방법 논문

알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 중국 남부의 잔디 꽃가루 알레르겐에 대한 연구를위한 성분 분석 진단법

DOI:

10.3791/55723

⸱

2017년 6월 4일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, 2National Clinical Research Center of Respiratory Disease, 3Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, 4Department of Allergy and Clinical Immunology, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 5Department of Respiratory Medicine, Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 연구는 알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 중국 남부의 환자 집단에서 꽃가루 알레르겐에 대한 민감성을 연구하기 위해 성분 분석법을 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

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잔디 꽃가루에 과민 반응은 알레르기 성기도 질환에 대한 세계적 위험을 부과합니다. 예방은 꽃가루 알레르겐에 대한 지역 조사에 의존하지만이 주제에 관한 데이터는 중국 남부 지역에 한정되어 있습니다. 입수 가능한 모든 자료는 자체 신고 설문지, 피부 찌름 검사 및 원유 추출물을 사용한 총 IgE 또는 특이 IgE 검사에 의해 얻어졌다. 여러 가지 이유로 이러한 방법은 신뢰할 수 없습니다. 알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 동반 한 광저우 광역 (중국 남부 최대 도시 및 그 외곽)의 환자 집단에서 버뮤다 풀, 티모시 잔디 및 Humulus scandens 알레르겐에 대한 혈청 sIgE 반응성을 완전 자동 면역 분석기를 구성 요소로 사용하여 검사했습니다 해결 된 진단 (CRD) 도구.

처음으로 알레르기 비염 및 / 또는 천식이있는 중국 남부에서 버뮤다 풀 sIgE 양성율이 상당히 높은 것으로 나타났습니다. 이 환자들에게서 미묘한 감작의 유행후자의 두 가지가이 지역에서 공통적이지 않기 때문에 교차 반응 (cross-reactivity)으로 인해 발생할 수있는 티모시 잔디 (Timothy grass)와 흄스스런 스 (Humulus scandens) 에 주목했다. 이것은 또한 알레르겐 성분의 검출에 의해 뒷받침되었다.

완전 자동화 된 면역 분석 분석기는 시간이 지남에 따라 지역, 실험실 및 기관간에 만족할만한 일관성을 제공 할 수 있습니다. 장비의 자동성은 CRD의 출현 전에 쉽게 밝혀지지 않았을 표준화 된 탐지를 가능하게 할 수 있습니다.

이것은 중국 남부의 잔디 꽃가루 알레르겐에 대한 민감성을 조사하기 위해 CRD 접근법을 사용하는 연구입니다. 그것은 문헌의 현재 증거에 추가됩니다. 이러한 연구 결과를 검증하기 위해서는 앞으로의 연구가 필요합니다. 그러나 CRD가 유용한 도구 임에도 불구하고 완전 자동화 된 면역 분석기로 작성된 결과는 다른 검사실 조사, 임상 평가 및 의사 전문 지식을 대신해서는 안됩니다.

서론

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잔디 꽃가루는 면역 글로불린 E (IgE) 관련 알레르기의 거의 50 %를 차지하고 공기 중의 특성 때문에 알레르기기도 질환, 특히 천식과 알레르기 성 비염 1 , 2 , 3 , 4 의 세계적 위험을 부과합니다. 지역의 풀 꽃가루 알레르기에 대한 예방은 꽃가루 알레르겐의 지역 분포에 대한 정보에 의존합니다. 불행히도, 감작 알레르기 항원의 스펙트럼은 지역마다 다르며 일반적으로 지역 특이성으로 알려져 있습니다.

광대 한 동아시아 영토 인 중국에서는 초반 꽃가루 감작의 지역 특이성이 지난 수십 년 동안이 나라 남부에서 현재 이용할 수있는 제한된 자료에 의해 더욱 복잡해졌습니다. 이러한 자료 부족으로 전체적인 꽃가루 감각을 나타내는 데 어려움을 겪었습니다이 큰 나라에서의 화법 6 . 또한 중국 남부 지역의 매우 제한된 자료는 주로자가 신고 설문지, 피부 검사 (실험실 혈청 검사보다는), 총 IgE 측정 (알레르기 항원 특이 IgE (sIgE)보다는), sIgE 검출 (알레르기 항원 알레르겐 성분 분자보다는).

특정 알레르겐이 관련되어있을 때 알레르기 증상의 자체보고는 신뢰할 수 없습니다. 피부 찌름 검사는 광범위하게 접근 할 수 있지만 비 표준화 된 알레르겐 추출물의 사용을 포함하며, 그 자체가 결과 해석을 혼동시키는 다른 민감성 요소를 포함 할 수 있습니다. 피부 단자 검사의 신뢰성은 또한 알레르기 전문의 나 전문 간호사의 숙련 된 조작, 최근의 히스타민 사용, 환자의 순응도 (때로는 어린 어린이에게는 매우 어려움)에 따라 결정됩니다. 총 IgE는 알레르기 선별에 유용하지만 th를 현명하게 결정하지는 않습니다.환자의 알레르겐을 유발합니다. 더욱이, 거의 모든 알레르겐은 수많은 알레르겐 성분 분자를 포함합니다. 주요 성분 ( 예 : 집먼지 진드기의 Der p 1과 Der p 2)에 대한 민감성은 "진정한"알레르기 (다른 알레르겐과의 교차 반응으로 인한 위양성보다는 특정 알레르겐에 대한 알레르기)를 나타내지 만 감작 ( 즉, 교차 반응성 Der p 10, 트로포 미오신)은 그렇지 않을 수 있습니다.

CRD (component-resolved diagnostics)가 도입되기 전에 이러한 실망스러운 결과로 중국에서의 알레르겐 연구가 저해되었습니다. CRD는 재조합 또는 정제 된 알레르겐 분자를 사용하여 알레르겐의 성분을 정확하게 검출함으로써 쉽게 측정 가능하고 특징화할 수있는 측정을 가능하게합니다. 지난 수십 년 동안 알레르기 연구는 필연적으로 여러 가지 무관 한 구성 요소를 포함하는 알레르겐의 조 추출물을 자주 사용했습니다. 이 공동의 많은지지자는 불활성이지만 때로는 혼란스런 긍정적 반응으로 이어질 수도 있습니다. CRD에서 재조합 또는 정제 된 알레르겐 분자를 사용하면이를 회피 할 수 있으므로 시험의 정확성이 향상됩니다. microarrays에서 가공 될 때, CRD 접근은 빨리 개인적인 주제에있는 알레르겐 분자의 수백에 과민성을 검열하거나 확인한다. 중국 남부의 잔디 꽃가루 감작에 대한 잘 설계된 CRD 연구는 현재 부족합니다. 이상적으로, 그러한 연구는 상당한 지리적 범위의 지역 인구를 포함해야하며, 중국에서 일반적으로보고 된 잔디 꽃가루를 고려해야하며 위에서 언급 한 기술적 측면을 언급해야합니다. 실용 수준의 임상 관련성을 확보하고 혈청 검체의 징집을 용이하게하기 위해 흡입 알레르기 항원 인 잔디 꽃가루에 대한 민감성에 대한 조기 조사는 일반인보다는 알레르기 성 호흡기 질환 환자에게 초점을 맞출 수 있습니다.

이 작품은CRD 접근법을 사용하여 알레르기 성 비염 및 / 또는 천식을 앓고있는 광저우 광저우 (중국 광역시 및 그 외곽 지역) 환자에서 버뮤다 풀, 티모시 잔디 및 Humulus scandens 에 대한 혈청 sIgE 반응성을 테스트하는 데 사용되었습니다. 중국 남부의 아열대 및 온대 잔디 꽃가루에 대한 감작에 대한 이러한 발견은 현재 문헌에서 중요한 증거를 추가하고있다.

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프로토콜

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인간 혈청 샘플 사용을 포함한 연구 프로토콜은 광저우 의과 대학의 첫 번째 부속 병원 인 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 참가자는 독립적으로 또는 부모 (자녀의 경우 )를 통해 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜은 온라인으로 등록되었습니다 (중국 임상 시험 등록 번호 : ChiCTR-DCC-13004003, http://www.chictr.org/cn/ 참조).

1. 연구 집단의 확인

참고 : AIR는 중국 남부의 알레르기 항원 검사를위한 가장 잘 문서화 된 대용량 데이터베이스이므로 호흡기 질환 주요 연구실 (AIR-SKLRD)의 알레르기 정보 저장소 (AIR-SKLRD)가 환자 모집의 주요 원천입니다. AIR는 거의 10 년 동안 환자의 혈청 샘플을 보관 해왔다. 간단히 말하자면, 이들 저장 샘플은 미리 5 mL의 원심 분리정맥혈을 3,000 xg에서 10 분간 정맥 내로 채취하고 상등액을 회수 하였다. 혈청 샘플을 장기 보관을 위해 -80 ° C의 냉장고에 넣었습니다. 환자 삽입 기준을 충족시킨 샘플은 현재 연구에서 모든 테스트에 사용할 준비가되었습니다.

  1. AIR 데이터베이스에서 2013 년 1 월에서 2015 년 6 월 사이에 잔디 알레르기 항원 검사를받은 알레르기 비염 및 / 또는 천식 환자 데이터를 미리 디자인 된 연구 기간 동안 검색하십시오.
  2. 알레르기 성 비염 및 천식에 미치는 영향 (ARIA) 11 및 천식 (GINA) 글로벌 지침 12 지침에 따라 알레르기 성 비염 및 / 또는 천식이 경증 또는 중등도 인 환자를 선택하십시오. "스터디 그룹"으로 지정하십시오.
  3. 불완전한 의료 기록이있는 환자, 추적 조사를 위해 잃어버린 환자, 과학적 목적을 위해 혈청 샘플을 사용하는 것에 대해 정보에 입각 한 동의를 거부하는 환자, 확인 된 환자현재 면역 요법 또는 면역 조절제에있는 환자 또는 기생충 감염이있는 환자.
  4. 동일한 제외 기준에 따라 비 호흡기 알레르기 환자 ( 예 : 습진, 알레르기 성 피부염 및 음식 알레르기)를 선택하여 "대조군"으로 지정하십시오.
  5. 검사 결과에 혼동을 최소화하기 위해 처방전이나 치료법을 받기 전에 혈청 샘플을 채취했는지 확인하십시오. 이 요구 사항을 충족시키지 못하는 모든 혈청 샘플을 제외하십시오.
  6. 모든 과목이 광저우 광역의 모든 지역에서 영주권을 가졌는지 확인하십시오 ( 즉, 10 년 이상 거주했거나 거주 한 상태).

2. 연구 흐름 및 관심 측정

  1. 자격있는 환자의 혈청 샘플을 바이오 뱅크에서 검색하십시오. 알레르기 항원 / 알레르기 항원 성분을 검사하려면 140 μL의 혈청 (100 μL을 포함하여 기입하십시오죽은 공간을 위로).
    참고 : 본 연구에서 각 환자에게 필요한 최대 총 혈청 용적은 다음과 같습니다 : 3 개의 특정 알레르겐과 8 개의 알레르겐 성분, sIgE = 140 μL * 11 = 1,540 μL.
  2. 이기구를 사용할 때는 주로 버뮤다 풀, 티모시 풀, Humulus scandens 의 전체 알레르겐에 대한 sIgE의 혈청 샘플을 테스트하십시오. 3 절의 지침을 따르십시오.
    참고 :이 꽃가루는 버뮤다 풀 13 , 14 , 15 와 Humulus scandens 16 이 중국에서 널리보고 되었기 때문에 측정을 위해 선택되었으며, Timothy grass 17 , 18 , 19 는 열대에서 온대에 이르는 전형적인 식물 종입니다 영역이며 전세계에서 가장 많이 연구되고 있습니다.
  3. 2 차적으로, 2.3 단계에서 확인 된 혈청 샘플을 검사하여버뮤다의 알레르겐 성분에 대한 sIgE의 존재에 대한 전체 알레르겐에 대한 sIgEs [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Php 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209) ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211) 및 Phl p 12 (g212)] 및 교차 반응성 탄수화물 결정 인자 [CCD (o214)]. 3 절의 지침을 따르십시오.

3. Immunoassay 분석 시스템을 이용한 완전 자동 시험 절차

참고 : 완전히 자동화 된 알레르기 항원 검사의 전체 절차는 7 , 8 , 9 , 10 의 다른 곳에 기술되어 있으며 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.

  1. 완전 자동화 된 면역 분석기 ( 예 : ImmunoCAP1000)를 시작하고 연구 전반에 걸쳐 면역 분석을 수행하기 위해 사용하십시오. 기본 제공되는 정보 데이터 관리 (IDM) 컴퓨터를 켭니다.
    참고 : 면역 분석 항문yzer는 일상적으로 대기 모드입니다.
  2. "Primary Power"가 켜지면 "System Power"를 켜고 내장 소프트웨어가 시작될 때까지 3 분간 기다립니다. "린스 솔루션로드"및 "워시 솔루션로드"를 클릭하십시오.
  3. 각 알레르겐 / 알레르기 항원 검사를 위해 140 μL의 혈청을 바이알에 넣으십시오. 각 환자에게 고유 한 식별 번호가있는 140 μL의 혈청이 들어있는 각 약병에 표시합니다.
  4. IDM 인터페이스에서 메뉴를 클릭하여 다음 단계를 실행하십시오.
    1. IDM의 "Request List"창에서 "sIgE"가 선택 테스트 방법인지 확인하십시오.
    2. 시료 튜브를 시료 랙에 넣고 품질 관리 튜브를 바코드가있는 품질 관리 랙에 넣습니다.
      참고 : 각 환자에 대해 처음에는 3 개의 특정 알레르기 항원과 8 개의 알레르겐 구성 요소 또는 346 * 11 (3,806) 개의 샘플 튜브에 대한 테스트가 진행되었습니다. 각 샘플 튜브에 대해 3 개의 품질 관리 튜브medium, high level의 sIgE control을 포함하고 있습니다 (자세한 내용은 Table of Materials 참조). 결국, 1 차 시험 (단계 2.3)에서 양성 반응을 보인 58 명의 환자 만이 2 차 시험 (단계 2.3)에서 추가로 검사되었다. 튜브의 적재는 컴퓨터 콘솔에서 자동으로 설정할 수 있습니다.
    3. "Assay Processing"화면에서 "Load Reagents"를 선택하십시오. "Loadlist"에 따라 시료 및 품질 관리 랙, 개발 솔루션, 컨쥬 게이트, 캘리브레이터, 캐리어, 피펫 팁, 정지 용액 및 세척 솔루션의 로딩을 완료하십시오 (자세한 내용은 표 참조).
    4. "로드 및 시작"에서 "확인"을 누릅니다.
      참고 : 측정이 끝나면 결과가 IDM에 나타납니다.
    5. IDM 인터페이스에서 내보낼 데이터를 선택하십시오. "메뉴", "승인"및 "다른 이름으로 저장"을 클릭하고 sIgE 측정 결과를 스프레드 시트 파일로 내 보냅니다.
    6. 스프레드 시트 파일을 통계 소프트웨어 ( 예 : SPSS) 10로 가져옵니다. SPSS 메뉴의 Spearman 계수에 대한 특정 모듈을 사용하여이 잔디 꽃가루 (양성 sIgE 대 전체 알레르기 항원)와 꽃가루 성분 (양성 sIgE 대 알레르겐 분자) 간의 민감성 상관 관계를 분석하십시오.

4. sIgE 반응성의 정의

참고 : 희석하지 않은 혈청 검체의 경우 특정 IgE 측정 범위는 0.35 ~ 100 kU / L입니다.

  1. sIgE 값> 100 kU / L 1 : 5로 희석하여 재 검정하십시오. 값이 100 kU / L 이상으로 유지되는 경우, 1,000 kU / L까지 종점 수준에 도달 할 때까지 추가 희석을 진행하십시오.
  2. 0.35 kU / L의 역치 값을 기준으로 0.35 kU / L를 초과하는 sIgE 수준은 양의 5 , 7 , 10으로 간주합니다. 반응을 평가하십시오.sIgE 검사의 등급은 클래스 1 (≥0.35 및 <0.70 kU / L), 클래스 2 (≥0.70 및 <3.50 kU / L), 클래스 3 (≥3.50 및 <17.50 kU / L), 클래스 4 17.50 및 <50.00 kU / L), 클래스 5 (≥ 50.00 및 <100.00 kU / L) 및 클래스 6 (≥100.00 kU / L).

5. 통계 분석

  1. 통계 소프트웨어 ( 예 : SPSS)를 사용하여 데이터 분석 10 . 정량적 데이터를 평균 및 표준 편차로보고하고, 정 성적 데이터를 중간 및 사 분위 범위 (IQR)로, 그리고 범주 형 데이터를 양성 결과의 비율로보고합니다.
  2. 비율의 집단 간 비교, 정량적 데이터에 대한 비공유 t- 검정, 정 성적 데이터에 대한 순위 합계 테스트를 위해 카이 제곱 검정을 사용하십시오.
  3. 상관 계수를 "r"로 표현한 파라 메트릭 데이터와 비 파라 메트릭 값에 대한 Spearman의 테스트 사이의 상관 분석을 위해 피어슨의 테스트를 사용합니다.그는 " r s "로 표현 된 상관 계수를 가지고있다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성을 고려하십시오.

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결과

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이 연구에 사용 된 완전 자동화 된 면역 분석기는 환자의 혈청 표본에서 관심 분자 (sIgE)와 반응하는 알레르겐 또는 알레르겐 성분을 공유 결합으로 덮은 고상 구조를 가지고 있습니다. 자동 프로그램으로 분석기는 150μL의 헹굼 용액으로 모든 비 특이성 IgE를 세척하고 이것을 5 번 반복합니다. 그런 다음 효소 표지 된 항 -IgE 항체 (50 μL)를 첨가하여 복합체를 만듭니다. 효소 표지 된 항 -IgE 항체 (접합체)는 특정 IgE에 결합하는 2 차 항체이다. 결합되지 않은 항 IgE 항체는 150 μL의 세척 용액으로 세척하여 제거합니다 (3 회 반복). 결합 된 복합체를 37 ℃에서 9 분 동안 현상 제 (50 μL)로 처리한다. 발달 제는 모든 결합 된 항 -IgE 항체를 차단하는 효소 - 소화제입니다. 후자는 알칼리성 조건 하에서 형광을 방출합니다. 반응은알칼리 정지 용액의 첨가. 이 후, 장비는 용리액을 짜내고 470 nm의 파장에서 생성 된 용리액의...

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토론

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완전 자동화 된 면역 분석 분석기는 시간이 지남에 따라 지역, 실험실 및 기관간에 만족할만한 일관성을 제공 할 수 있습니다. 이러한 자동 절차는 벤치 연구 및 임상 연구를 실질적으로 지원하고, 많은 알레르겐 및 / 또는 알레르겐 성분의 표준화 된 검출을 가능하게하고, CRD의 출현 전에 쉽게 밝혀지지 않았을 가능성이있는 알레르겐 교차 반응을 확인하는 것으로 밝혀졌다. 또한 엄격한 품질 관리를 통해 전체 테스팅 절차를 완료 할 수 있기 때문에 대규모 지리적 영역에 대한 설문 조사에서 요구되는 높은 처리량 방법을 고려할 수 있습니다. 테스트 절차는 대부분 컴퓨터 콘솔에 의해 수행되지만 몇 가지 중요한 문제를주의해야합니다. 이 기기는 사용자 매뉴얼을 엄격하게 준수하는 데 사용되어야합니다. 모든 수차는 불필요한 시험 오류, 기계적 손상 또는 레이저 빔이나 고전압으로 인한 인명 피해를 초래할 수 있습니다. 항상 en정확하고 정확한 교정 곡선이 시스템에 저장되었는지 확인하십시오. 이는 시험의 정확도와 관련이 있기 때문입니다. 그렇지 않으...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 그림을 준비하는 데 도움을 준 Yueming Su에게 감사드립니다. 이 연구는 광동 과학 기술 재단 (프로젝트 번호 : 2014A020212352), 광저우 교육 국 (1201630044, 1201630393) 및 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC 81572063, NSFC 81601394)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ImmunoCAP 1000 InstrumentThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)12-3800-01
Phadia Information Data Manager 소프트웨어 패키지Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)12-3801-11
소프트웨어 패키지, ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)12-3801-12
g2
( Thermo		Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-4131-01
g6
(Timothy grass)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-4100-01
w22
(Japanese Hop)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-4452-01
g216
(nCyn d 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-4972-01
g205
(rPhl p 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5234-01
g208
(nPhl p 4)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5288-01
g215
(rPhl p 5b)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-5338-01
g209
(rPhl p 6)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-5289-01
g210
(rPhl p 7)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-5290-01
g211
(rPhl p 11)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-5291-01
g212
(rPhl p 12)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 스웨덴 웁살라)14-5292-01
o214
Cross-Reacting carbohydrate determinants (CCDs)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5339-01
Specific IgE Conjugate 400Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9310-08
Specific IgE Calibrator StripThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9459-08
특정 IgE 곡선 제어 스트립Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9312-08
특정 IgE 항-IgE ImmunoCAPThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)14-4417-01
ImmunoCAP 특이 IgE 음성 대조Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9445-01
ImmunoCAP Specific IgE Control LThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9528-01
ImmunoCAP Specific IgE Control MThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9529-01
ImmunoCAP Specific IgE Control HThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9530-01
개발 솔루션Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9439-08
Stop SolutionThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)34-2271-58
세척 솔루션Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9202-08
FluoroCThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, 웁살라 스웨덴)10-9264-01
유지보수 솔루션 키트Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9476-01
군

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