역을 사용하십시오.
      참고 : FSC는 셀 크기를 구별하는 데 사용되고 SSC는 셀의 세분성을 구별하는 데 사용됩니다.
    2. 이중 선별을 위해 FSC와 SSC 너비를 사용하십시오.
      참고 : 유동 세포 계측기 감지기로 식별되는 세 가지 구성 요소가 있습니다 : 면적, 높이 및 너비. 면적은 일반적으로 세포의 형광을 측정하는 데 사용됩니다. 너비는 비행 시간을 측정하며 두 개의 세포가 함께 뭉치면 두 배가됩니다.
    3. 살아있는 종양 세포의 경우 적절한 검출기 ( 예 : GFP의 경우 FITC, PI의 경우 PerCP Cy5-5)를 사용하여 GFP가 양성이고 PI가 음성 인 세포 주위에 게이트를 그립니다.
  3. 생균 게이트 (각각 50분의 450 및 30분의 670 등) 훽스트 블루 및 레드 훽스트 대역 통과 필터를 통해 훽스트 33342 형광을 측정한다.
    참고 :이 설정 한 후 측면 인구가 존재한다면, 분명있을 것입니다. 그것이 진정한 측면 인구 고려되어야 할 중요한 측면 인구는 순서대로 베라파밀 제어 사라해야합니다.
  4. 상기 실험 측부 세포 집단을 분류하면, 큰 노즐 팁 (100 μm의)을 사용하여 100 % FBS의 3 ㎖을 함유하는 FACS 튜브에 세포를 수집한다. 정렬 후에 세포 생존을 향상시키기 위해 더 큰 노즐 팁 (100 μm의) 대신 작은 팁 (70 μm의)을 사용한다.

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결과

효율적 제브라 형광 myc의 유도 된 T-ALL 종양을 생성하기 위해 트랜스 TOL2의 사이트에 의해 측면 원형 DNA 구조체는 TOL2의 RNA와 공동으로 주입 될 수있다. 제브라 피쉬의 수정란으로 선형화 된 DNA의 주입 이전 연구에서 5 %의 형질 전환 레이트 8보고한다. 프로토콜 TOL2 - 매개 형질 전환 등을 조정하여, 10-44 %의 범위의 형질 전환 비율 (표 1)를 관찰 할 수있다.

대표적인 예에서, GFP + T-ALL과 물고기 측면 인구 세포의 비율을 결정하기 위해 훽스트 (Hoechst) 33342로 염색했다. 그림 1은 측 인구 세포의 비율을 결정하는 데 사용되는 게이팅 방식을 보여줍니다. 먼저, FSC 및 SSC를 이용하여 T-ALL...

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토론

측면 집단 분석은 매우 민감합니다. 따라서 프로토콜을 조금만 변경하면 측면 세포를 검출하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 얼룩 단계 동안 온도는 각 동물 / 세포 시스템에 특정입니다. 포유류 시스템의 경우, 측면 집단 분석은 일반적으로 37 ° C에서 수행됩니다 2 . 제브라 피쉬 T-ALL 세포가 37 ℃에서 배양되었을 때, 많은 세포가 죽어서이 배양 온도를 용납 할 수 없게 만들었다 (데이터는 표시되지 않음). Kobayashi와 동료 (2008)가 측 모집 분석을 위해 zebrafish kidney marrow를 해부 시켰을 때, 배양은 25 ℃에서 수행되었다. 이 인큐베이션 온도는 약한 Hoechst 33342 프로파일 (데이터는 표시되지 않음)을 나타 내기 때문에 제브라 피쉬 T-ALL 세포에는 충분하지 않았습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 28 ° C의 인큐베이션 온도는 세포 생존 능력을 유지하고 강한 Hoechst 33342 프로파일을 얻기에 최적입니다. <...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 시카고 대학 여성위원회 (University Board of Chicago Women Board), 웬디 윌 사건 기금 (Wendy Will Case Fund), 시카고 대학 종합 암 센터 지원 교부금 (P30 CA014599)에 의해 지원되었습니다. 이 실험을 설정하는 데 도움을 주신 시카고 대학교의 Flow Cytometry Core와 de Zhong 연구실의 다른 회원, 특히 Leslie Pedraza 및 Sean McConnell에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Syngeneic zebrafish (CG2)See Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc plasmidLangenau Laboratory
rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Labrag2 promoter from Langenau Laboratory
pCS2-transposase plasmidChien 실험실
NotI -HF 제한 효소New England Bio-Labs Inc.R3189S25 µ에 있는 500 단위; L
mMessage Machine SP6 전사 키트AmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 반응
QIAGEN 플라스미드 미디 키트Qiagen, Inc.12643
SteREO Discovery V8 현미경Carl Zeiss 현미경495015-0008-000
디지털 마이크로 인젝터Tritech ResearchMINJ-D
황동 스트레이트 암 바늘 홀더Tritech ResearchMINJ-4
마그네틱베이스 및 스탠드Tritech ResearchMINJ-HBMB
MicromanipulatorNarishige 국제MN153
유리 모세관Sutter Instrument Co.B100-50-1010cm 필라멘트 제외
Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러Sutter Instrument Co.P-97
Microloader 피펫 팁Eppendorf North America Inc.
페놀 레드 용액Sigma Life ScienceP02900.5% 농도 100mL
플라스틱 이송 피펫Fisherbrand137119D눈금 7.5mL 전구
트리카인 메탄설포네이트(MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific -NC0342409 100g
소 태아 혈청(FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco by Life Technologies1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
헤파린 나트륨 염Sigma-Aldrich210615 - 300 단위 바이알
40 &마이크로; m 메쉬 필터Falcon Corning Brand35234050개입
Trypan blueSigma Life ScienceT815420 mL - 용액 (0.4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
VerapamilSigma Life ScienceV46291 g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidium 요오드화물생명 기술P356610mL
FACSaria Fusion 세포 분류기BD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
930001007

참고문헌

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Hoechst 33342TT

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