배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Summary

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

Abstract

이종 단백질 발현 시스템은 재조합 단백질의 생산에 사용되는, 셀룰러 피킹 / 제이션의 해석 및 서브 유기체 수준에서 단백질의 생화학 적 기능의 결정. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 점점 더 많은 생명 공학, 제약 및 산업용 애플리케이션이 분명한 혜택을 바이러스 감염을 포함하지 않지만 종종 간과하고 충분히 활용하는 nonlytic 시스템에서 단백질 생산을 위해 사용되지만. 여기서는 nonlytic 발현 벡터 및 과도 재조합 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재조합 단백질의 효율적인 세포 제이션을 허용하고 신속하게 세포 내 단백질 피킹을 식별하는데 사용될 수있다. 우리는뿐만 아니라, 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질을 포함하여 시중에서 판매하는 곤충 세포주에서 네 개의 재조합 단백질의 발현을 보여세포 원형질막 세포 이하의 특정 마커 단백질로서 세포 내 리소좀에 대한. 모든 재조합 단백질은 재조합 단백질의 직접 검출을 가능하게 그들의 카복실 말단에서 형광 단백질 마커 키메라 같이 제조 하였다. 플라스미드 관심과 알려진 세포 내 마커의 유전자 구조를 숨겨와 세포의 이중 형질 전환 라이브 세포 이미징 및 세포 단백질 현지화의 개선 확인이 가능합니다.

Introduction

곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 생산은 진핵 세포 단백질의 연구에 많은 이점을 제공합니다. 즉, 곤충 세포 유사 번역 후 변형, 가공, 적절히 접힌 단백질 ^{1, 2, 3의 제조에} 유리하다 포유류 세포에 존재하는 것과 같은 정렬 메커니즘을 갖는다. 곤충 세포 시스템은 일반적으로 포유 동물 세포주 ^{4, 5에} 비해 유지 보수를 위해 더 적은 자원과 적은 시간과 노력을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 단백질의 특성화 및 치료제 외국 펩타이드 백신 생산 용 바이러스 단백질의 면역 원성 프레젠테이션 다중 합성 용 재조합 단백질의 생산을 포함하여 널리 다양한 분야에서 사용되는 하나의 곤충 세포 기반 시스템이며 - 단백질 복합체등의 당화 단백질의 제조. ^{1, 2, 4, 6.<....}

Protocol

표현의 플라스미드의 건설 1. OE-PCR

참고 : OE-PCR에 사용 된 모든 프라이머는 표 1을 참조하십시오. 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 사용은 모든 증폭하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 효소는 자주 방치하지 않기 때문에 3 'A는, 그것의 Taq DNA 중합 효소와 간단한 비 증폭 배양을 실시 할 필요가에 "A-꼬리"를 PCR 제품 조교 곤충 세포 발현로 복제하기 전에 벡터. 이 프로토콜은 곤충 발현 플라스미드가 세포 내 마커 단백질 (두 Bemisia의 담배가 루이 아쿠아 포린 단백질이 경우), 또는 관심의 유전자의 카복실 말단에 인 - 프레임 융합 형광 단백질, 키 메릭 단백질을 형질 생성하는 방법을 보여준다 (도 1).

1. 증폭 개의 독립적 인 발사 구성 OE-PCR을 사용하여 생성한다 : (1) 관심의 유전자를 코딩하는 서열 (B. 담배가 루이아쿠아 포린 1 : BtDrip1; B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 2 BtDrip2_v1) EGFP 또는 (2) 세포 내 마커 (초파리 melanogaster의 성 펩타이드 수용체라는 녹색 형광 단백....

Results

OE-PCR

OE-PCR 일단 관심 형광 마커 단백질의 임의의 테스트에 대응하는 유전자 재조합 키 메릭 단백질의 생성을 허용, 발현 벡터에 삽입 키메라 DNA 산물의 합성을 허용한다. 도 1은 형광 단백질 마커 EGFP에 프레임 시퀀스 (BtDrip1 및 BtDrip2_v1)를 부호화 B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 PIB를 함유하는 발현 벡터의 제조에 대한 일반적인 구조를 나타낸다. 이 경우, 그 카르복실기 말단에서 EGFP를 포함하는 두 BtDrip 키메라 단백질을 제조 하였다. 이 프로토콜은 또한 카복실 테르 mCherry 키메라와 같이 제조 개의 곤충 세포 내 마커 단백질과 DmSPR PLA2G15 (도 1)를 개발하기위한 방법을 설명했다. 그 방출 스펙트럼은 충분히 발산 때문에 .......

Discussion

이종 단백질 발현 시스템은 다수의 다운 스트림 애플리케이션 ^4에 사용되는 재조합 단백질의 생산을위한 중요한 도구입니다. 사용할 수있는 다양한 발현 시스템에서 선택하면 관심있는 단백질의 최종 목표에 따라 달라집니다. 여러 곤충 세포 발현 시스템은 원핵 생물과 진핵 세포 발현 시스템 ^{5, 6} 유연한 대안을 제공하는 사용할 수 있습니다. 단백질 발현을 유도하는 배큘로 바이러스 감염을 필요로하는 곤충 시스템은 연구 및 치료 응용 프로그램 ^{1, 2, 3에서} 사용되는 많은 단백질로, 지금까지 가장 인기 있고 널리 사용되는 곤충 시스템이다. 배큘로 바이러스 발현은, 그러나, 포함한 한계가 1) 바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA 중합효소	EMD Millipore	71085-3	중첩 확장 PCR 제품의 PCR 증폭에 사용되는 고충실도 DNA 중합효소
ExTaq DNA 중합효소	TaKaRa-Clontech	RR001B	PCR 제품의 A-테일링에 사용되는 DNA 중합효소
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA 중합효소 마스터 믹스	Lucigen	30033-1	DNA 중합효소 박테리아 콜로니 PCR
에 사용Biometra T전문 구배 Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	벤치마크 Scientific	A1705
SYBR 안전 DNA 겔 염색	ThermoFisher	S33102
Montage DNA 겔 추출 키트	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA 발현 키트	ThermoFisher	K89020	선형화 및 토포이소머라제 I-활성화 pIB/V5-His-TOPO 벡터, One Shot TOP10 화학적 적성 대장균 및 염 용액을 포함하여 중첩 확장 PCR 산물을 복제하는 데 필요한 구성 요소가 포함되어 있습니다.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube 로봇 워크스테이션	Qiagen	9001292
정수기 수직 클린 벤치	Labconco	3970401
Tni 배양 곤충 세포주	대립유전자 생명공학	ABP-CEL-10005
Sf9 배양 곤충 세포주	대립유전자 생명공학	ABP-CEL-10002
무혈청 곤충 배양 배지	대립 유전자 생명공학	ABP-MED-10002
TNM-FH 곤충 배양 배지	대립 유전자 생명 공학	ABP-MED-10001
IPL-41 곤충 배지	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II 형질 주입 시약	ThermoFisher	10362100
16cm 일회용 세포 스크레이퍼	Sarstedt	83.1832	세포 2위치 블레이드가 있는 스크레이퍼
25 cm2 (T25) 벤트 필터 캡이 있는 조직 배양 플라스크	생명 과학 제품	CT-229331
트랜스퍼 피	펫 Fisher	1371120
멸균, 50 mL 생체 반응 튜브	생명 과학 제품	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL 혈청학적 피펫	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL 플랫 캡 PCR 튜브	Fisher	14230200
폴리프로필렌 생물학적 위험 오토클레이브 백	Fisher	01828C
35 mm #1.5 유리 바닥 접시	Matsunami 유리	D35-14-1.5-U	35 mm 접시 직경, 14 mm 유리 직경, 1.5 mm 유리 두께, 코팅되지 않은
인큐베이터, 모델 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL 세포 계수기	ThermoFisher	AMQAF1000
백작 세포 계수 챔버 슬라이드(0.4% 트리판 블루 시약	포함) ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 플라스미드 DNA	트랜스OMIC 기술	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes 시약(Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605