Adventitial 바사 Vasorum 관류를 차단 하 여 복 부 대동맥 동맥 류의 설치류 모델의 생성

요약

루멘 대동맥 및 대동맥의 봉합 결 찰에 폴리우레탄 카 테 터 삽입 adventitial 바사 vasorum hypoperfusion 인해 만성 저 산소 증 유발. 이 문서에서는 AAA의 인 간에 있는 유사한 특성을 가진 복 부 대동맥 동맥 류 (AAA)의 소설 동물 모델을 설명합니다.

초록

Adventitial 바사 vasorum (VV) 산소와 대동맥 벽에 영양을 제공합니다. 대동맥 벽에서 hypoxia 확대 복 부 대동맥 동맥 류 (AAAs) 발생할 수 있습니다. 이 문서는 소개 하 고 대동맥 루멘 및 infrarenal 복 부 대동맥의 봉합 결 찰에 폴리우레탄 카 테 터 삽입의 조합으로 만든 adventitial VV hypoperfusion 통해 AAAs를 유도 하는 데 사용 하는 표준 프로토콜에 설명 합니다.

프로토콜 남성 쥐 음식과 물 광고 libitum제공 되는 300-400 g 무게의 사용을 포함. 복 부 중간 복 부 절 개를 가진 개복 술 후 대동맥의 각 질 제거는 혈관 주위 조직에서 혈액 흐름을 차단 수행 됩니다. 신장 동맥 분 지에 인접 한 작은 절 개를 포함 하는 Aortotomy를 수행 하 고 폴리우레탄 테 18 게이지 내재 바늘을 사용 하 여 삽입 됩니다. 절 개, 수리 후 카 테 터를 통해 대동맥의 단단한 결 찰 대동맥 혈액의 흐름을 방해 하지 않고 대동맥 벽을 통해 인접 방향에서 VV 혈액 흐름을 차단 합니다. 이 기술은 진보 대동맥 팽창으로 AAA를 유도할 수 있다.

이 모델의 가장 큰 장점은 VV hypoperfusion 조직 hypoxia과 인간의 AAA의 그들과 유사한 형태학 및 병 적인 특성을가지고 있는 infrarenal AAA, 개발 원인입니다.

서론

복 부 대동맥은 다음 세 계층으로 구성: 내부 혈관 벽 (intima), 중간 레이어 (미디어), 그리고 혈관 외벽 (adventitia), 이들의 adventitia 독특한 혈액 공급 시스템 바사 vasorum (VV)로 알려져 있다. 대동맥 조직 adventitial VV 관류 하 고 대동맥 혈액 흐름¹에서 간단한 산소 보급을 통해 산소와 함께 공급 된다. 그러나, 지리적으로, 복 부 대동맥 대동맥의 다른 부분에서에 비해 VVs의 최소 배포가 하고있다. ²

이전 연구 보고 인간의 복 부 대동맥 동맥 류에서 조직 hypoxia에 두꺼운 intraluminal 혈전 (ILT)³(AAA) 벽. 또한, 관련 된 조직 hypoxia AAA 벽⁴에서 상당히 높은 비율로 arteriosclerotic 변경 aneurysmal 벽에 adventitial VV 가려진은 표시 되었습니다. 이러한 결과에 따라, AAA의 소설 설치류 모델 adventitial VV hypoperfusion⁵를 유도 하 여 만들었습니다. 이 모델에서 VV hypoperfusion 발생 조직 hypoxia 및 infrarenal AAA, 형태학 및 병 적인 특성 인간 AAA⁶의 그들과 유사 했다의 개발. 주요 사례 ILTs의 존재와 형성 adipocytes⁶, 그리고 파열^7,8를 일으킬 가능성이의 축적 했다. 이 발견 이전 설치류 모델에서 드물게 관찰 되었습니다. 따라서이 모델 메커니즘 AAA 개발 및 파열에 대 한 책임의 깊은 이해에 크게 기여할 수 있습니다. 소개 하 고 adventitial VV hypoperfusion 통해 AAAs를 유도 하는 데 사용 하는 표준 프로토콜을 설명 하 고 수술 기법을 사용 하 여 대동맥 벽에 저 산소 증을 유발 하는 방법을 설명.

프로토콜

동물 보호 및 실험 동물 관리에 대 한 지침을 따라야 하 마마 츠 대학 학교의 의학 동물 관리 위원회의 센터에서 수행 했다.

1. 모델을 만들기 위한 수술

참고: 10 구슬 소독 기에 수술 도구를 배치 s preoperatively. 멸 균 글러브를 사용 하 여 intraoperatively.

1. 사용 남성 쥐 300-400 g.를 무게 쥐 음식에 대 한 액세스를 허용 하 고 광고 libitum 물.
2. 는 Isoflurane 흡입 (2.0-3.0 mL/L)와 쥐 anesthetize. 발가락 핀치에 의해 적절 한 anesthetization를 확인 하십시오.
3. 전기 면도기, 복 부에 머리를 면도 하 고 알코올과 povidone-요오드 솔루션으로 복 부를 문질러.
4. 작업 테이블에서 부정사 위치에 쥐를 놓습니다. 수 의사 연 고를 사용 하 여 쥐에 ' 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 s 눈.
5. 는 개복 술 복 부 정중 선 복 부 절 개를가 위를 사용 하 여 수행 합니다. 분명 수술 필드 확보, 팩 복 부 내용 복 부 구멍 안에 상처 견인을 사용 하 여 멸 균 거 즈와.
6. 대동맥 혈관 주위 조직에서 분리 하려면 부드럽게를 선택 하 고는 retroperitoneum 대동맥 벽을 노출 하 고 벗 겨 지 다 infrarenal 대동맥에서 분기 왼쪽된 신장 정 맥의 수준에서 후 공간에 핀셋으로 눈물은 혈관 주위 조직 ( 그림 1A).
7. 블록 혈액을 5-0 실크 문자열 복 부 대동맥에서 분기 혈관 대동맥 루멘 좁은 하지 않는 대동맥에서 지점에서 공급 하는 Ligate.
8. 대동맥 혈액 흐름을 차단 하는 혈관 클립 바로 아래 신장 동맥 및 대동맥의 분기 바로 위에 배치.
   참고: 클립의 크기는 혈액의 흐름을 완전히 차단 하 대동맥 직경 보다 큰 이어야 합니다. 임시 5-0 실크 문자열 합자 만으로는 또한 클립 대신 혈액 흐름을 차단.
9. 폴리우레탄 카 테 터를 삽입 하려면 대동맥 클립, 신장 동맥 분 지에 인접 한에서 distally 마이크로 시저 5mm를 사용 하 여 앞쪽 대동맥 벽을 잘라 대동맥 벽의 표면에 점 출혈을 만드는 비슷합니다.
10. 폴리우레탄 카 테 터 삽입 (0.55 m m, 내경 외경 0.37 m m)를 물으로 대동맥에서 혈액을 씻어 절 개를 통해 얕게 바늘 내재 24 게이지를 사용 하 여. 폴리우레탄 테에 물으로 채워진 1 mL 주사기를 관리 하 고 물으로 대동맥에 나머지 혈액을 멀리 세척. 관개, 후 대동맥에서 카 테 터 제거.
11. 폴리우레탄 카 테 터를 삽입 하기 전에 (1.20 m m, 내경 외경 0.94 m m) 18-게이지 내재 바늘을 사용 하 여 잘라 폴리우레탄 테 길이가 10 mm ( 그림 1B). 1.9 단계에서 만든 절 개에서 대동맥 루멘으로 폴리우레탄 카 테 터의
    1. 삽입 잘라 조각. 완전히 10 m m 카 테 터 대동맥 루멘으로 놓고 절 개 위치에 맞게 카 테 터의 중간점 위치 (즉, 카 테 터와 절 개를 커버).
12. 8-0 monofilament 문자열 ( 그림 1C)을 사용 하 여 중단 봉합 절 개를 복구.
13. 선 5-0 실크 문자열 및 폴리우레탄 테 ( 그림 1D)의 조합을 사용 하 여 복 부 대동맥.
    참고: 대동맥 루멘 내재 카 테 터에 의해 유지 수 있습니다. 카 테 터 위치 이후 방지 하기 위해 단단히 대동맥 선 외과 의사 ' s 매듭은 것이 좋습니다 때 묶는 매듭, 두 배 overhand 매듭 형성의 첫 번째 던지기는 여분의 트위스트를 추가 하 고 추가 차례 더 많은 마찰을 제공 하 고 완화 하는 것을 줄일 수 있습니다.
14. 결 찰, 후 대동맥 분기점에서 혈관 클립을 제거 한 다음, 제거를 antegrade 혈액 흐름을 복원 하는 신장 동맥 아래 혈관 클립. 심한 대동맥 맥 동 확인.
15. 두 레이어, 복 막 및 다른 레이어, 4-0 폴 리 프로필 렌 봉합에 복 부 절 개를 닫습니다. 단단히 protruded 오르간을 방지 하기 위해 절 개를 봉합.
16. 복 부 절 개에 국 소 lidocaine을 적용합니다. 식을 반환 될 때까지 난방 패드에 쥐를 놓습니다. 두지 마십시오 쥐 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 그것은 완전히 복구 될 때까지 작업을 다른 쥐의 회사를 겪고 있다 쥐를 반환 하지 않습니다.
17. 작업 후 쥐 밀접 하 게 모니터링합니다. 쥐 조 난 또는 몸 체중 감소의 흔적을 보여줍니다 하는 경우 멸 균 식 염 수 (1.0-2.0 mL) bolus를 피하 주사.
18. Postoperatively, 초음파 echogram에 확대 대동맥의 시간-과정 개발을 관찰합니다. 설명 ⁵ 복 부 대동맥의 외부 가장자리에 가장자리 안쪽에서 최대 직경 측정.

2. 수확, 고정, 및 Elastica 반 Gieson (EVG) 얼룩

1. 28 일 postoperatively, sodium pentobarbital 관리 ≥ 100 mg/kg는 쥐를 안락사를 intraperitoneally.
2. 자르면 쥐 ' s 복 부 구멍 ventrally. 메스를 사용 하 여 초기 절 개를 확인 합니다. 가 위를 사용 하 여 동맥 류를 수확 하 고 수확된 aortas 24-48 헤에 대 한 중립으로 버퍼링 하는 10% 포 르 말린에 장소
   참고: 외과 의사는 동맥을 노출 하는 경우 대동맥과 다른 장기에 부상을 방지 하기 위해 주의 해야 합니다. 높은 복 부 기관, AAA 형성을 나타내는 관찰 한다. 그림 2는 vivo에서 이미지와 비보 전 이미지; AAAs의 견본이 파열 되지.
3. EVG 얼룩 ⁹
   1. 솔루션 준비
      1. 준비 Verhoeff ' 주어진된 순서에 따라 다음을 혼합 하 여 s hematoxylin: 알콜 되며 20 mL, 10% 제 2 철 염화 8.0 mL, 그리고 Lugol ' s 요오드 8 mL. 각 추가 사이 솔루션을 믹스. 이 솔루션을 필요에 따라 신선한 준비 될 수 있다.
      2. 준비 반 Gieson ' s 솔루션 1% 산 fuchsin 혼합 하 여 1 mL 및 포화 picric 산 45 mL. 고 서 서 하룻밤 잘 수 있습니다. 이 솔루션은 2 주 동안 안정.
      3. 준비 차별화 솔루션 (2% 제 2 철 염화 물) 10% FeCl ₃ 10 mL 40 ml에서를 혼합 하 여 증류수. 이 솔루션을 필요에 따라 신선한 준비 있습니다.
      4. 5.0 g 나트륨 thiosulfate 증류수 100 mL 물에 용 해 하 여 준비 5% 포. 이 솔루션은 1 년 동안 안정.
   2. 얼룩 절차
      참고: 자세한 내용은 참조 하십시오 참조 ⁹.
      1. Verhoeff에는 aortas를 배치 하는 10 분을 위해 간단히, 증류수에 수확된 aortas의 고정된 파라핀 섹션 화 ' s 되며 물과 차별화 솔루션 (2% FeCl ₃)에서 10-30 배 수영 25 분 세척에 대 한. 린스 물에. 1 분 씻어 물에 대 한 5% 포에 놓습니다. 반 Gieson에서 ' 5 분에 대 한 s 솔루션
      2. Dehydrate 다음에서 알코올에 순서: 75%, 90%, 95%, 100%, 그리고 100% 알코올 30 s 각. 그런 다음, 선택을 취소 5 분, 크 실 렌에 두 번 합니다. 수 지 장착 매체 coverslip에.
         참고: 탄성 섬유 표시 검정; 블루 블랙 핵: 즐 블루ck; 콜라겐: 빨강; 그리고 다른 조직 요소: 노란색.

결과

기술된 요원 기술 쥐에 폴리우레탄 카 테 터 삽입 및 infrarenal 복 부 대동맥의 봉합 결 찰의 조합을 사용 하 여 만성 대동맥 hypoxia 유발 동맥의 새로운 동물 모델을 만듭니다. 쥐 프로토콜 섹션에 설명 된 절차 후 안락사 28 일 있었다. aortas 수확 되었고 동맥 류 형성을 시각화 하기 위해 몇 군데. 그림 2 는 방 추상 AAA의 개발. Ex vivo에서 대동맥의 위쪽과 아래쪽 끝 팽창 없이 정상적인 직경이 있다. 대동맥 직경 transabdominal 초음파 (그림 3)를 사용 하 여 측정 되었다. 지름은 일반적으로 프로시저; 후에 대략 14 일에 최대 크기에 도달 그 후, 그것은 그대로 또는 약간 증가. 그림 4 는 EVG 얼룩 후 최대 직경에는 동맥의 histopathological 이미지를 보여준다. (동맥)의 28 일에 조직 이미지 날 0에 비해 탄성 섬유의 저명한 저하를 보였다.

복 부 대동맥 동맥 류 (AAA)를 유도 하기 위해 그림 1: 수술 절차.
(A) infrarenal 대동맥 주변 조직에서 피부 박피입니다. (10 m m 긴 컷 B)는 폴리우레탄 카 테 터 대동맥에 작은 절 개를 통해 삽입 됩니다. (C) 절 개는 8-0 monofilament 봉합으로 복구 되 고 혈액의 흐름이 복원 됩니다. (D)는 대동맥은 삽입 된 카 테 터에 5-0 비단 봉합으로 출혈. 눈금 막대 = 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 수술 후 대표 결과입니다.
방 추상 복 부 대동맥 동맥 류 수술 후 하루 28 보여주는 개발에 거시적인 전망. retroperitoneum의 높은 마진 (깨진된 선; 왼쪽) 동맥의 외부 가장자리에 해당합니다. Ex vivo에서 대동맥의 위쪽과 아래쪽 끝 (오른쪽) 정상입니다. 눈금 막대 = 3 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 최대 대동맥 직경 transabdominal 초음파를 사용 하 여 측정
대동맥 직경은이 쥐 모델에서 꾸준히 증가 했다. 대동맥 직경은 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다 (n = 12). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 얼룩 Elastica 밴 Gieson와 aneurysmal 조직의 대표 이미지.
EVG 퇴행 성 탄력 있는 lamina에서 보여주는 미디어와 intraluminal 혈전의 형성 절차 후 28 일 (오른쪽) 얼룩과 조직학 평가. 대동맥 미디어에 탄성 섬유 조각화 및 대동맥 adventitia에 스파스 콜라겐 섬유는 28 일에 관찰 된다. 0 (왼쪽) 프로시저가 전에 이다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

생리 적인 조건 하에서 대동맥 벽의 내부 레이어는 외부와 중간 레이어는 영양 VV, adventitia에서 중간 VV¹에 침투 하는 반면 luminal 혈액 흐름에서 확산에 의해 영양는 있습니다. VV 혈 복 부 대동맥 벽에는 다음 세 가지 방향/영역에서 발생 한 수 있습니다: (1) 대동맥 벽, 대동맥 벽, 및 (3) 혈관 주위 조직¹⁰(2) 원심 방향 통해 인접 방향. 이전에, 인간의 조직의 조직학 분석 중요 한 협 착 또는 폐색 복 부 대동맥 벽에 VV 혈액 흐름 감소⁴수 제안 AAA 벽에 VV의 식별. 그것은 infrarenal AAA 폴리우레탄 카 테 터 삽입 및 infrarenal 복 부 대동맥의 봉합 결 찰의 조합에 기인 했다이 프로토콜에서 매우 중요 한 포인트. 신중 하 게 조직 계층을 벗 겨 지 다, 외과 원활 하 게 대동맥에 폴리우레탄 카 테 터를 삽입 하 고 단단히 hypoperfusion adventitial VV 및 동맥 류 형성으로 인해 만성 저 산소 증을 대동맥 선 해야 합니다. 이러한 기술을 사용 하 여, 대동맥 벽에 혈액의 흐름을 따라서 감소 하 고, 그리고 로컬 hypoxic 환경 유발 됩니다. 혈액 흐름 감소와 hypoxia 유발 동맥 형성 나타냅니다 VV 혈 복 부 대동맥 벽으로 AAA 형성의 병 인에는 역할을 한다.

특히, 대동맥 동맥 모델 다음 조건을 충족 해야 합니다: 기준선, tunica 매체의 퇴보와 대동맥 벽의 염증에 비해 혈관 직경에 1.5-fold 증가. 가장 인기 있는 동물 모델 유도 하는 염증 성 반응을 CaCl₂¹¹, elastase¹², angiotensin II¹³등 물질을 사용 하 여 건설 되었습니다. 이 모델 수 높은 재현성을가지고 하 고 분명히 병 적인 변화를 일으킬 그들은 일반적으로 연구에서 사용 된. 우리의 모델에서 우리는 사용 하 여 초음파에서 7 일 마다 절차 (그림 3) 후 날 28까지 절차를 수행 하기 전에 대동맥 직경 평가. 결과 대동맥 직경 적당히 증가 28 일 동안, 직경에 있는이 변화는 이전 설치류 모델에서 유사한 나타내는 보여주었다. 혈관 형태의 총 관찰 표시 부드러운 방 추상 모양 (그림 2). 28 일에 우리는 쥐를 희생 하 고 복구 된 대동맥 조직의 histopathological 분석을 수행. 찢 어과 tunica 매체와 adventitia의 탄성과 콜라겐 섬유의 실종 (그림 4) 관찰 되었다. 또한, 염증 세포, 대 식 세포, 등 tunica 매체 tunica adventitia에서 참석 했다.

현재, AAAs 사용할 수 있는 치료 옵션에 외과 혈관 내 수술 텐트 접목, AAA 파열¹⁴환자의 30-50%의 사망률으로 제한 됩니다. 그러나, 약 AAAs 치료 임상 사용을 위해 승인 되었습니다. 병 적인 결과 인간과 AAA 연구에 사용 되는 설립된 동물 모델 사이에서 불일치는 논쟁이 있다. 인간의 AAA 및 AAA 모델 동물 간의 병 인 유사성 약리 치료의 발전을 위해 필수적입니다. 설치류 모델의 효과 관한 우리의 쥐 모델은 형태학 상으로 인간 intraluminal 혈전⁵ 와 지질⁸점에서 비슷합니다. 또한,이 연구에서 쥐의 약 20%가 AAA 파열 졌고 절차 후 28 일 이내에 사망 했다. 대동맥 동맥 류 파열은이 질병에 대 한 가장 중요 한 이벤트, 파열 설립 실험 AAA 모델, 공통 이며 메커니즘은 아직 해명 하지 했습니다. 따라서,이 모델은 대동맥 직경의 팽창과는 동맥의 파열의 메커니즘을 이해 하는 데 유용 합니다.

이 모델의 창조는 어떤 수술 절차에 대 한 필요 합니다. 따라서, 연구자는이 모델의 한계는이 모델을 만드는 연습 해야 합니다. 미래에, 우리는 우리가 줄일 수 있습니다 혈액 흐름 점차 VV 벽을 두껍게 하 여 자발적인 대동맥 동맥에서 발생 한 설치류 모델을 만드는 고 싶습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
쥐	일본 SLC. Inc	Slc:SD 랫	Sprague– Dawley ratTM
포비돈-요오드 용액	Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 비단끈	아키야마 메디컬 MFG. CO.,LTD	JIS No.1
혈관 클립	나츠메 제작소 주식회사	C-42-S-2
폴리우레탄 카테터(24게이지 주입 바늘)	MEDIKIT	24G	Supercath Z4VTM, 24게이지 침투 바늘
폴리우레탄 카테터(18게이지 주입 바늘)	MEDIKIT	18G	Supercath Z3VTM, 18게이지 침투 바늘
8-0 모노필라멘트 스트링	Ethicon 봉합사	c-42-S-2	PROLENE 폴리프로필렌 봉합사, 봉합사로 절개 부위 수리