전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

요약

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

초록

Murine 심근 세포는 심장 생리학 및 새로운 치료 전략에 대한 시험 관내 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 해리 된 심근 세포의 다세포 제제는 심장의 기계적 및 전기 생리 학적 성질에 영향을 미치는 심근 세포, 비 - 근세포 및 세포 외 기질의 생체 내 구조의 복합체 를 대표하지 못한다. 여기서 우리 는 생체 내 조직 구조와 같은 보존 된 생쥐 심근의 실용적 심실 슬라이스를 준비하고 전기 생리 학적 기록에 대한 적합성을 입증하는 기술을 설명합니다. 심장 절제 후 심실을 심방에서 분리하고 2,3-butanedione monoxime이 포함 된 Ca ^2+가 없는 용액으로 관류하고 4 % 저 용융 아가로 오스 블록에 묻힌다. 블록을 진동 날이있는 마이크로톰 위에 놓고 150-400 μm 두께의 조직 절편을 준비하여 진동을 유지합니다. fre블레이드를 가능한 한 천천히 앞으로 움직이게합니다. 조각의 두께는 추가 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 슬라이스는 0.9 mM Ca ²⁺ 및 2,3- 부탄 다이옥신 모노 옥심 (BDM)을 함유 한 차가운 타이로드 용액에 30 분 동안 저장한다. 그 후, 슬라이스를 37 ℃의 DMEM으로 옮겨 30 분간 BDM을 세척한다. 조각은 수축 기능을 분석하거나 이식 된 줄기 세포 유래 심근 세포와 숙주 조직의 상호 작용을 조사하기 위해 힘 측정을 위해 날카로운 전극 또는 미세 전극 배열을 이용한 전기 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다. 날카로운 전극 녹음을 위해, 슬라이스는 거꾸로 현미경의 가열 판에 3cm 세포 배양 접시에 배치됩니다. 슬라이스는 단 극성 전극으로 자극되고 슬라이스 내의 심근 세포의 세포 내 활동 전위는 날카로운 유리 전극으로 기록됩니다.

서론

얇은 조직 조각은 Yaman과 Mcllwain이 1966 년에 뇌 조각의 전기적 활동이 시험 관내에서 유지 된다는 것을 보여주기 때문에 기초 과학에서 자주 사용되었습니다 ¹ . 그 이후로 뇌 ² , 간 ³ , 폐 ⁴ 및 심근 조직 ^{5 , 6 , 7의} 조각에 대해 전기 생리 학적 및 약리학 적 연구가 수행되었습니다. 신생아 쥐의 심실 조각에서 첫 번째 패치 - 클램프 녹음은 1990 년 ^{8 월} 에 기술되었지만,이 기술은 오랫동안 망각에 빠졌다. 10 년이 지난 후에, 우리 그룹은 쥐 배아 ⁹ , 신생아 ¹⁰ 및 성인 ¹¹ 심장 조각을 준비하는 새로운 방법을 확립했습니다. 이러한 생존 가능한 조직 절편은 급성 실험 (성인 슬라이스몇 시간 동안 배양 할 수 있음) 또는 단기 배양 실험 (배아 및 신생아 슬라이스를 며칠 동안 재배 할 수 있음). 전기 생리학적인 특성과 날카로운 전극 활동 전위 및 미세 전극 배열 녹음 ¹¹ 에 의해 평가 된 동질적인 자극 확산과 같은 생체 내 슬라이스가 표시 됩니다 . "2 차원"형태로 인해 심전도의 모든 영역에 녹음 전극을 직접 액세스 할 수 있기 때문에 전기 생리 학적 연구를위한 흥미로운 도구가되며 Langendorff- 관류 심장 전체에 비해 새로운 실험 옵션이 제공됩니다. 베라파밀 (L-type Ca ²⁺ -channel blocker), 리도카인 (Na ⁺ 채널 차단제), 4- 아미노 피리딘 (비 선택적 전압 의존성 K ⁺ 채널 차단제) 및 리노피딘 (KCNQ K)과 같은 이온 채널 차단제에 대한 상기 약물의 약물 반응은, ⁺ 채널 차단기) ^{9 , 11} 는 해리 된 심근 세포에 대한 공지 된 효과에 상응 하였다. 등척성 힘 측정은 양의 힘 주파수 관계를 나타내었고 손상되지 않은 수축 기능을 강력하게 제안 하였다. 이러한 결과는 쥐 뇌실 절편이 생리 및 약리 연구를위한 시험 관내 조직 모델로서 적합 함을 입증했다. 또한, 심전도 기록과 결합 된 수축 심실의 심실 슬라이스는 전기 및 기계적 통합뿐만 아니라 이식 된 태아 ^{12 , 13 , 14} 및 줄기 세포에서 파생 된 ^{15 개의} 심근 세포의 성숙을 특성화하는 데 매우 유용한 도구임이 입증되었습니다.

요약하면, 심실 슬라이스는 귀중하고 잘 확립 된 다세포 조직 모델이며 해리 된 심근 세포와 Langendorff- 관류 된 심장을 보완하는 것으로 간주되어야합니다심장 혈관 연구에서 심장 내 모든 부위에 예리한 전극 기록과 같은 측정 기술의 직접 액세스뿐만 아니라 생체 내 조직 구조 (해리 된 세포와 대조적으로)를 제공한다는 큰 이점이 있습니다 (전체 심장 조제와는 대조적으로).

프로토콜

동물 취급은 지역 동물 복지위원회의 지침과 유럽 의회의 2010 / 63 / EU 지침에 부합해야합니다.

1. 솔루션 준비

1. NaCl 136, KCl 5.4, NaH ₂ PO ₄ 0.33, MgCl ₂ 1, 글루코오스 10, HEPES 5, 2,3- 부탄 디온 모노 옥심 (BDM) 30. pH를 7.4로 조절하여 Ca ²⁺ (mM 조성)없이 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ℃에서 NaOH로 처리 하였다.
2. NaCl 136, KCl 5.4, NaH ₂ PO ₄ 0.33, MgCl ₂ 1, 글루코스 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl ₂ 0.9를 사용하여 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ° C에서 NaOH로 pH를 7.4로 조절한다.
3. 4 % 저 용융 아가로 오스 준비 : Ca ^2+가 없는 15 mL Tyrode 용액에 0.6 g 저 용융 아가로 오스를 넣으십시오. agarose가 녹을 때까지 10-15 초 동안 750W에서 전자 레인지에서 2 번 혼합물을 가열한다. 용액을 37 ° C의 일정 온도로 유지하십시오.# 176; C를 연속적으로 저어 준다.
4. 37 ℃에서 혈청없는 Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)을 carbogen (5 % CO2, 95 % O2)로 버블 링하십시오.

2. 마이크로톰을 준비하십시오.

1. 마이크로톰을 켜십시오.
2. 외부 마이크로톰 챔버를 얼음으로 채 웁니다.
3. 내부 마이크로톰 챔버를 Ca ^2+가 없는 얼음 차가운 Tyrode 용액으로 채우고 100 % O ₂ 로 계속해서 용액에 산소를 공급하십시오.
4. Microtome의 블레이드 홀더에 스틸 블레이드를 놓습니다.

3. 마우스 심장 격리

1. 피하에 2,500 U 헤파린 주입. 15 분간 기다리십시오.
2. 자궁 경관 탈구로 동물을 희생.
3. 흉골 절개로 가슴을 엽니 다.
4. 조심스럽게 작은 가위와 집게 # 5를 사용하여 심낭을 절개하십시오.
5. 상행 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고 관상 동맥을 얼음으로 차가운 Tyrode 's로 관류시킵니다용액을 남은 혈액이 제거 될 때까지 제거한다.
6. 부드럽게 포셉과 가위로 심장을 절제하고 차가운 Tyrode의 용액을 Ca ²⁺ 없이 흘려 보내십시오.
7. 메스와 가위로 심방과 심방을 분리하십시오.

4. 4 % 저 융점 아가로 오스에 심실 내장

1. 정점이있는 심실을 아가로 오스 몰드 ( 그림 1 )에 위쪽으로 향하게하십시오. 좌심실의 금형 중앙에 핀을 놓습니다.
2. 심장이 완전히 덮일 때까지 37 ° C에서 4 % 저 용융 아가로 오스로 곰팡이를 채 웁니다.
3. 금형을 얼음에 담그면 아가로 오스가 빨리 경화되어 뜨는 것을 방지 할 수 있습니다.
4. 메스와 함께 금형에서 심실이 들어있는 아가로 오스 블록을 제거합니다.
5. 블록을 거꾸로 뒤집고 심실을 채우고 아가로 오스 블록의 뒷면에있는 간격을 채우십시오.s는 20G 바늘이 달린 주사기를 사용하여 4 % 저 용융 아가로 오스가있는 털갈이의 핀으로 남겨 두었습니다.
6. 메스로 아가로 오스 블록을 자르면 블록의 평평한 바닥과 심장 정점의 직립 위치를 얻을 수 있습니다.

5. 심실 조직 절개

1. cyanoacrylate 접착제 한 방울로 microtome의 표본 홀더에 블록을 고정하십시오. 심장 정점을 위로 향하게하십시오.
2. 표본 홀더를 칼슘 ^2가 없는 얼음처럼 차가운 Tyrode로 채워진 마이크로톰의 내부 표본 챔버에 놓습니다. Tyrode의 솔루션으로 아가로 오스 블록을 완전히 덮으십시오.
3. 추가 응용 프로그램 (날카로운 전극 녹음 150-200 μm의)에 따라 150-400 μm의 두께로 짧은 축 슬라이스를 준비하고 블레이드의 진동 주파수를 60-70 Hz로 유지하고 가능한 한 천천히 블레이드를 앞으로 이동시킵니다 .
4. 작은 브러시를 사용하여 슬라이스에서 남아있는 아가로 오스를 조심스럽게 제거하십시오.
5. 부드럽게 전송0.9 % 칼슘 ^{2 +} 100 % O ₂ 와 함께 Tyrode의 솔루션에 파스퇴르 피펫으로 슬라이스 슬라이스 절차에서 회복하기 위해 얼음에 최소한 30 분 동안 그들을 저장합니다.
6. 그 후 37 ℃에서 DMEM으로 30 분간 슬라이스를 유지하고 카보 겐이 폭기되어 BDM을 더 잘 사용하기 전에 씻어 낸다.

6. 샤프 전극 준비 준비

1. 예열의 경우 녹음이 시작되기 30 분 전 모든 전기 장치를 켜십시오.
2. 거꾸로 현미경에 배치 가열 플레이트에 3cm 세포 배양 접시를 넣어.
3. 접시에 맞춤형 링 전극 ( 그림 2 )을 놓고 전치 증폭기와 자극 전극의 접지선을 연결하십시오.
4. 관류 시스템의 유연한 튜브를 접시에 연결하십시오.
5. carbogen으로 폭기 DMEM와 재관류 시스템의 저수지를 입력하십시오.
6. 관류 펌프를 켜고 관류를 설정하십시오2 ~ 3 mL / min.
7. 유량 히터와 가열 플레이트를 조절하여 37 접시에 DMEM의 온도를 조정합니다.

7. 활동 잠재 녹음

1. DMEM 가득 접시에 심실 슬라이스를 놓습니다.
2. 거꾸로 된 현미경으로 조직의 구조적 무결성과 생존력 (수축 기능에 기반)을 확인하십시오.
3. 기록 용 유리 전극을 3M KCL로 채 웁니다.
4. DMEM으로 자극 전극을 채 웁니다.
5. 녹음 전극과 자극 전극을 전극 홀더에 놓습니다.
6. 슬라이스에 자극 전극을 조심스럽게 넣고 전기 자극기를 켭니다. 1-2 Hz의 자극 주파수로 시작하십시오.
7. micromanipulator와 함께 기록 전극을 의도 된 기록 위치로 이동시킵니다.
8. 팁이 조직에 닿을 때까지 녹음 전극을 천천히 내립니다.
9. 짧은 직사각형 전기 펄스를기록 전극은 세포막을 관통한다.
10. 안정된 신호가 확보 될 때까지 기록 전극의 위치를 ​​조심스럽게 바꾸십시오.
11. 활동 잠재력의 기록을 시작하십시오.

결과

심근 경색은 심근 세포의 사실상 비가 역적 손실을 초래합니다. 줄기 세포 유래의 심근 세포를 외인성 심장 재생에 사용하는 세포 대체 요법이 유망한 치료법이다. 이식 된 세포의 전기적 통합과 성숙은 세포 대체 요법의 안전성과 효율성을 위해 매우 중요합니다.

통합 및 성숙을 평가하기 위해 우리는 성숙한 생쥐의 건강한 심장에 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 발현하는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCM, 0.5 x 106 iPSCM / 10 μL 2 회 주사)에서 유래 한 심근 세포를 이식했다. (Peinkofer et al. 방법에 대한 자세한 설명은 ¹⁵ )을 참조하십시오. 이식 6 일 후에, 수혜자 심장의 심실 조각을 기술 된 프로토콜을 사용하여 준비 하였다. 대표적인 녹음은그림 3. 이식 ...

토론

심실 슬라이스는 조직 구조와 같은 생체 내에서 보존되고 심장의 모든 부위에 측정 기술을 직접 액세스 할 수있는 전기 생리 학적, 약리학 적 및 기계적 연구를 가능하게합니다. 생리 작용 잠재 성질은 배아, 신생아 및 성인 조각 ^{9 , 10 , 11} 에서 입증되었습니다. 슬라이싱 절차에 의해 직접적으로 손상된 표면층을 제외한 슬라이스의 활력은 활력 염색으로 확인되었습니다 ⁹ . 날카로운 유리 전극을 사용하는 조각 내에서의 활동 전위 기록은 여기에 설명 된 이식 된 심근 세포의 통합 및 성숙을 조사하거나 심장 활성 화합물을 첨가 한 후 약리학 연구에 사용할 수 있습니다. 개별 셀에서 1 시간 이상 지속되는 장기간 녹음이 가능합니다. 이 녹음 시간은 테스트하기에 충분합니다.순차적 재관류 및 세척에 의한 하나의 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
라이카 VT 1000s	라이카 마이크로시스템즈, 베츨라, 독일		진동 블레이드가 있는 마이크로톰.
스테인레스 스틸 블레이드	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
파스퇴르 피펫	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
파인 브러시, eg 크기 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
심	자체 만든
agarose			자체 제작
1 mL 주사기	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, 미국	300013
27 G x 3/4'' Needles	Braun, Melsungen, Germany	4657705
20 G 11/2'' Needles	4657519
Small Scissor	WPI, Sarasota, 미국	501263
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip	WPI, Sarasota, USA	500342
산소 가스(의료용 O2)	Linde, 독일 뮌헨
카보겐 가스 (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, 뮌헨, 독일
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, 미국	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미국	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
시아노아크릴레이트 접착제	Henkel, Dü sseldorf, Germany
Low-melt Agarose Roth	, Karlsruhe, Germany	6351.2
Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL	Ratiopharm, Ulm, Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, 독일
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, 독일
저배율 미세 조작기	Narashige, Tokyo, 일본	Nm-3
고배율, 3축 미세 조작기	Narashige, Tokyo, Japan	MHW-3
연동 관류 펌프	다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany	PPS2
2채널 온도 컨트롤러	다중 채널 시스템, Reutlingen, Germany	TCO02
사각 펄스 자극기	Natus Europe GmbH, Planegg, Germany	Grass SD9
Glass capillaries	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1

실을 내장하기 위해 Molt 준비 테이블