이 프로토콜은 살아있는 두뇌의 세포 외 공간 (ECS)의 물리적 매개 변수를 측정하는 방법 인 실시간 이온 삼투압을 설명합니다. ECS로 방출 된 불활성 분자의 확산은 ECS 부피 분율 및 비틀림을 계산하는 데 사용됩니다. 그것은 뇌의 ECS에 대한 급격한 가역적 인 변화를 연구하는데 이상적입니다.
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방법 논문
뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입
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이 논문에서
요약
초록
이 리뷰에서는 살아있는 두뇌의 세포 외 공간 (ECS)을 탐구하고 정량화하기위한 금 이온 표준 인 실시간 이온 삼투압 (RTI) 방법을 수행하기위한 기본 개념과 프로토콜에 대해 설명합니다. ECS는 모든 뇌 세포를 둘러싸고 있으며 간질 액과 세포 외 기질 모두를 포함합니다. 신경 전달 물질, 호르몬 및 영양소를 포함한 뇌 활동에 필요한 많은 물질의 운반은 ECS를 통한 확산에 의해 발생합니다. 이 공간의 부피와 기하 구조의 변화는 수면과 허혈과 같은 병리학 적 상태와 같은 정상적인 뇌 과정에서 발생합니다. 그러나, 특히 병이있는 상태에서 뇌 ECS의 구조와 조절은 아직 미개척이다. RTI 방법은 살아있는 두뇌의 두 가지 물리적 매개 변수, 즉 체적 분율과 비틀림을 측정합니다. 부피 분율은 ECS가 차지하는 조직 부피의 비율입니다. 구불 구불 한 (tortuosity)은 뇌를 통해 확산 될 때 물질이 마주 치는 상대적인 방해의 척도이다장애물이없는 매체에 비해 RTI에서 불활성 분자는 근원 미세 전극에서 뇌 ECS로 펄싱된다. 분자가이 소스에서 멀리 확산함에 따라 이온의 변화하는 농도는 약 100 μm 떨어진 이온 선택 미세 전극을 사용하여 시간에 따라 측정됩니다. 결과적인 확산 곡선으로부터 부피 분율 및 비틀림을 계산할 수 있습니다. 이 기술은 여러 종 (인간 포함)의 뇌 조각과 생체 내 에서 ECS의 급성 및 만성 변화를 연구하는 데 사용되었습니다. 다른 방법과 달리 RTI는 실시간으로 두뇌 ECS의 가역적 및 비가 역적 변화를 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
세포 외 공간 (ECS)은 모든 뇌 세포 외부의 상호 연결된 채널의 네트워크이며 간질 액과 세포 외 기질 모두를 포함합니다 ( 그림 1a 및 그림 1b ). 영양소, 호르몬 및 신경 전달 물질을 포함한 뇌 세포 기능에 필요한 많은 물질의 분포는 ECS를 통한 확산에 의해 발생합니다. 체적, 기하학 및 세포 외 기질을 포함한이 공간의 물리적 매개 변수의 변화는 뇌 세포 기능에 중대한 영향을 미치는 뇌 세포를 목욕시키는 ECS 및 국소 이온 농도를 통한 확산에 크게 영향을 미칠 수 있습니다 1 , 2 .
실시간 이온 삼투압 (RTI)은 뇌 영역의 두 가지 구조적 특성을 결정하는 데 사용됩니다 : 체적 분율과 비틀림 3 , 4 ,"xref"> 5. 부피 분율 ( α )은 대표적인 기본 부피의 총 조직 부피 ( V 조직 )에 대한 ECS ( V<....
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프로토콜
조직 샘플을 얻는 데 사용 된 모든 동물 절차는 SUNY Downstate Medical Center의 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 솔루션 및 장비 준비
- ISM의 기준 배럴에 150mM NaCl 백필 용액을 준비하십시오. 0.22 μm 필터 (박테리아 또는 입자를 제거하기 위해)에 부착 된 10 mL 주사기에 보관하십시오.
- microelectrodes에 대한 150 MM TMA 염화물 (TMA - 클럭) backfill 솔루션을 준비합니다. 0.22 μm 필터에 부착 된 10 mL 주사기에 보관하십시오. 정확한 농도를 보장하기 위해 5M 제조업체 용액에서 TMA-Cl 용액 (이 프로토콜에서)을 준비하십시오.
- 적어도 2 시간 동안 표백제 (차아 염소산 나트륨)에 전선을 잠기 게하여 미세 전극 제조용으로 적어도 4 개의은 전선을 염화시킨다. 과량의 표백제를 에탄올로 제거하고 전선을 건조시킵니다.
- 비커에서 150 MM NaCl 및 0.5 MM TMA-Cl 중 0.3 % 아가 로즈 50 ML을 준비그것을 덮어 라. 좋은 확산 측정을 보장하기 위해 가루와 합리적으로 신선한 아가로 오스를 사용하십시오.
- 가열하고 아가로 오스 용액을 교반 막대와 혼....
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결과
RTI 기법의 유용성은 α 와 hypoosmolar challenge 동안 변화를 측정하기 위해 고안된 실험에서 입증된다 ( 그림 8 과 그림 9 ). hypotonic ACSF를 세척하여 ECS의 삼투압을 줄이면 α 가 감소하고 λ 13이 증가한다는 것이 이전에 밝혀졌습니다.
이 실험에서, RTI는 저온 ACSF의 세척 조건 동안 및 제어 조건 모두 하에서 래트 뇌 절편에서 수행되었다. ISM을 제작하고, 교정 파라미터를 Wanda에 입력하여 Nicolsky 방정식에 맞추어서 58.21mV의 기울기 ( M )를 계산했습니다. ISM과 iontoph.......
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토론
도표 10 : 일반적인 기술적 인 문제점을 설명하는 비 이상적인 자료. ( a ) iontophoresis microelectrodes와 함께 일반적인 기술적 인 문제의 다이어그램 : 기능적인 iontophoresis microelectrode에서 TMA의 정상적인 릴리스와 기술적 인 문제를 보여주는 세 가지 소스의 비교. [고배율, a1] 이상적인 이온 삼투압 소스의 전류는 TMA 방출과 염화물 흡수에 의해 동등하게 전달됩니다. N 개의 로우 t 릴리스 이하 TMA와 [고배율, (A2)]은 이온 삼투압 미세 전극은 정상보다 클로라이드를 차지한다. [고배율, a3] 전기 침투를 나타내는 이온 삼투압 미세 전극은 TMA, 염화물 및 용매를 방출합니다. [High ma.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 NIH NINDS grant R01 NS047557에 의해 지원되었습니다.
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재료
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| 의 주사기, 10 mL | BD | Syringes and Needles #309604 | 미세전극을 되메우고 실란화합니다. BD Luer-Lok 팁 |
| 주사기 필터 0.22 &마이크로; m pore | Whatman | #6780-1302 | 는 백필 솔루션을 필터링합니다. Fisher |
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| 온도 제어 시스템 | Harvard Apparatus | Warner 모델 TC-344B 및 SH-27A | TC-344B는 이중 자동 온도 컨트롤러이고 SH-27A는 인라인 히터입니다.컨트롤러 및 히터는 Warner 슬라이스 챔버 |
| 테트라메티암모늄(TMA) 염화물 | Sigma-Aldrich | T-3411 | 5M 솔루션과 함께 작동합니다. 주의: 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 발암성, 수생 환경에 유해함, 전체 설명은 Sigma-Aldrich 안전 정보 참조 |
| 진동 블레이드 마이크로톰 | Leica | VT1000S | 뇌 슬라이스 |
| 절단 자일렌 | Fisher | X5-1 | 실란화; 주의: 가연성, 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 피부 부식, 눈 손상, 발암성, 전체 설명은 Fisher Safety Information 참조 |
참고문헌
- Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
- Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
- Nicholson, C.
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