이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입

12K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55755

⸱

2017년 7월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 살아있는 두뇌의 세포 외 공간 (ECS)의 물리적 매개 변수를 측정하는 방법 인 실시간 이온 삼투압을 설명합니다. ECS로 방출 된 불활성 분자의 확산은 ECS 부피 분율 및 비틀림을 계산하는 데 사용됩니다. 그것은 뇌의 ECS에 대한 급격한 가역적 인 변화를 연구하는데 이상적입니다.

초록

이 리뷰에서는 살아있는 두뇌의 세포 외 공간 (ECS)을 탐구하고 정량화하기위한 금 이온 표준 인 실시간 이온 삼투압 (RTI) 방법을 수행하기위한 기본 개념과 프로토콜에 대해 설명합니다. ECS는 모든 뇌 세포를 둘러싸고 있으며 간질 액과 세포 외 기질 모두를 포함합니다. 신경 전달 물질, 호르몬 및 영양소를 포함한 뇌 활동에 필요한 많은 물질의 운반은 ECS를 통한 확산에 의해 발생합니다. 이 공간의 부피와 기하 구조의 변화는 수면과 허혈과 같은 병리학 적 상태와 같은 정상적인 뇌 과정에서 발생합니다. 그러나, 특히 병이있는 상태에서 뇌 ECS의 구조와 조절은 아직 미개척이다. RTI 방법은 살아있는 두뇌의 두 가지 물리적 매개 변수, 즉 체적 분율과 비틀림을 측정합니다. 부피 분율은 ECS가 차지하는 조직 부피의 비율입니다. 구불 구불 한 (tortuosity)은 뇌를 통해 확산 될 때 물질이 마주 치는 상대적인 방해의 척도이다장애물이없는 매체에 비해 RTI에서 불활성 분자는 근원 미세 전극에서 뇌 ECS로 펄싱된다. 분자가이 소스에서 멀리 확산함에 따라 이온의 변화하는 농도는 약 100 μm 떨어진 이온 선택 미세 전극을 사용하여 시간에 따라 측정됩니다. 결과적인 확산 곡선으로부터 부피 분율 및 비틀림을 계산할 수 있습니다. 이 기술은 여러 종 (인간 포함)의 뇌 조각과 생체 내 에서 ECS의 급성 및 만성 변화를 연구하는 데 사용되었습니다. 다른 방법과 달리 RTI는 실시간으로 두뇌 ECS의 가역적 및 비가 역적 변화를 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

세포 외 공간 (ECS)은 모든 뇌 세포 외부의 상호 연결된 채널의 네트워크이며 간질 액과 세포 외 기질 모두를 포함합니다 ( 그림 1a 및 그림 1b ). 영양소, 호르몬 및 신경 전달 물질을 포함한 뇌 세포 기능에 필요한 많은 물질의 분포는 ECS를 통한 확산에 의해 발생합니다. 체적, 기하학 및 세포 외 기질을 포함한이 공간의 물리적 매개 변수의 변화는 뇌 세포 기능에 중대한 영향을 미치는 뇌 세포를 목욕시키는 ECS 및 국소 이온 농도를 통한 확산에 크게 영향을 미칠 수 있습니다 1 , 2 .

실시간 이온 삼투압 (RTI)은 뇌 영역의 두 가지 구조적 특성을 결정하는 데 사용됩니다 : 체적 분율과 비틀림 3 , 4 ,"xref"> 5. 부피 분율 ( α )은 대표적인 기본 부피의 총 조직 부피 ( V 조직 )에 대한 ECS ( V ECS )가 차지하는 조직 부피의 비율입니다.

figure-introduction-1

구불러움 (tortuosity, λ )은 방해물이없는 매체에 비해 뇌 영역을 통해 확산 될 때 물질이 마주 친 상대적인 장애입니다.

figure-introduction-2

D의 * (cm 2 초 -1) 뇌 및 D의 물질의 유효 확산 계수이고 (cm 2 초 -1) 아가로 오스 겔을 희석 같은 자유 매질 물질의 자유 확산 계수이다.

오늘날 R에서 가장 일반적으로 사용되는 프로브 물질TI 법은 작은 양이온의 테트라 메틸 암모늄 (TMA)이다. TMA는 74g / mol의 분자량을 가지며 용액에서 완전히 해리되고 하나의 양전하를 띤다. 이 이온을 이용한 RTI 연구는 α figure-introduction-3 0.2 및 λ figure-introduction-4 1.6 1 , 2 . 이것은 ECS 작은 불활성 분자의 확산 장애물 3 중간 ECS보다 대략 2.5 배 더 느리게 발생하는 뇌 전체 부피의 약 20 % 인 것을 의미한다. 그러나 α 와 λ는 모두 뇌의 나이, 지역, 상태 및 병리학 적 조건에 따라 다양합니다 1 . 이러한 매개 변수의 변경은 뇌 발달, 노화, 수면, 간질 및 기타 여러 근본적인 과정과 뇌의 질병과 관련되어 있습니다 1, 6 . 다른 기술은 α 와 λ를 측정하지만, RTI는 실시간으로 살아있는 조직의 국부적 인 영역에서 양자를 측정 할 수 있습니다. 이러한 이유로 RTI는 급성 및 가역적 인 챌린지 기간 동안 α 와 λ의 변화를 조사하는 데 필수적인 도구가되었습니다.

RTI지지 이론은 원래 니콜슨 필립스에 의해 확인하고,이 기법은 시간 4,7 이후 광범위하게 사용되어왔다. RTI를 사용하는 실험은 희석 된 아가로 오스 겔로 이온 삼투압에 의해 근원 미세 전극으로부터의 TMA 펄스의 방출로 시작된다. 일단 방출되면, 이온은 잠재적으로 무한 수의 무작위 경로 ( 그림 1d )에서 선택하여 점원으로부터 자유롭게 확산됩니다. 이온의 변화하는 농도는 대략적으로 위치 된 이온 선택적 미세 전극 (ISM)을 사용하여 시간에 걸쳐 측정된다100 μm의 거리 ( 그림 1c ). TMA 농도의 변화를 그래프로 표시하고 이온 삼투압 미세 전극 (프로토콜에서 논의 된 매개 변수)의 D 와 운송 번호를 모두 계산할 수있는 곡선에 맞 춥니 다. 이 값을 사용하여 D * 를 구하고 α 와 λ를 모두 계산하기 위해 뇌의 관심 영역에서 절차를 반복합니다. 이온 삼투압 미세 전극의 제어, 데이터 수집, TMA 농도 곡선의 그래프 및 피팅 및 실험 매개 변수의 계산은 일반적으로이 목적을 위해 특별히 설계된 Wanda 및 Walter 프로그램에 의해 수행됩니다 (소프트웨어 및 설명서는 저자의 요청에 따라 자유롭게 이용 가능).

이 리뷰의 의정서 섹션은 설치류 뇌 조각을 RTI로 설계하고 수행하는 데 필요한 기본 절차를 설명합니다. 이 기술은 또한 비로드 (non-rod)생체의 뇌 제제 1, 4, 6, 8, 9, 인간의 뇌 조각을 포함하고있는 ENT 모델. 대표 결과 섹션에서는 데이터 해석의 뉘앙스를 강조하기 위해 이상 및 비 이상적인 결과를 제공합니다. 마지막으로, 토론 섹션에서는 문제 해결 기법, RTI의 한계, ECS를 연구하는 데 사용 된 대체 기술 및 RTI의 향후 적용에 대해 간략하게 설명합니다.

figure-introduction-5
그림 1 : ECS를 통한 확산의 다이어그램. ( a ) ECS 다이어그램 : 일반적인 뇌 영역에서 ECS의 크기와 위치를 보여줍니다. 노란색은 회색 뇌 세포 과정 사이의 ECS를 표시합니다. ECS의 부피는 전체 조직 부피의 약 20 %입니다 ( 즉, 부피비 = 0).2). ( b ) ECS의 확대 된 다이어그램 : 뇌 세포 기하학 (회색)과 세포 외 기질 (다색성 글리코 사 미노 글리 칸과 프로테오글리칸의 그물망으로 그려져 있음)을 포함하여 왜곡에 기여하는 물리적 매개 변수를 강조합니다. ( c ) 점 소스로부터의 확산의 3D 다이어그램 : 이온 주입 소스에서 ISM으로의 불활성 분자의 순 움직임을 보여줍니다. 확산 장벽과 세포 흡수를 제외하면, 분자는 모든 방향으로 바깥쪽으로 확산되어 구형의 집중 전면을 생성합니다. ISM은 이온 삼투압 소스로부터 방출 된 불활성 분자의 국소 농도를 정량화합니다. ( d ) 뇌의 ECS에서 확산의 컴퓨터 시뮬레이션 : [먼 왼쪽] 몬테카를로 시뮬레이션을위한 설정; 녹색 구체는 뇌 세포 과정을 나타내고 적십자는 점 근원을 나타냅니다. 이 설정은 그림 1a 에 표시된 뇌 조직을 모델링합니다. [중간 이미지] 3 및6 분자는 2 차원으로 나타낸 뇌의 세포 외 공간을 통해 확산 될 때 무작위 운동을 수행합니다. 점원에서 방출 된 많은 분자가 무작위로 걷습니다. 그림 1c 에서 묘사 된 것처럼 점원으로부터 모든 분자의 순수 이동은 바깥 쪽입니다. 누적 된 무작위 걷기는 세포 사이의 공간을 개괄합니다 ( 예 : ECS, 자세한 설명은 참고 자료 5 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

조직 샘플을 얻는 데 사용 된 모든 동물 절차는 SUNY Downstate Medical Center의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 솔루션 및 장비 준비

  1. ISM의 기준 배럴에 150mM NaCl 백필 용액을 준비하십시오. 0.22 μm 필터 (박테리아 또는 입자를 제거하기 위해)에 부착 된 10 mL 주사기에 보관하십시오.
  2. microelectrodes에 대한 150 MM TMA 염화물 (TMA - 클럭) backfill 솔루션을 준비합니다. 0.22 μm 필터에 부착 된 10 mL 주사기에 보관하십시오. 정확한 농도를 보장하기 위해 5M 제조업체 용액에서 TMA-Cl 용액 (이 프로토콜에서)을 준비하십시오.
  3. 적어도 2 시간 동안 표백제 (차아 염소산 나트륨)에 전선을 잠기 게하여 미세 전극 제조용으로 적어도 4 개의은 전선을 염화시킨다. 과량의 표백제를 에탄올로 제거하고 전선을 건조시킵니다.
  4. 비커에서 150 MM NaCl 및 0.5 MM TMA-Cl 중 0.3 % 아가 로즈 50 ML을 준비그것을 덮어 라. 좋은 확산 측정을 보장하기 위해 가루와 합리적으로 신선한 아가로 오스를 사용하십시오.
  5. 가열하고 아가로 오스 용액을 교반 막대와 혼합하여 용해시킵니다. 용액을 실온으로 식힌다. 이것을 1 ° C까지 4 ° C에 보관하십시오.
  6. 1 M KCl에서 4 % 아가로 오스로 만들어진 무관계 (접지) 전극 준비 (부록 A의 지침)
  7. 실험실에 들어갈 수 있고 내용물과 외부 환경 사이의 전기적 연속성을 허용하는 작고 다공성 인 컵을 제작하십시오 ( 그림 2a ). 부분적으로 물에 잠겼을 때 부풀지 않도록이 컵의 바닥에 금속 링을 놓습니다.
  8. ISM 교정을 위해 5M TMA-Cl 스톡을 연속 희석하여 100mL TMA-CL 용액 5 개를 만드십시오. 용액은 TMA-Cl 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM 및 8 mM의 최종 농도를 가져야한다. 증발을 방지하기 위해 밀봉 용액에 교정 용액을 보관하십시오.

2. 전자 설정

  1. 그림 2b 의 블록 다이어그램에 따라 실험 설정의 RTI 구성 요소를 연결합니다. 2 개의 입력 채널 (ISM의 이온 선택 배럴에 대해 매우 높은 임피던스 여야 함), 10Hz에서 설정된 로우 패스 필터, 차트 레코더, A / D + D / A 변환기, 이온 삼투압 장치 (또는 정전류 펄스를 공급할 수있는 증폭기) 및 Wanda 및 Walter 프로그램을 실행하는 컴퓨터 (PC)가 포함됩니다. 전자 설정을 검사하여 모든 연결이 제 위치에 있는지 확인하십시오.
  2. 필요한 경우 ISM이 높은 저항을 가지며 주변 움직임에 의해 생성되는 인공물에 민감하므로 접지 된 인클로저 (예 : 패러데이 케이지)에서 실험 설정을 보호하십시오.
  3. 이중 입력 증폭기, 차트 레코더, 적절한 ISM 홀더 및 무관 한 접지 전극으로 구성된 전용 ISM 교정 스테이션을 만듭니다. 가능하다면,인클로저를 보호하십시오. 실험 설정에서 ISM을 보정하는 경우이 단계를 건너 뜁니다 (3.29 단계)

figure-protocol-1
그림 2 : 다공성 실험 컵 및 전자 설정. ( a ) 다공성 실험 컵 : 아가로 오스 (내부)와 실험용 입욕액 (외부) 사이의 전기적 연속성을 허용하는 실험 컵을 만들기 위해 다공성 메쉬가 사용됩니다. 컵이 욕조에 떠 다니는 것을 방지하기 위해 컵의 바닥에 금속 링이 부착되어 있습니다. ( b ) RTI 설정의 블록 다이어그램 (2.1 및 2.2 단계) : ISM이 증폭기 (앰프)에 연결되어 있습니다. ISM에는 두 개의 배럴이 있습니다. 하나는 팁에 액체 이온 교환기 (LIX)를 포함하고 국소 주변 전압과 함께 팁에서 TMA 농도의 대수에 비례하는 전압을 생성합니다. 일e 신호 경로는 빨간색 선으로 표시됩니다. ISM의 다른 배럴은 기준 배럴로 알려져 있으며 ISM의 팁에서 주변 전압을 측정합니다. 그것은 청색 신호 경로로 연결됩니다. 증폭기에는 ISM에 연결되는 두 개의 소위 헤드 스테이지가 있습니다. 이들 유닛은 1 (x1)의 이득을 가지며 마이크로 전극의 하이 임피던스를 나머지 증폭기 회로의 로우 임피던스와 정합시킨다. 이온 선택 배럴에 연결된 헤드 스테이지는 약 1,000MΩ의 유입 저항과 일치 할 수 있어야하며 기준 배럴의 저항은 일반적으로 약 10MΩ입니다. 헤드 스테이지를 떠난 후 기준 배럴의 전압을 반전시키고 합산 증폭기 (Σ)를 사용하여 이온 선택 배럴의 전압에서 빼내 순수한 이온 신호 전압을 얻습니다. 증폭기의 출력은 추가 증폭 및 다중 폴 (multipole) 저역 통과 필터 (≤ 10 Hz, 일반적으로 Bessel fi필터는 노이즈를 제거하고 아날로그 - 디지털 변환기 (A / D)에서 신호 앨리어싱을 방지합니다. 필터의 출력은 스트립 차트 레코더에도 표시됩니다. A / D 컨버터는 신호를 디지털화하여 PC (personal computer)로 보냅니다. 또한 PC는 디지털 신호를 생성하여 D / A 변환기를 통해 이온 토 포레 시스 장치에 공급되는 아날로그 전압 펄스로 변환합니다.이 펄스는 전압을 일정한 진폭의 전류 펄스로 변환하여 전송합니다 이온 삼투압 미세 전극에 전달한다. 이온 삼투압 신호 경로는 녹색 선으로 표시됩니다. 데이터 수집 및 이온 삼투압 신호는 Wanda 프로그램의 통제하에 있으며, Wanda 프로그램은 실험을 정의하는 모든 매개 변수와 함께 전압 대 시간 기록의 형태로 각 확산 기록에 대한 출력 파일을 생성합니다. 두 번째 프로그램 인 Walter는 출력 파일을 읽고 ISM 교정 데이터를 사용하여 디지털화 된 전압을 농도로 변환합니다. 집중력rsus 시간 곡선은 Walter에서 확산 방정식에 대한 적절한 해답에 맞추어진다. D 와 n t 는 매체가 아가로 오스라면 추출되고 λ와 α 는 매체가 뇌인 경우 추출됩니다. 아날로그 신호는 실선입니다. 디지털 신호는 점선입니다. 또한 슬라이스를 함유 한 배쓰에 무관심한 접지 전극 (도시하지 않음)이있다. 빨간색 선 = 이온 신호, 파란색 선 = 기준 신호, 녹색 선 = 이온 삼투압 명령, 실선 = 아날로그, 점선 = 디지털. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 이온 선택적 미세 전극의 준비와 교정

  1. 실험 하루 전에 아래의 프로토콜을 사용하여 ISM을 제작하십시오. ISM을 일괄 처리하여 실험 당일에 적어도 두 가지가 작동하도록합니다.
    참고 : 대부분의 ISM은 하루 동안 안정적입니다.두. ISM 제작은 습도 및 대기 조건에 민감합니다. 모든 미세 전극이 성공적으로 교정되지는 않습니다.
  2. 오래된 포셉 한 쌍을 사용하는 이중 배럴 붕 규산염 유리 모세관의 배럴 중 하나 끝에 약 0.5cm 떨어진 유리 칩을칩니다.
  3. 모세관의 반대쪽 끝에 단일 배럴을칩니다 ( 그림 3a ). 격막이 손상되지 않았는지 확인하십시오 (위험). 주의 : 발사 유리로 인한 부상을 방지하기 위해 고글을 착용하십시오.
  4. 모세관을 적어도 1 시간 동안 아세톤 병에 넣고 오염 물질을 제거합니다.
  5. 아세톤에서 모세관을 제거하고 과량의 아세톤을 제거하기 위해 세척, 건조, 압축 질소 가스 또는 공기를 펄스하십시오. 남아있는 아세톤이 실란 화를 방해 할 수 있으므로 모세관의 모든 아세톤을 제거하십시오 (중요).
  6. 세로 또는 가로 풀러에 micropipette의 끝을 조작하십시오. 긴 테이퍼로 피펫을 당길 수있는 매개 변수를 조정하고날카로운 팁, 약 1 μm 이하의 직경. 이 단계가 끝나면 하나의 모세관이 두 개의 피펫으로 만들어집니다 ( 그림 3a ).
  7. 복합 10X 대물 렌즈가있는 직립 현미경으로 단일 마이크로 피펫을 시각화합니다. 팁의 최종 직경 ( 즉, 두 배럴)이 2 ~ 5 μm ( 그림 3b )가되도록 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 팁을 잘라냅니다. 이 피펫은 이제부터는 ISM이라고합니다.
  8. 0.22 μm의 필터와 28 G, 97mm 바늘 ( 그림 3B )에 부착 된 10 ML 주사기를 사용하여 부서진 측면에있는 구멍을 통해 150 MM NaCl 참조 솔루션 ISM의 부서진 배럴을 채 웁니다. 배럴 높이의 4 분의 3을 지나서 배럴을 채우지 마십시오.
  9. 150 mM TMA-Cl 백필 용액으로 ISM의 조각이 채워지지 않은 배럴을 채 웁니다. ISM을 가볍게 두 드리면 용액에서 공기 방울이 빠져 나옵니다. 마이크 아래에 거품이 있는지 확인하십시오.팁을 치핑하는 데 사용되는로 스코프.
  10. Bunsen 버너를 사용하여 ISM의 뒷면을 화염시켜 ISM 뒤쪽의 격벽을 가로 질러 백필 용액이 흐르지 않도록하십시오. 화염 후 ISM의 상단 1/4이 건조한 지 확인하십시오.
  11. 염화은 와이어를 ISM의 기준 용액에 넣고 모세관에서 튀어 나온 와이어를 구부려 기준 배럴 ( 그림 3c )으로 표시합니다. 와이어가 백필 용액에 잠기고 실험 기간 동안 용액에 남아 있는지 확인하십시오.
  12. 25G 주사기 바늘 끝에 짧은 길이의 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 튜빙 (약 20cm 길이)을 밀어 넣습니다. 이온 선택 배럴의 뒷면에 튜브의 다른 끝을 놓습니다. 튜빙이 배럴에 있지만 백필 용액보다 위에 있는지 확인하십시오 ( 그림 3c ).
  13. 분젠 버너로 치과 용 왁스 막대를 가열하고 튜빙과 실을 밀봉하십시오( 그림 3c ). 이온 선택 배럴의 플라스틱 튜빙 주위에 완전한 에어 실이 생성되었는지 확인하십시오 (중요).
  14. 크실렌 중 4 % 클로로 트리메틸 실란의 작고 투명한 유리 용기 (5 mL 이하)를 준비하십시오. 주의 : 크 실렌과 실란은 건강에 매우 위험합니다. 두 화학 물질을 흄 후드 내부에서 처리하고 적절히 폐기하십시오.
  15. 뚜껑 후드에 수평으로 장착 된 스테레오 해부 현미경의 앞에 용기를 놓습니다. micromanipulator를 사용하여 컨테이너 위에 수직으로 ISM을 고정시킵니다 ( 그림 3d ).
  16. chlorotrimethylsilane 솔루션 microelectrode의 팁을 딥.
  17. ISM으로 이어지는 25 게이지 바늘에 빈 10 mL 주사기를 부착하십시오. TMA-Cl 용액의 거품이 형성 될 때까지 주사기에서 양의 공기 압력을가하십시오. 이 단계는 현미경을 통해 직접 시각화하에 수행되어야합니다.
  18. 팁에서 거품을 두드리기 위해 ISM 홀더를 부드럽게 두 드리십시오.
  19. 10 ML 주사기에 부정적인 압력을 사용하여 ISM의 끝 부분에 대략 1,500 μm의 높이 chlorotrimethylsilane 솔루션을 그립니다.
  20. 팁에서 TMA-Cl 용액의 거품이 생성 될 때까지 ISM의 팁에서 chlorotrimethylsilane 용액을 완전히 배출하십시오 ( 그림 3d ).
  21. 단계 3.19 및 3.20을 다섯 번 반복하십시오. 매번 액체가 연속적으로 쏟아져 나오는지 확인하십시오. 팁을 잡아 당길 수없는 경우 호스가 막혔는지, 에어 씰이 불완전한 지 또는 ISM의 팁이 막혔는지 확인하십시오.
  22. TMA-Cl 용액의 버블이 생성 될 때까지 팁 밖으로 모든 클로로 트리메틸 실란 용액을 세척하십시오.
  23. 주사기에 긍정적 인 압력을 유지하면서 크실렌 용액에서 ISM을 제거합니다. 초과 된 크실렌이 exc를 파괴하므로 모든 크실렌 용액이 ISM 팁에서 배출되도록하십시오.행거 열은 후속 단계에서 생성됩니다.
  24. TMA 용 액체 이온 교환기 (LIX)가있는 작고 투명한 용기 (교환기가 들어있는 소형 용기 또는 소형 큐벳)에 ISM의 끝 부분을 놓습니다. 수평 현미경 설정을 사용하여 직접 시각화에서이 단계를 수행하십시오.
  25. 소량의 부압을 가해 최소량의 LIX를 팁에 넣습니다 ( 예 : LIX가 팁에 들어가면 부압을 가하지 않음).
  26. 튜빙에서 10mL 주사기를 분리하고 ISM이 5 분 동안 앉도록하십시오. 그 시간 동안, LIX는 평형 상태에 도달 할 때까지 silanized 팁에 들어갑니다.
  27. LIX에서 ISM을 제거하십시오. 가능한 한 작은 왁스를 제거하면서 교환기 배럴에서 튜빙을 당겨냅니다. 염화은 전선을 ISM의 뒤쪽에있는 작은 구멍에 넣습니다. 용융 된 왁스로 교환기 통의 백필에 와이어를 밀봉하십시오.
  28. ISM 허용적어도 30 분 동안. 유연한 임시 접착제를 사용하여 완료된 ISM을 비커의 안쪽 가장자리에 부착하십시오.
  29. 1.8 단계에서 만든 각 보정 용액에 ISM으로 측정 한 전압을 기록하여 ISM을 보정하십시오.
    참고 : 교정은 교정 스테이션 (2.3 단계 참조) 또는 실험 설치에서 수행 할 수 있습니다. 이 절차는 부록 B와 Haack 외 10 에 요약되어있다.
  30. 여러 ISM에 대해 ISM 보정이 성공적으로 수행 된 경우 의도 한 사용 일까지 여기에서 중지하십시오. 그렇지 않은 경우 ISM을 추가로 가공하십시오.
  31. 실험 당일, 미세 전극을 다시 보정하십시오 (3.29 단계 참조).

figure-protocol-2
그림 3 : 이온 선택 식 미세 전극의 준비. ( a ) 모세관의 끝을 치핑하고 잡아 당긴 후 ISM (3.2-3.6 단계) : 양쪽 끝의 단일 배럴 ofa 유리 모세관이 부서진다. ISM은 이중 팁 식 유리 모세관 하나를 당겨 정밀한 팁이있는 두 개의 마이크로 피펫을 생성하여 생성됩니다. ( b ) 두 배럴을 채우고 나서 ISM (3.7-3.9 단계) : 단일 ISM의 팁을 직경 2 ~ 5 μm로 칩핑합니다. 이온 선택 배럴에는 TMA-Cl이 채워지고 기준 배럴에는 NaCl이 채워집니다. ( c ) 클로로 트리메틸 실란으로 코팅하기 전의 ISM (단계 3.11-3.13) : 염화은 전선을 기준 배럴에 삽입한다. Polytetrafluoroethylene (PTFE) 튜빙은 25G 바늘에 연결되어 이온 선택 배럴에 삽입됩니다. 치아 왁스를 사용하여 두 배럴 상단에 기밀 봉인이 만들어집니다. ( d ) 클로로 트리메틸 실란으로 마이크로 피펫 코팅 (단계 3.15-3.26) : [저배율] 수평 적으로 장착 된 실체 현미경과 일치하여 클로로 트리메틸 실란에 현탁 된 ISM. [고배율 (high magnification)] 수평으로 장착 된 stereomicroscchlorotrimethylsilane 용액에 ISM 팁의 ope. 현미경을 통해 팁을 시각화 한 후, 소량의 TMA-Cl 용액을 이온 선택 배럴 (TMA-Cl 용액의 작은 거품을 생성하기에 충분)에서 제거합니다. ISM 홀더를 두드려 TMA-Cl 용액 거품을 방출 한 다음 클로로 트리메틸 실란을 팁으로 끌어 올립니다. 이주기는 여러 번 반복됩니다. 모든 클로로 트리메틸 실란이 ISM에서 분출 된 후 ISM을 TMA 용 액체 이온 교환기 (LIX)에 넣고 LIX를 이온 선택 배럴의 팁으로 가져온다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. Iontophoresis Microelectrodes의 준비

참고 : Iontophoresis microelectrode는 실험 당일 날조해야합니다.

  1. 수직 또는 호에 이중 괄호 붕규산 유리 모세관을 당깁니다.rizontal 끌어 당기는 사람. 단계 3.6 ( 그림 4a )에서 뽑아 micropipettes와 유사한 피펫을 당겨 매개 변수를 조정합니다.
  2. 3.7 단계에서 사용되는 복합 현미경 아래에 micropipette을 놓고 결과 직경이 2 ~ 5 μm ( 그림 4a )가되도록 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 팁을 잘라냅니다.
  3. 0.22 μm 필터와 28 G, 97 mm 바늘 ( 그림 4a )에 부착 된 10 ML 주사기를 사용하여 150 MM TMA - C 백필 용액으로 두 배럴을 채 웁니다.
  4. 미세 통을 가볍게 두드려 두 배럴의 용액에 기포가 남지 않도록하십시오.
  5. micropipette의 두 배럴에 chloridized 실버 전선을 놓으십시오. 와이어가 백필 솔루션에서 충분히 깊어서 실험 기간 동안 솔루션과 계속 접촉 할 수 있도록하십시오.
  6. 뜨거운 치과 용 왁스를 사용하여 전선을 배럴에 밀봉하십시오. 부드럽게 연동 ( 그림 4b에 표시된 완성 된 미세 전극).

figure-protocol-3
그림 4 : Iontophoresis Microelectrode의 준비. ( a ) 두 배럴을 채우고 난 후의 이온 도입법 미세 전극 (단계 4.1-4.3) : 모세관으로부터 이온 삼투압 미세 전극을 잡아 당긴다. 미세 전극의 팁은 2-5 μm의 직경으로 칩핑됩니다. 이온 삼투압 미세 전극의 두 배럴은 TMA-Cl 용액으로 채워진다. ( b ) 완료 iontophoresis microelectrode (4.5-4.6 단계) : 두 개의 염화은 전선이 배럴에 삽입 된 이온 삼투압 미세 전극. 미세 전극의 배럴은 왁스로 밀봉되고,은 전선은 미세 전극의 뒤쪽에서 함께 비틀어진다./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 인공 뇌척수액 및 설치류 뇌 조직 절편의 준비

  1. 실험에 적합한 조성을 가진 인공 뇌척수액 (ACSF) 1 L을 준비하고 0.5 mM TMA-Cl을 넣는다.
    참고 : TMA-Cl은 실험 중에 TMA의 백그라운드 농도를 설정하는 데 필요합니다.
  2. 표준 프로토콜 11 , 12 에 따라 400 μm의 두께와 설치류 두뇌 조각을 준비합니다. 뇌 조각의 해부 및 유지 관리를 위해 5.1 단계에서 준비한 ACSF를 사용하십시오.

6. 아가로 오스의 실시간 이온 도입법

  1. Walter 및 Wanda 프로그램을 실행하는 컴퓨터를 켜십시오.
    참고 :이 프로그램은 요청에 따라 무료로 사용할 수 있습니다. 이 소프트웨어가 필수적인 것은 아니지만 유사한 프로그래밍소프트웨어 또는 손으로 분석을 수행하는 것이 필요합니다.
  2. 적절한 속도 ( 예 : 2 mL / min)로 침수 챔버를 통해 ACSF를 실행하십시오. 온도 컨트롤러를 원하는 온도로 설정하고 실험 기간 동안 95 % O 2 / 5 % CO 2 (또는 다른 적절한 가스 혼합물)로 버블 ACSF를 버블 링하십시오.
  3. 적절한 홀더에 무관계 (접지) 전극을 장착하고 침지 챔버를 통과하는 ACSF에 팁을 잠급니다. 와이어를 녹음 설정의 접지에 연결하십시오.
  4. 이전에 준비한 0.3 % 아가로 오스로 다공성 컵 (단계 1.7에서 만든)을 채우고 침수 챔버에 넣으십시오. 용액이 컵 상단을지나 가지 않도록하십시오.
  5. 하나의 micromanipulator의 피펫 홀더와 두 번째 iontophoresis microelectrode에 보정 ISM을 확보. 홀더를 설치에 적합한 각도로 설정하십시오 ( 그림 5a ).
  6. 잇다ISM 및 이온 삼투압 미세 전극 와이어는 기록 증폭기의 각각의 헤드 스테이지에 연결된다. 또는 앰프에 직접 연결하십시오 (설정에 따라 다름).
  7. 위치 선정의 작은 변동이 결과에 영향을 줄 수 있으므로 연결 와이어 또는 클립의 무게 / 위치가 미세 전극을 움직이지 않도록하십시오.
  8. 전자 설정을 켜십시오 (2 단계에서). Walter와 Wanda를 별도의 인스턴스로 시작하십시오.
  9. Wanda GUI에서 "Calibrate"를 클릭하십시오 ( 그림 6a ). 보정 상자 ( 그림 6b )에서 ISM 교정 중에 측정 된 전압을 채우고 (3.29 단계) "Fit Data"를 클릭하십시오.
    참고 : 이는 Nicolsky 방정식의 다음 표현에 적합하게합니다 (또는 방정식을 M 과 K 를 얻기위한 다른 방법으로 맞 춥니 다).
    figure-protocol-4
    그녀V 는 측정 된 전압 (mV), M 은 니콜 스키 기울기 (mV), C 는 이온 농도 (mM), K 는 간섭 (mM), V 0 는 오프셋 전압 (mV) 3 이다.
  10. Calibrate 상자에서 "Accept"를 클릭하여 단계 6.9에서 생성 된 경사 ( M )와 간섭 ( K )을 기본 GUI로 자동 전송하십시오.
    참고 : 여기에서 K 는 일반적으로 무시할 수있는 Na 간섭을 나타냅니다.
  11. GUI의 왼쪽에서 모든 실험 매개 변수가 해당 항목에 설정되어 있는지 확인하십시오 ( 그림 6a ).
    1. 소스 방법 상자에서 이온 주입 소스 (기본값), "기록 지속 시간"을 "200 초"(기본값), "펄스 시작"을 "10 초"(기본값), "펄스 종료" "60s"(기본값), "바이어스 전류"를 "20nA"(기본값),"Main Current"를 "100 nA"(기본값)로 설정하고 "Conversion Factor"를 적절한 값으로 설정하십시오.
    2. Measuring Electrode (측정 전극) 상자에서 "Bath C"를 욕조 용액에 포함 된 TMA의 농도 (mM로 표시)로 설정합니다. 사용중인 데이터 수집 시스템에 적절한 값으로 "총 이득", "출력 채널", "ISM 채널"및 "참조 채널"을 설정하십시오.
      참고 : "Conversion Factor"는 적절한 값 (사용중인 이온 삼투압 유니트에만 해당)으로 설정해야합니다. 이 값은 D / A 변환기에서 주어진인가 전압 (nA / mV)에 대해 통과하는 전류의 양을 지정합니다.
  12. 온도 프로브를 한천 컵에 넣으십시오. 측정 된 온도를 GUI의 "Measuring Electrode"상자에있는 "Temperature"항목에 기록하십시오 ( 그림 6a ).
  13. 보조 무대 조명기를 켭니다. 필요한 경우 마이크에 연결된 카메라를 켭니다.roscope 및 카메라 모니터입니다.
  14. 아가로 오스에 적어도 1,000 μm의 깊은 microelectrodes을 낮추고 컵 ( 그림 5b )에 그들을 중심으로. 현미경으로 10X 대물 렌즈 (긴 작동 거리의 수침 객관식)를 사용하여 시각화하십시오.
  15. 아가로 오스에 기록 된 전압을 기준 전압으로 설정하기 위해 기준 전압과 ISM 채널 모두에 대해 앰프의 전압을 0 mV로 오프셋합니다.
  16. 2 채널 증폭기에서 수동으로 ISM 채널 커넥터를 전압 빼기 출력으로 이동하여 기준 채널과 ISM 채널 사이의 뺄셈을 설정하십시오.
    참고 : 뺄셈은 ISM 채널의 전압 변화가 TMA 농도의 변화 만 반영 함을 보장합니다.
  17. 이온 삼투압 미세 전극의 끝 부분에 닿도록 ISM을 움직입니다. 세 방향 축 모두에서 팁을 가운데에 맞 춥니 다.
  18. 두 미세 전극의 상대 위치를 제로micromanipulator 컨트롤 박스. 미세 전극이 정확하고 정확하게 (중요하게) 중앙에 위치하는지 확인하십시오.
  19. 한 축 (왼쪽 - 오른쪽 축, 그림 5b )에서 이온 삼투압 미세 전극에서 ISM을 120 μm 멀리 이동시킵니다. 이 거리를 GUI의 "Measuring Electrode"박스에 입력하십시오 ( 그림 6a ).
  20. GUI에서 "Acquire"를 클릭하여 녹음을 시작하십시오 ( 그림 6a ). 프로그램이 전체 녹음을 녹음 할 수있게하십시오.
    참고 : iontophoresis microelectrode는 일정한 바이어스 전류를 수신합니다. "Acquire (획득)"를 클릭 한 후 주 전류가 제한된 기간 동안 적용되기 전에 약간의 지연이 있습니다.
  21. 6.20 단계를 2 ~ 3 회 더 반복합니다. 새로운 기록을 얻기 전에 TMA 신호가 기준선으로 되돌아 갈 때까지 기다리십시오. 프로그램은 나중에 분석 할 수 있도록 각 레코드를 저장합니다.
  22. ISM을 뒤로 움직여 두 개의 미세 전극의 간격을 확인하십시오.o 컨트롤 박스에 의해 지정된 제로 위치. 미세 전극이 더 이상 가운데에 있지 않으면 6.17 단계와 동일한 전략을 사용하여 미세 전극을 다시 중심에 놓습니다. 전극 위치의 변화를 기록하십시오.
    참고 : 간격이 약 2 % 이상 변경되면 6.19 단계에서 수집 한 레코드를 정확하다고 생각할 수 없으며 새로운 레코드를 가져와야합니다.

figure-protocol-5
그림 5 : Agar에서의 실험 설정. ( a ) 희석 한천 (단계 6.1-6.5)에서 실험을위한 설치 : 실행중인 관류 챔버에 배치 희석 한천으로 가득한 작은 다공성 용기. 이온 삼투압 미세 전극 (왼쪽)과 ISM (오른쪽)은 미세 전극 홀더에 의해 유지됩니다. 미세 전극 홀더는 로봇 마이크로 매니퓰레이터의 팔에 끼워져있다. 온도 프로브를 한천 겔에 넣고 무관심한 접지 전극을 pl침수 챔버 내에 있어야한다. ( b ) 한천에 microelectrodes의 확대보기 : iontophoresis microelectrode (왼쪽)와 ISM (오른쪽) 10X 물이 침지 목표 (150mM NaCl에 여기 잠긴 목적)를 사용하여 한천에서 시각화됩니다. Microelectrodes는 micromanipulators를 사용하여 1,000 μm의 깊이에 위치합니다. 미세 전극 사이의 간격은 120μm이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-6
그림 6 : Wanda 컴퓨터 소프트웨어 인터페이스. ( a ) Wanda 탐색 GUI (그래픽 사용자 인터페이스) : Wanda 소프트웨어를 연 후에 나타나는 화면입니다. 박스 (1)에서, 적절한 매질, 이온 삼투 요법 분자 및 기술이 선택된다. (2) "보정"을 클릭하면완다 보정 상자. ISM ( 그림 6b 및 부록 B 참조)을 보정 한 후 ISM은 프로토콜의 6 단계 및 8 단계에서 설명한대로 한천 또는 두뇌에 위치합니다. 박스 (6)에서, 수행되는 실험에 대한 모든 적절한 값이 입력된다. (7) "Acquire"를 클릭하면 녹음이 시작됩니다. Wanda GUI의 오른쪽 위 부분에 전압 대 시간의 그래프가 나타납니다. ( b ) Wanda에서 ISM 보정 : Wanda GUI에서 (2) "Calibrate"를 클릭하면 열리는 창이 열립니다. 3.29 단계의 값이 상자 (3)에 입력되고 (4) "데이터 맞춤"이 선택됩니다. 검량선은 선형으로 확인됩니다. (5) Wanda GUI로 돌아가려면 "수락"을 클릭하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

아가로 오스 데이터 분석

  1. 그컴퓨터 (PC)의 월터 프로그램. "0. Records From :"메뉴에서 Wanda ( 그림 7a )에 의해 생성 된 레코드를 읽으려면 "Wanda / VOLTORO"버튼을 클릭하십시오. 스프레드 시트에 대한 출력이 필요하다고 생각되면 해당 소프트웨어를여십시오. "1. Excel 작성?"에서 "시트 1,3"을 클릭하십시오. 메뉴 ( 그림 7b ).
  2. 다음 팝업 창에서 읽을 레코드를 선택하고 "열기"를 클릭하십시오 ( 그림 7b ). 레코드가 자동으로 그래프로 표시됩니다. 피팅 절차를 시작하려면 다음 단계를 수행하십시오.
    1. "2. 옵션"메뉴에서 "선택 녹음"버튼을 클릭하십시오. " 그림 2 "팝업 창에서 마우스를 사용하여 처리 할 첫 번째 레코드 위로 십자선을 이동하십시오 ( 그림 7c ). 마우스 버튼을 눌러 레코드를 선택하십시오.
    2. o를 클릭하십시오.n "fit curve"를 선택하십시오. 피팅의 반복 횟수를 선택하십시오. 데이터의 정확한 적합성을 얻기 위해 적어도 20 번의 피팅 반복을 사용하십시오.
    3. 메뉴에서 "모든 데이터"를 선택하고 "계속"을 선택하십시오. 프로그램이 표시된 곡선에 맞을 것입니다. 피팅 절차를 관찰하고 얻은 최적의 맞춤 곡선과 실험 기록을 비교하십시오.
  3. "7. 결과"메뉴 ( 그림 7d )에서 "Excel"을 클릭하여 결과를 적절한 스프레드 시트 프로그램에 쓰는 옵션을 선택하십시오. ' D (E5) ', ' Reference D (E5) ', ' r_app ', 운송 번호 ' n t ', ' Apparent '와 같은 이온 삼투압 미세 전극의 기능을 결정하는 데 사용될 중요한 데이터를 기록하십시오. n t '.
    참고 : " D (E5) ": 측정 된 자유 확산 계수TX (10) 5 (2 cm / s); " 기준 D (E5) ": 이론적 자유 확산 계수 x 10 5 (cm 2 / s). 이 값은 이온, 매체 및 온도 입력을 기반으로 Walter 내의 데이터베이스에서 추출됩니다. " r_app ": 측정 된 기준 D (E5)를 기준으로 계산 된 겉보기 미세 전극 간격 (cm ) . " n t ": 운송 번호 (무차 원). 이 숫자는 TMA 4 를 방출하는데 사용되는 이온 삼투압 전류의 분율을 결정합니다. " 명백한 n t ": 명백한 운송 번호 (무 차원). r_app 에서 계산 된 전송 번호입니다. 이 값은 측정 된 n 개의 t에 가까워 야한다.
  4. 선택한 한 쌍의 미세 전극에 대한 각 레코드에 대해 7.1-7.3 단계를 반복하십시오.
  5. 이온 삼투압 미세 전극의 사용 여부는 다음과 같이 결정합니다.
    1. " r_app" 를 실제 r ( 즉, 120 μm)과 비교하십시오. 모든 임상 시험의 평균값이 서로 4 % 이내이면이 기준이 충족됩니다.
    2. " D (E5)" 와 Reference D (E5)를 비교하십시오. 모든 임상 시험의 평균값이 서로 8 % 이내이면이 기준이 충족됩니다.
    3. 동일 microelectrode로 시행 간의 " n t "을 비교하십시오. 모든 임상 시험의 평균값이 서로 10 % 이내이면이 기준이 충족됩니다.
  6. 7.5 단계의 기준 중 하나가 충족되지 않으면 이온 삼투압 미세 전극 문제를 해결하거나 다른 것을 시험하기 시작합니다.
  7. 이온 삼투압 미세 전극이 실험에 적합하다고 판단되면 Wanda GUI의 "Transport Num N"필드 ( 그림 6a )에서 모든 시도의 평균 운송 횟수를 기록하십시오.

jove_content "> figure-protocol-7
그림 7 : Walter 컴퓨터 소프트웨어 인터페이스. ( a ) Walter에서 데이터 수집 프로그램 선택 : Walter 소프트웨어를 시작한 후 "0. Records From :"메뉴가 열립니다. Wanda가 저장 한 레코드를로드하는 옵션은 "Wanda / Voltoro"버튼을 클릭하여 선택합니다. ( b ) Walter에서 데이터 및 데이터 분석 출력 위치 선택 : [왼쪽] 적절한 스프레드 시트 프로그램이 열리면 이전에 열린 스프레드 시트 프로그램에 모든 Walter 데이터 분석을 출력하도록 "Sheets 1,3"이 선택됩니다. [오른쪽] 데이터 분석 출력 위치를 선택한 후 사용자가 Walter에서 읽은 첫 번째 및 마지막 녹음을 선택할 수있는 팝업 창이 열립니다. ( c ) Walter에서 분석 할 녹음 선택하기 : [Right] 읽으려는 파일을 선택한 후, 선택한 모든 레코드가 표시된 팝업 창이 열립니다그래프로 재생됩니다 ( " 그림 2 "). [왼쪽] "2.Options"메뉴에서 "rec 선택"을 클릭하고 마우스를 사용하여 십자 기호를 이동하여 분석을위한 첫 번째 녹음을 식별합니다. 마우스 버튼을 눌러 녹음을 선택하십시오. ( d ) Walter에서 스프레드 시트로 데이터 분석 내보내기 : 데이터를 맞추면 팝업 창이 나타나고 "7. 결과"메뉴가 나타납니다. [Left] 월터 (적색)에 의해 생성 된 적합한 확산 곡선과 함께 선택된 레코딩의 그래프 (파란색). [오른쪽] "7. 결과"메뉴를 사용하면 분석에서 "Excel"버튼을 클릭하여 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 쓸 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 뇌 절편에서 실시간 Iontophoresis

  1. 400 μm 두께의 뇌를 넣으십시오.lice는 기록 실에서 완전히 흐르는 ACSF에 잠기도록 보장합니다. 수채화 물감 붓을 사용하여 슬라이스를 배치하고 그리드로 부드럽게 고정합니다.
  2. 이온 삼투압 미세 전극과 ISM을 두뇌 슬라이스의 관심 분야 위에 이동하십시오. 흐르는 ACSF에서 둘 다 잠기십시오 그러나 조각의 위.
  3. 기준 및 이온 감지 채널의 전압을 "0"mV로 오프셋합니다. 두 채널의 전압이 안정 될 때까지 기다리십시오. 차트 레코더에서 ISM의 이온 감지 채널에서 측정 된 전압을 표시하십시오. Wanda의 기본 V 매개 변수를 계산할 때 사용합니다.
  4. ISM과 이온 삼투 microelectrode 200 μm의 깊이 슬라이스와 서로 120 μm의 멀리 놓으십시오. 미세 전극을 뇌 절편으로 이동시킨 후 신호가 안정화 될 때까지 기다리십시오.
    참고 : 이온 삼투압 미세 전극에 적용된 바이어스 전류는 TMA의 작은 누적을 유발합니다. ar을 먹는 것은 흔한 실수입니다.너무 빨리 발음하고 신호 축적을 과소 평가했다.
  5. 차트 레코더에서 ISM의 이온 감지 채널에서 뇌 조각으로 측정 된 안정화 된 전압을 표시합니다. 8.3 단계와 8.4 단계에서 측정 된 TMA 신호의 전압 차를 계산하고 Wanda GUI의 Measuring Electrode 상자 ( 그림 6a )의 "Baseline V (mV)"필드에이 값을 입력하십시오.
  6. GUI의 왼쪽에서 모든 실험 매개 변수가 올바르게 기록 / 입력되었는지 확인하십시오. 단계 7.4에서 이온 삼투압 미세 전극에 대해 계산 된 평균값으로 "중간"을 "뇌"로 설정하고, "온도"를 슬라이스가 들어있는 욕조의 온도로 설정합니다.
    참고 : V 는 각 측정 세트에 대해 기록되어야합니다. 기준선 V 는 Wanda에 의해 기준 C (mM) 매개 변수 ( 즉, 뇌 조직의 TMA 농도)로 변환됩니다.
  7. "Acquire"를 클릭하여 녹음을 시작한 후 녹음을 시작합니다. 새로운 녹음을 얻기 전에 TMA 신호가 기준선으로 되돌아 갈 때까지 기다리십시오.
  8. 선택한 뇌의 위치에서 미세 전극을 제거하기 전에 2 ~ 3 회의 연속 녹음을하십시오. Wanda 소프트웨어에 측정 된 온도를 각 기록 직전에 입력하십시오.
  9. 두 미세 전극을 대각선으로 슬라이스 표면으로 다시 이동합니다. 양쪽을 슬라이스 위로 50 μm 이상 올리십시오. 차트 레코더를 사용하여 지금 측정 된 V와 8.3 단계의 측정 값 사이의 변경 사항을 결정합니다.
  10. ISM의 팁과 이온 삼투압 미세 전극을 x 축, y 축, z 축 중심에 놓습니다. micromanipulator 컨트롤 박스의 디스플레이에서 간격 변경을 얻으십시오 (있는 경우).

9. 두뇌 데이터 분석

  1. 분석 결과를위한 새로운 스프레드 시트를 엽니 다.
  2. Walter에서 7.1-7.4 단계를 반복하여 분석합니다.e 두뇌에서 찍은 녹음.
  3. Walter 메뉴에서 "Excel"을 클릭하여 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 씁니다. , α, 뇌 ECS의 부피비를 기록; λ , 두뇌의 tortuosity ECS; 및 k (s -1 ), 비 특정 클리어런스.

10. 전송 번호 및 ISM 교정 점검

  1. 아래의 프로토콜을 사용하여 실험의 끝에서 ISM 전송 횟수 (n 개 t)를 측정한다. 또는 치명적인 시도가 있거나 측정 결과가 비정상적으로 표시되면 n t를 확인하십시오. 그러나 확인 n 개의 t 너무 많이는 뇌 조각에 외상이 발생할 수 있습니다.
  2. 아가로 오스로 새로운 녹음을하십시오. 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 및 6.17-6.22 단계를 참조하십시오.
  3. 반복 새로운 아가로 오스 녹음에서 n 개의 t을 얻기 위해 월터에서 7.1-7.4 단계를 반복합니다. 스프레드 시트를 검사 : n 개의 t이 이상 변경된 경우뇌 측정 이전에 얻어진 상기 N t에서 10 % 이상이 미세 이온 삼투압으로 얻어진 데이터는 신뢰할 수 없다.
  4. 모든 뇌 데이터가 수집 된 후 ISM에 대한 새로운 교정을 수행하십시오 (3.29 참조). 새롭게 얻은 ISM 교정 데이터를 Wanda Calibrate 상자의 입력으로 사용하고 (6.9 및 6.10 단계 참조) 기울기 값이 이전 교정에서 10 % 미만 차이가 나는지 확인하십시오.
    참고 : 기울기 값이 이전 보정 값과 10 % 이상 차이가 나는 경우이 ISM으로 얻은 데이터는 신뢰할 수 없습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

RTI 기법의 유용성은 α 와 hypoosmolar challenge 동안 변화를 측정하기 위해 고안된 실험에서 입증된다 ( 그림 8 과 그림 9 ). hypotonic ACSF를 세척하여 ECS의 삼투압을 줄이면 α 가 감소하고 λ 13이 증가한다는 것이 이전에 밝혀졌습니다.

이 실험에서, RTI는 저온 ACSF의 세척 조건 동안 및 제어 조건 모두 하에서 래트 뇌 절편에서 수행되었다. ISM을 제작하고, 교정 파라미터를 Wanda에 입력하여 Nicolsky 방정식에 맞추어서 58.21mV의 기울기 ( M )를 계산했습니다. ISM과 iontoph...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

figure-discussion-1
도표 10 : 일반적인 기술적 인 문제점을 설명하는 비 이상적인 자료. ( a ) iontophoresis microelectrodes와 함께 일반적인 기술적 인 문제의 다이어그램 : 기능적인 iontophoresis microelectrode에서 TMA의 정상적인 릴리스와 기술적 인 문제를 보여주는 세 가지 소스의 비교. [고배율, a1] 이상적인 이온 삼투압 소스의 전류는 TMA 방출과 염화물 흡수에 의해 동등하게 전달됩니다. N 개의 로우 t 릴리스 이하 TMA와 [고배율, (A2)]은 이온 삼투압 미세 전극은 정상보다 클로라이드를 차지한다. [고배율, a3] 전기 침투를 나타내는 이온 삼투압 미세 전극은 TMA, 염화물 및 용매를 방출합니다. [High ma...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 NIH NINDS grant R01 NS047557에 의해 지원되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
A/D 및 D/A 컨버터National Instruments CorporationNI USB-6221 DAQNI USB-6221은 여전히 NI에서 '레거시' 디바이스로 판매되고 있습니다. 새로운 설치에는 NI USB-6341 X 시리즈 DAQ를 사용하는 것이 좋지만, 우리는 최신 유닛을 테스트하지 않았습니다. NI USB-6221을 MATLAB 및 Windows 7 (32비트)에서 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 대안: BNC-2090 BNC 커넥터 패널 및 SH68-68-EP 케이블이 있는 훨씬 오래된 PCI-MIO-16E-4 A/D 컨버터(Windows XP 또는 이전 OS에서만 사용됨). Wanda Manual에 명시된 바와 같이 Axon Binary Files를 사용하는 실험적인 MATLAB 프로그램을 사용할 수 있습니다.
아가로스LonzaNuSieve GTG 아가로스 #50081RTI 측정을 위한 묽은 아가로스 겔을 준비하기 위한
ISMDagan모델 IX2-700 이중 세포 내 전치 증폭기이온 및 기준 전압 증폭기, N=0.1(기준 배럴용) 및 N=0.001(이온 배럴용), 헤드스테이지
생물학적 화합물 현미경(4x 및 10x 대물렌즈 포함)용증폭기미세 전극 팁을 치핑하고 미세 전극을 검사하기 위해; 다양한 공급 업체, 예 : < / em> AmScope
붕규산 세타 모세관 유리 튜브Harvard ApparatusWarner Instruments 모델 TG200-4; 주문 # 64-0811이온 선택적 미세 전극 및 이온 영동 미세 전극 용 이중 배럴 유리 튜브; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, 격막 0.2 mm, 길이 10 cm
브러시Winsor & NewtonUniversity Series 233, 크기 0원형 쇼프트 핸들 브러시, 아마존
분젠 버너
카메라OlympusOLY-150모니터가 필요하며, 서브스테이지 조명기의 IR 필터는 옵션
차트 레코더입니다.테트라메틸암모늄 표준물질에서 보정하는 동안 및 RTI 실험 중에 이온 선택성 미세전극의 전압을 지속적으로 기록합니다. 예: Kipp & Zonen 유형 BD112 이중 캐넬 차트 기록, 사용 가능한 리퍼브
클로로 트리메틸 실란, 퓨리스., > 99 %Sigma-Aldrich카탈로그 # 92360실란 화; 주의: 가연성, 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 피부 부식, 눈 손상, 물과 격렬하게 반응, 전체 설명은 Sigma-Aldrich 안전 정보 참조
상용 소프트웨어MathWorksMATLAB,Wanda 및 Walter 프로그램을 사용한 데이터 수집 및 분석을 위한 데이터 수집 도구 상자. 교육용 라이센스를 사용할 수 있습니다.
눈 보호 고글Fisher
고정 스테이지 복합 현미경OlympusBX51WI이 있는 다른 복합 현미경을 사용하여
유리 모세관을 깎을 수 있습니다. Dumond #5, 바람직하게는 사용되며 더 이상 필요하지 않습니다
실란화 및 이온 선택성 배럴의 팁을 액체 이온 교환기로 채우기 위한 미세 작업 흄 후드; 다양한 supliers, e.g. Erlab
묽은 아가로스 겔 및 교반 용액을 준비하기 위해
이온 영동 장치DaganION-100 및 PS-100ION-100은 단일 채널 이온 영동 장치 +/- 130V 준수입니다. PS-100은 외부 전원 공급 장치입니다. 대안 : 예 : < / em> Axon Instruments (현재 Molecular Devices)에서 만든 Axoprobe-1A, 생산 중단, 리퍼브 장치 (eBay 및 기타 사이트)
의 가용성 확인 테트라 메틸 암모늄 용 액체 이온 교환기 (LIX)World Precision InstrumentsIE190 칼륨 이온 교환기참고 : 이것은 테트라 펜리 보레이트를 기반으로하는 원래의 Corning 칼륨 교환기 477317와 동일합니다 - 중성 캐리어 칼륨 교환기와 혼동하지 마십시오. 테트라메틸암모늄을 감지하지 못하는 취리히 ETH Simon 박사의 실험실에서 유래했으며 Fluka에서 판매합니다. 테트라메틸암모늄에 대한 액체 이온 교환기를 직접 만들 수도 있습니다 : 2,3- 디메틸 니트로 벤젠에 용해 된 칼륨 테트라 키스 중량 3 % = (p- 클로로 페닐) 붕산염. Fluka(현재 Sigma의 일부)에서 화학 물질을 구입하십시오. Oehme and Simon (1976) Anal. Chim을 참조하십시오. 악타 86 : 21-25; 주의: 이 액체 이온 교환기의 독성학적 특성은 완전히 결정되지 않았습니다. 섭취하거나 인체에 접촉하는 것은 해로울 수 있습니다. 적절한 주의를 기울이십시오! 액체 이온 교환기는 직사광선을 피해 서늘한 곳에 보관해야 합니다.
microelectrode 홀더WPI는silanization를 위한 이온 선택적인 microeletrode prefabricate를 보전하고 액체 이온 교환기로 이온 선택적인 배럴의 끝을 채우기 위하여 M3301EH합니다; WPI는 이 홀더의 두 가지 버전, 즉 클리어 M3301EH와 블랙 M3301EH를 판매합니다. 우리의 경험에 따르면 맑은 M3301EH이 검은 M3301EH보다 더 견고한 것 같습니다.
micromanipulatorNarishigeMM-3은 실란화 중에 이온 선택성 미세 전극을 prefabricatelyly하고 이온 선택형 배럴의 팁을 액체 이온 교환기로 채우는 동안 prefabricate를 배치합니다. 양호한 작동 조건의 3 축 micromanipulator로 대체 할 수 있습니다
micropipette pullerSutter Instruments모델 P-97이중 배럴 유리관을 당기는 것; 다른 풀러는 큰 직경의 이중 배럴 유리 튜브를 수용 할 수있는 한 사용할 수 있습니다
마이크로 프로브 온도계Physiotemp모델 BAT-12R미세 프로브이 온도계의 기록 사이트
바늘BD주사기 및 바늘 # 305122 (25 게이지)silanization에 가깝게 배치됩니다. BD PrecisionGlide 바늘 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
대물렌즈 5X 건조OlympusMPlan N
대물렌즈 10X 침수OlympusUMPlan FL N10X 대물렌즈는 침수, 개구수는 0.3, 작동 거리는 3.3mm
플라스틱 용기(뚜껑 포함)Fisher#14-375-148테트라메틸암모늄 표준 용액 및 미세 전극을 보관합니다.
고정 스테이지 현미경을 위한 플랫폼 및 x-y translation stageEXFOGibraltar Burleigh플랫폼은 슬라이스 챔버, 미세 조작기 및 액세서리를 보유하며, x-y translational stage
묽은 아가로스 겔에서 RTI 측정을 위한공성 미니컵
재사용 가능한 접착제BostikBlu-Tack용기 및 기타 용도를 유지하기 위해 미세 전극을 고정하기 위해;
정확한 x, y, z 포지셔닝을 갖춘 Amazon 로봇 미세 조작기Sutter InstrumentsMP-285이온 선택성 미세 전극과 이온 영동 미세 전극을 별도로 고정하려면 두 개의 미세 조작기가 필요합니다. 또한 마이크로피펫을 간격 배열로 접착할 수 있습니다(텍스트 참조).
저역 통과 필터가 있는 신호 조정 장치Axon InstrumentsCyberAmp 320 또는 380은 제조업체에서 더 이상 사용할 수 없지만 E-Bay에서 구할 수 있습니다. 대안: 예: Cygnus Technology의 FLA-01 필터/증폭기. 이 기기는 다극 베셀 필터를 사용하여 10Hz에서 최소 차단이 가능한 단일 채널 기기이지만, 필요한 경우 더 낮은 차단 주파수(2Hz)로 수정할 수도 있습니다.
은선A-M 시스템#7830직경 0.015", 베어 (코팅 없음)
슬라이스 챔버하버드 장치워너 모델 RC-27L이것은 침수 슬라이스 챔버입니다; 실란화를 위해 인터페이스 슬라이스 챔버
실현미경고 이온 선택형 배럴의 끝을 액체 이온 교환기로 채우지 마십시오; 수평으로 장착; 다양한 공급업체
의 주사기, 10 mLBDSyringes and Needles #309604미세전극을 되메우고 실란화합니다. BD Luer-Lok 팁
주사기 필터 0.22 &마이크로; m poreWhatman#6780-1302는 백필 솔루션을 필터링합니다. Fisher
주사기 바늘, 28게이지, 97mmWorld Precision InstrumentsMicroFil MF28G-5을 백필하기 위해
구성 요소 공급STT-28 PTFE 튜브 라이트 월(28게이지)이온 선택성 배럴의 실란화를 위해; BD PrecisionGlide 바늘 25G x 5/8인치에 맞습니다. 참고 : 테프론은 필수적이며 PVC 튜브는 뜨거운 왁스로 녹습니다.
온도 제어 시스템Harvard ApparatusWarner 모델 TC-344B 및 SH-27ATC-344B는 이중 자동 온도 컨트롤러이고 SH-27A는 인라인 히터입니다.컨트롤러 및 히터는 Warner 슬라이스 챔버
테트라메티암모늄(TMA) 염화물Sigma-AldrichT-34115M 솔루션과 함께 작동합니다. 주의: 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 발암성, 수생 환경에 유해함, 전체 설명은 Sigma-Aldrich 안전 정보 참조
진동 블레이드 마이크로톰LeicaVT1000S뇌 슬라이스
절단 자일렌FisherX5-1실란화; 주의: 가연성, 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 피부 부식, 눈 손상, 발암성, 전체 설명은 Fisher Safety Information 참조
, 에서 사용 가능 마이크로피펫 시각화를 위한 Fisher 에는 는 고정 스테이지 겸자 Fine Science Tools#11251-10. 유리 현미경 슬라이드 Fisher#12-550A에서 판매하는 적절한 필터가 있는 Captair, 미세 전극 팁 히터/교반기 칩, Fisher Corning PC-420D 은 는 기록 안정성 다을 손상시키지 않고 현미경을 움직입니다. 집에서 만든 에서 구할 수 있는 다양한 공급업체 을 사용하지 마시에서 미세전극 테프론(=PTFE) 튜빙 사용 가능

참고문헌

  1. Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
  2. Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
  3. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
  4. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  5. Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
  6. Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  7. Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).
  8. Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
  9. Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
  10. Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
  11. Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).
  12. Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
  13. Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
  14. Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
  15. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
  16. Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
  17. Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
  18. Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
  19. Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

뇌 절편이온 선택성 미세전극확산 곡선아가로스 보정이동수
뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.