고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

Summary

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

Supramolecular 단백질 어셈블리는 호스트 병원 체 상호 작용, 신경 퇴행 성 질환의 전파에 바이러스 성 감염에서에서 배열 하는 생물 학적 과정에 근본적인 역할을 재생 합니다. 이러한 어셈블리는 다양 한 세포 기능을 실행 하거나 해로운 결과 가져올 수 있는 큰 고분자 개체를 형성 하는 비 공유 방법에는 여러 단백질 소 단위에서 구성 됩니다. 어셈블리 메커니즘 및 그 고분자 어셈블리의 기능에 원자 통찰력 남아 그들의 고유한 용해성 이후 종종 부족 및 비 결정성 종종 크게 대부분 기술에서 얻은 데이터의 품질을 감소 구조 생물학, 엑스레이 결정학 및 솔루션 핵 자기 공명 (NMR) 등에서 사용. 여기 선물이 매직-각도 회전 고체 NMR 분광학 (SSNMR) 원자 해상도 고분자 어셈블리의 구조를 조사 하는 강력한 방법으로. SSNMR는 원자 크기와 가용성 제한 없이 조립된 복잡 한 내용을 밝힐 수 있다. 여기에 제시 된 프로토콜 ¹³C의 생산에서 필수적인 단계를 설명 합니다 /¹⁵N 동위 원소 표시 된 고분자 단백질 어셈블리 표준 SSNMR 스펙트럼 분석 및 해석의 수집. 예를 들어, 우리는 filamentous 단백질 어셈블리의 SSNMR 구조 분석의 파이프라인을 보여줍니다.

Introduction

매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (SSNMR) 발전 구조는 원자 해결책에 고분자 단백질 어셈블리 특성에 대 한 효율적인 도구를 제공 합니다. 이러한 단백질 어셈블리는 많은 생물학 과정에 필수적인 역할을 재생 하는 유비 쿼터 스 시스템입니다. 그들의 분자 구조, 상호 작용 및 역학 SSNMR 연구에 표시 되었습니다으로 액세스할 수 있는 바이러스 성 capsids (¹) 세균 감염 메커니즘 (분 비 시스템^2,3, 피리⁴), 막 단백질 복합물^5,6,,78 그리고 기능 amyloids ^9,,1011. 이러한 유형의 분자 어셈블리 pathologies와 같은 신경 퇴행 성 질환 단백질 misfolded, 녹말 체 상태에서 모이고 탈 셀 동작 시키거나 세포 죽음 ^12,13에 자극 또한 수 있습니다. 단백질 어셈블리 종종 소, 필 라 멘 트, 모 공, 튜브, 또는 나노 입자를 포함 하 여 다양 한 형태의 큰 supramolecular 개체로 소 단위 단백질의 여러 복사본의 대칭 oligomerization에 의해 만들어집니다. 제 사기 건축 공간 및 시간 어셈블리를 구성 하 고 세련 된 생물학적 기능에 대 한 단백질 소 단위 사이 약한 상호 작용에 의해 정의 됩니다. 이러한 어셈블리에 원자 규모에서 구조 조사는 그들의 본질적인 용해성부터 고해상도 기법에 대 한 도전 및 그들의 비 결정성 기존의 엑스레이 결정학 또는 NMR 해결책의 사용을 제한 하는 매우 자주 접근 한다. 매직 앵글 회전 (MAS) SSNMR 불용 성 고분자 어셈블리에 원자 해상도 데이터를 얻기 위해 신흥 기술 이며 복잡 한 바이오 시스템 등의 증가 대 한 3 차원 원자 모델을 해결 하려면 효율성 입증 세균성 필 라 멘 트, 녹말 체 어셈블리 및 바이러스 성 입자 ^{14,15,,1617,18,19,20, 21,22}. 높은 자기장, 방법론 개발 및 샘플 준비 기술 진보는 고분자 다양 한 환경에서 특히 그들의 생물학 관련 불용 성 단백질을 조사 하는 강력한 방법으로 매스 SSNMR 설립 조립 상태 또는 기술은 매우 cryo 전자 현미경 검사 법을 보완 하는 세포 세포 막에서. 대부분의 경우에 대칭의 매우 높은 학위 같은 단백질 어셈블리 특징. Homomolecular 어셈블리에서 모든 단백질 소 단위는 동일한 로컬 구조 했 매스 SSNMR이이 기능을 악용 및 따라서 거의 동일한 SSNMR 시그니처를 크게 분석의 복잡성을 감소.

적당 한 매스에 의해 고분자 단백질 어셈블리의 구조 연구에 대 한 효율적인 프로토콜 (< 25 kHz) SSNMR이이 비디오에 제시 하 고 다른 단계 (그림 1)로 세분화 될 수 있습니다. 우리 filamentous 단백질 어셈블리 ( 그림1에서 참조 강조 단계), 단백질 소 단위 정화를 제외 하 고 각 단백질에 대 한 서로 다른 exemplified SSNMR 구조 연구의 흐름의 중요 한 단계를 보여줄 것입니다. 어셈블리 구조 연구, 그리고 어떤 전문 자습서 SSNMR 분광학 및 구조 계산의 기술/방법론 세부 사항에 가지 않고 중요 하지만 수 있습니다 온라인. 현재 프로토콜은 주로 고체 NMR 실험 MAS 조건 하에서 수행에 초점을, 하는 동안의 사용 생물 환경 ^23,,2425,26 정렬 ^{, 27}, 정렬 된 bicelles 같은 단백질 구조와 매스 기술 없이 막 같은 미디어에서 동적 단백질-단백질 상호 작용의 수사를 위해 수 있습니다. 우리는 중요 한 SSNMR 스펙트럼 분석 및 해석의 기록 뿐만 아니라 단백질 식 및 어셈블리 단계 표시 됩니다. 우리의 목표는 SSNMR 기술로 고분자 어셈블리의 원자 해결책 구조 연구를 수행 하는 독자를 사용 하는 구조 분석 파이프라인에 대 한 통찰력을 제공 하는 이다.

3 섹션을 포함 하는 프로토콜:

1. 고체 NMR 샘플 생산

고체 NMR 분석에 필수, 단백질 표현 될 필요가 고분자 어셈블리의 구성 요소, 동위 원소 분류, 정제 하 고 조립 체 외에 (예를 들어 참조 그림 2)에 대 한 네이티브 처럼 복잡 한 상태에 . 높은 NMR 감도, ¹³C와 ¹⁵N 라벨에 동위 원소 농축이 필요한 최소한의 세균성 식 미디어 ¹³C와 균일 하 게 ¹³ 같은 ¹⁵N 소스 보완 사용 C 라는 포도 당/글리세롤과 ¹⁵NH₄Cl 각각. 프로토콜의 나중 단계에서 선택적으로 ¹³C 라는 샘플 생산 선택적으로 ¹³C 표시와 같은 소스 (1, 3-¹³C)-와 (2-¹³C)-글리세롤 (또는 (1-¹³C)-와 (2-¹³C)- 포도 당) NMR 분석을 촉진 하는 데 사용 됩니다. 50 ¹⁵N-및 50 ¹³C 표시 또는 50%의 아데닌 혼합물에 해당 하는 혼합된 레이블된 샘플 (1, 3-¹³C)-50% (2-¹³C)-포도 당 intermolecular의 탐지를 설명 하기 위해 도입 상호 작용입니다. 어셈블리 단계에서 엄격한 조건으로 단백질 순도 높은 수준의 최종 샘플의 균질 구조 순서를 보장 하기 위하여 핵심 요인이 있습니다.

2. 예비 구조 특성화 기반 1 차원 (1d) 고체 NMR

선물이 SSNMR에 의해 구조 분석에 대 한 필수적인 실험. 1 차원 (1d) 크로스-편광 (CP)와 무능 / RINEPT²⁸ 실험, ¹³C 핵에 어셈블리에 각각, 견고 하 고 유연한 단백질 세그먼트를 감지 하 고 구조의 정도 추정 하는 데 사용 됩니다 동질성 그리고 로컬 다형성 (대 한 예를 들어 그림 3참조).

룽 > 3. 구조적 분석 및 3 차원 구조 결정

하위 섹션 1과 2 우려 화학 변화는 지역 환경에 매우 민감한 프로브와 피/psi를 예측에 사용할 수 있습니다 단백질 어셈블리의 모든 단단한 잔류물의 SSNMR 공명 지정에 따라 구조적 분석 2 면 각 하 고 그로 인하여 이차 구조를 결정 합니다. 그림 4 단백질 어셈블리. 의 딱딱한 코어에서 순차적 공명 지정의 예를 보여 줍니다. 3 차원 구조 결정은 구조적 데이터의 수집 같은 기반 거리 억제 인코딩 가까운 근거리 (< 7-9 Å), 인트라넷 및 intermolecular 정보 포함. 하위 섹션 3와 4는 장거리 먼 구속 수집 및 해석 설명합니다. 장거리 연락처에서에서 발생 하는 찌 꺼 기 나 j,와 함께 intramolecular ¹³C-¹³C 근거리로 정의 | i j | ≥4, 그로 인하여 3 차 단백질 겹 intermolecular ¹³C-¹³C 근거리 또는 단위체 소 단위의 정의 어셈블리에 단백질 소 단위 사이 intermolecular 인터페이스 정의 내부-및 intermolecular 인터페이스는 그림 5에 나와 하 고 있습니다. SSNMR 억제 감지 ¹³C-¹³C와 ¹⁵N-¹³C recoupling 실험은 일반적으로 internuclear 거리에 대 한 인코딩 < 1 nm. 하위 4 intermolecular 거리 지지대의 검색에 설명합니다. 균질 분류 샘플 (즉, 균일 하 게 또는 선택적으로 표시는 100%)를 사용 하 여 대칭 단백질 어셈블리에서 intermolecular 소 단위-소 단위 상호 작용을 식별 하는 것은 제한 된로 두 내부-및 남북-molecular 연락처 이어질 탐지 가능한 신호입니다. Intermolecular 근거리의 명백한 탐지 집계 이전 결합 2 개의 다르게 분류 샘플의 아데닌 혼합물 포함 된 혼합된 레이블이 지정 된 샘플을 사용 하 여 이루어집니다. 하위 5 간단히 구조 모델링을 소개합니다.

그림 1 : 고체 NMR에 의해 원자 해결책 구조 연구의 워크플로. ¹³ C ¹⁵N 동위 원소 라는 단백질 생산, 소 단위 정화, 소 단위 어셈블리, 어셈블리 형성, SSNMR 실험, SSNMR 실험 분석 및 거리 지지대의 추출의 제어 및 구조 모델링 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1. 솔리드 스테이트 NMR 샘플 productiona

1. 균일 하 게 ¹³ C의 생산 / ¹⁵ N 표시 된 단백질 소 단위
   1. 사용 갓 변형, pET24-펩 티 드-6his 플라스 미드 포함 대장균 BL21 (DE3) 셀, 준비 된 한 천 배지에서 그들을 수확.
   2. 접종 한 식민지와 미리 따뜻하게 파운드 매체의 15 mL 사전 문화. 37 ° C 200 rpm 떨고 하룻밤에 품 어.
   3. 미리 따뜻하게 M9 매체의 주요 문화 1 L에 사전 문화를 전송 (표 1에 구성 참조), 필요한 동위 원소 표시 된 탄소와 질소 근원 포함.
      참고:이 수 균일 하 게 ¹³ C 표시 된 포도 당, 선택적으로 (1-¹³ C)-또는 (2-¹³ C)-(또는 포도 당 ^{29 , , 30 31} 1, 3-¹³ C)-또는 (2-¹³ C)-글리세롤 ^{32 , 33} 분류.
   4. 37 ° C에서 이것을 품 어 고 문화 되 탁 OD ₆₀₀를 측정. OD ₆₀₀은 0.8의 값에 도달 하면 유도 0.75 m m IPTG 4 헤와 단백질 표정
      참고: 최적의 유도 조건 다른 한 단백질에서 변화할 수 있다.
   5. G x 6000과 4에서 30 분 동안 원심 분리 하 여 셀을 복구 ° c.
2. 정화 스케치 (비디오 프로토콜에 표시 되지 않음)
   1. 쥡니다 또는 lysozyme 치료 같은 표준 기술을 사용 하 여 세포를 Lyse 고 정화 설립에 대 한 적응 기법을 사용 하 여 단백질 소 단위는 단백질 어셈블리 조사.
      참고: 단백질 표현할 수 있습니다 포함 시체에서 확인 단백질 지 방화를 위한 세포 세포의 용 해 및 후속 원심 분리에 의해. 단백질 세포 파편을 사방에 발견 되 면 그것은 포함 신체에 축적 되었습니다.
   2. 테스트 식 고 순도 단백질 샘플 예에 의해 표준 12-15% 트리 스 Tricine SDS-페이지의 그림 2A 참조. 순수성은 충분 한 단백질을 조립 될 수 있다, 그렇지 않으면 추가 정화 단계 수행.
3. 단백질 필 라 멘 트의 생체 외에서 조립
   1. 정제 솔루션에 단백질 농도 확인. 단백질 흡수 잔류물을 포함, 280에서 UV 분 광 광도 계에 흡수 측정 nm. 교정으로 분 광 광도 계에 순수한 버퍼를 삽입 하 고 다음 단백질 흡 광도 측정.
   2. 적응 맥주 Lambert 법률 단백질 소 단위의 흡수 계수를 사용 하 여 단백질 농도 계산: _λ ε _λ = l x x c; 여기 A는 광학 밀도 주어진된 파장 λ;에서 ε는는 특정 흡수 계수; l은 cm; 광 궤적의 길이 c는 mol/l.에 있는 농도
   3. 원심 필터 단위에서 1 m m의 농도에 단백질을 집중 한다. 원심 필터에 샘플 소개 30 분 4000 x g에서 원심, 필터 단위에서 솔루션 필터에 증 착 단백질을 피하기 위해 피펫으로 부드럽게 혼합. 원하는 농도 도달할 때까지 절차를 반복.
      참고: 최적의 어셈블리 농도 시스템에 따라 달라 집니다 그리고 (0.1-1 m m) 사이 보통 최적화 될 필요가 있다. 두 개의 서로 다른 레이블된 단백질 배치의 샘플 준비는 아데닌 레이블이 혼합 하는 경우 (예: (50/50) (U-¹⁵ N)-/ (U-¹³ C)-표시), 혼합 일어나 야 전이나 직후에 되도록 농도 단계 균질 혼합된 솔루션.
   4. 튜브로 샘플을 전송 하 고 실 온에서 1 주일 동안 동요에서 품 어.
   5. 일반적으로 필 라 멘 트에 소 단위의 중 합 되 고 혼 탁 한 솔루션 동반 된다. 전자 현미경 검사 법 (6300 X-45000 X 확대)에 의해 예를 들어 미세한 fibril 형태학과 동질성을 확인, 그림 2B 참조.
   6. 원심 분리기 샘플 1 h g x 20000 및 4에 대 한 ° C. 제거는 상쾌한의 대부분 샘플 건조를 피하기 위해 표면에 충분 한 액체를 둡니다. UV 분 광 광도 계에 소 단위 조립 비에 대 한 상쾌한 확인.
   7. 씻어 h 조 ₂ O를 추가 하 여 샘플 및 주의 피 펫으로 콘텐츠를 resuspend. 와 동 하지 마십시오. 22000 g x 4에서 30 분에 대 한 샘플을 회전 ° C. 세척 단계 3 번 반복. 확인 모든 세척 단계 동안 펠 릿을 유지 하는 경우의 측면 원심 분리 후 하 고 비 조립 subunits UV 분 광 광도 계에 대 한 상쾌한 확인.
   8. 0.02% (w/v) 나트륨 아 지 드 (NaN ₃) 세균 오염을 방지 하 고 저장 샘플을 4에서 측정까지 추가 ° c.
4. 솔리드 스테이트 NMR로 터 작성
   1. x g와 4 ° C. 제거 최대 크기는 상쾌한 22000에 30 분 동안 두 번 원심; 결과 샘플 일관성 단백질 어셈블리에 따라 달라 집니다 일반적으로 젤과 예금.
   2. SSNMR 회전자에 샘플을 삽입 하는 모 세관 피펫으로 사용.
      참고: 여기에 우리가 현재 절차 4 m m 직경 회전자. 부드럽게 회전자에 샘플을 소개
      1. 분리기 회전자 테이블에 원심 분리기. 절차를 반복 하 여 회전자 채워집니다. 회전자로 터 캡을 최소 공간을 유지 합니다. 샘플 수량 충분 하지 않으면 소개로 터에 샘플 배포 동질성을 보장 하기 위해 나머지 공간을 채우기 위해 상용 삽입.
         참고: 종속 조립된 샘플 일관성에 그것은 특히 매우 조밀한 샘플에 대 한 얇은 주걱을 사용 하 여 더 적절 한 수 있습니다. 로 터 직경 2.5 ~ 4 mm의 적당 한 매스 주파수에서 사용 됩니다.
   3. 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 산 (DSS)의 내부 화학 변화 및 온도 보정에 대 한 추가.
   4. 닫는 장치와 뚜껑을 닫습니다.
   5. 뚜껑 잘 삽입 및 완전히 폐쇄 하는 경우 돋보기 아래 확인.

그림 2: 대표에 대 한 결과 단백질 소 단위 정화 및 어셈블리 A) 15%의 단백질 소 단위 트리 스 tricine SDS 페이지 (그의 ₆을 포함 하 여-태그) 정화의 다른 단계에서. 레인 1-단백질 분자량 마커; 레인 2-대장균 BL21 (DE3) 세포 uninduced 제어; 레인 3-대장균 BL21 (DE3) 세포 유도 0.75 m IPTG; 레인 4-solubilized 포함 시체 레인 5-세포 lysate;의 표면에 뜨는 분수 레인 6-니켈 후 정화 분수 움직일 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) FPLC과 담 수 있습니다. B)는 부정적인 편 영상에 의해 단백질 소 스테인드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 1 차원 (1d) 고체 NMR를 기반으로 하는 예비 구조 특성화

1. 초기 설치 및 1 D 크로스-편광 (CP)
2. NMR 자석으로로 터를 삽입
하는
1. 시작 5 kHz의 주파수에로 터를 회전 및 ± 10 Hz의 안정화에 대 한 대기 다음 7 kHz까지 가속. 조정 하 고 일치 하는 ¹ H와 ¹³ C ¹⁵ N 채널. 설정 온도를 2-10 ° C (275-283 K); 샘플 7 khz 매스 난방 낮은 이며 온도 조정은 일반적으로이 매스 주파수에서 필요 하지 않습니다.
2. 16 스캔을 사용 하 여 단일 펄스 1 D ¹ H 스펙트럼 기록.
   참고: 전력 레벨을 해야 합니다 이전 최적화 되어 참조 화합물에 (는 ¹³ C 등 / < 수p > 15 N 히스티딘 또는 글리신), 최적화 대상 샘플;에 실험에 전력 레벨에 대 한 시작 값을 제공 하 이 절차는 일상적인 작업 및 따라서이 프로토콜에서 범위 중.
3. 수산화 샘플 온도 대량 물 ¹ H 공명 DSS 신호 ³⁴ 기준의 상대적 변화에 반영에 2-10 ° C 사이 모든 실험 동안 온도 유지. 온도 관계 δ (H ₂ O)를 다음 측정 = 7.83-T/96.9 1-2 ° C ³⁵의 정밀.
4. 세트를 원하는 매스 주파수 및 ± 10 Hz의 안정화 될 때까지 대기.
   참고: 여기 그것은 설명의 주파수에 대 한.
5. 조정 및 일치 ¹ H와 ¹³ C 다시 채널과 1 D ¹ H 실험의 도움으로 온도 조정.
6. 설정 1 D ¹ H-¹³ C CP ³⁶.
   참고: CP 실험 엄밀한 구조에 있는 잔류물에서 발생 하는 신호를 보여줍니다. 펄스 교정 및 분리 매개 변수 최적화할 수 있습니다 직접 샘플에 감도 충분히 미만 ~ 32 검사 후 신호를 관찰 하 높을 때. 초기 최적화 값은 참조 화합물에 표준 최적화에서 점령. CP 연락처 시간과 전력 레벨은 최대 신호 강도에 따라 선택 됩니다. 단백질 견본, 최적의 CP 연락처 시간에서는 보통 200 µ s와 디 커플링 매개 변수도 다시 조정 해야 참조 화합물에 교정에서 2 양 사이입니다.
   1. 똑똑히 관찰 하는 주어진 매스 주파수 측 대역 회전의 지역화.
7. 1d 스펙트럼 지문 역할을 한 참조 1 D ¹³ C CP 스펙트럼 기록. 일반 매개 변수는 128 스캔, 1 CP 연락처 시간, 강도, 3 s의 재활용 지연 및 수집의 25 ms를 디 커플링 하는 100 kHz.
8. ¹ H와 ¹³ C 화학 교대 IUPAC 권고 ³⁷ 다음 보정. ¹ H DSS 신호 (0 ppm의 화학 변화);의 공명 주파수를 확인 ¹³ C 화학 교대 ¹ H 교대 (보통 ~ 0.25144, ¹ H 공명 주파수 ^{37 13} C의 비율에서 파생 된)로 참조 됩니다.
9. 1 D ¹ H-¹³ C CP apodization 없이 실험 하는 과정 (참조 그림 3A와 B 균질 정돈된 단백질 조립에 대 한 탐지) 기능. 구조 순서와 동질성을 나타내는 샘플에서 선 폭을 추정 하는 격리 된 피크를 선택 합니다. 높은 자기장에서 매스 아래 정돈된 생물학 단백질 어셈블리에 대 한 일반적인 ¹³ C 선 20-150 Hz (절반 높이 (FWHH)에서 전각으로 측정 되는) 사이 범위.
10. CP 스펙트럼에서 신호 대 잡음 (S/N) 비율 추정.
    참고: S/N 비율을 포함 하 여 주로 샘플으로 터, 단백질 구조 강성과 단일 분자 나 란 존재의 정도에 많은 요인에 따라 달라 집니다. 엄지손가락의 규칙으로 서 샘플 적합 해야 다차원 SSNMR 분광학에 대 한 신호는 최적화 된 1 D ¹ H-¹³ C CP 스펙트럼 64 검사와 기록에서 관찰 되는 경우.
11. 는 단백질 등뼈 카보닐기 공명 (주로) 165-180 ppm 사이 지역화의 스펙트럼 영역으로 확대 합니다. Α 나선형에서 단백질 등뼈 카보닐기 공명 잔류물에서 공명과의 위치에 의해 어셈블리에 이차 구조 내용 견적 또는 β 물가 구조 downfield 또는 upfield, 각각 (참조 그림 3B는 주로 α 나선형 소 단위에 대 한) ³⁸.
3. 1 D 무능 실험
   1. 높은 모바일 부품 (sub-µ s) 단백질 어셈블리의 프로브를 1 D ¹ H-¹³ C 무능 실험 설정.
      참고: GARP 수집 ³⁹ 동안 몇 kHz의 분리는 일반적으로 사용, 짧은 interscan 지연 수 있도록 (일반적으로 1 s) 조사 손상 없이.
   2. 모바일 단백질 세그먼트에 대 한 지문 역할을 참고 부적 절 한 스펙트럼을 기록, 일반 매개 변수는 128 검사 및 25 양의 획득 시간
   3. 과정 ¹ H-¹³ C 부적 절 한 실험. 금액 및 신호의 위치는 각각 모바일 잔류물 및 아미노산 조성의 양을 나타내는.
      참고: 2D ¹ H-¹³ C 부적 절 한 실험 신호는 1 D 부적 절 한 스펙트럼에 존재 하는 경우에이 기록 (예를 들어 그림 3C 참조) 보다 구체적인 아미노산 식별을 허용 하도록. 모호한 할당의 경우, 솔루션 NMR에 의해 버퍼 구성 요소 신호 위치를 확인 것이 좋습니다.
   4. BMRB 데이터베이스 ⁴⁰을 사용 하 여 그들의 해당 아미노산에서 랜덤 코일 구조 근처에 공명 할당할 데이터 ³⁸ 출판; 스펙트럼 포함 되지 않은 경우만 모바일 버퍼 구성 요소 잔류물은 매우 모바일 정권에서.

그림 3:의 대표적인 결과 체계적인된 단백질 어셈블리 SSNMR 스펙트럼 취득입니다. A)은 ¹³ C 검색 FID ¹ H-¹³ C 교차 편광 실험의. B) ¹ H-¹³ C 교차 편광 실험. C) ¹ H-¹³의 딱딱한 단백질 어셈블리; C 부적 절 한 실험 버퍼 구성 요소만 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 구조적 분석 및 3 차원 구조 결정

1. 순차적 공명 할당
   1. 설정 2D ¹³ C-¹³ C 양성자 기반 스핀 확산 (PDSD) ⁴¹ 내 잔류물 ¹³ C-¹³ C 상관 관계, 사이드 체인을 포함 한 검색 실험. H-¹³ C CP 실험 1 D ¹에서 초기 ¹ H-¹³ C 간 양극 화 단계에 대 한 값 인수할 것을 환영 합니다.
      1. 설정 혼합 시간 균일 하 게 ¹³ C 표시 된 샘플에 대 한 50 ms 및 100 ms 선택적으로 ¹³ C 표시 된 샘플. 5 월 25 일 ms (exemplified 무료 유도 감퇴 (FID) 길이 보이는 신호에 의해 예상할 수 있는 본질적인 스펙트럼 분해능에 따라 15-25 ms 사이 직접 수집 사이 간접 획득 시간 설정 그림 3A).
      2. 스펙트럼에서 신호 대 잡음 및 해상도 최적의 값을 찾으려고 여러 처리 매개 변수를 테스트, 일반적으로 적절 한 처리 달성 될 수 있다 2.5-4의 사인 벨 교대 (SSB)와 qsine 창 함수를 사용 하 여.
   2. 설정, 기록 및 프로세스는 2D ¹³ C-¹³ C PDSD 중간 혼합 시간 실험 순차적 ¹³ C-¹³ C 상관 주로 i-i±1, 연결을 감지 하지만, 또한 i±2 및 i±3 잔류물, 단백질 등뼈 강성에 따라 이차 구조 요소. 혼합 시간 균일 하 게 레이블이 지정 된 샘플에 대 한 100-200 ms 사이의 설정 되어야 합니다. 다른 값은 모두 짧은 시간 2D ¹³ C-¹³ C PDSD 혼합에서 점령 수.
   3. 설정, 기록 및 프로세스는 2D ¹⁵ N-¹³ C N _나 CA _나 및 N _나 CO _나 CP ¹ H-¹⁵ N를 사용 하 여 특정 CP ¹⁵ N-¹³ C 전송 실험 ⁴². 관심, CA 또는 생성 영역에서 최대 강도에 따라 각각의 샘플에 직접 ¹⁵ N-¹³ C 분극 전송 1 D 패션에 최적화. Typi특정 CP 연락처에 대 한 칼 값은 2-6 양 사이
   4. 설정, 기록 및 2D ¹⁵ N-(¹³) C-¹³ C의 시리즈 임무 목적에 대 한 실험 과정.
      참고: 첫 번째 ¹⁵ N-¹³ C 분극 전송 매개 변수 값 수 점령는 N _나 CA _나에서 / N _나 CO _나 실험. 내 잔류물 상관 관계 (CA _나) CB _i와 N _i (CA _나) CO _나, 각각 사용 하 여 꿈 ⁴³, PDSD ¹³ C-¹³ C N _나에서 설립 분극 전송합니다. 잔류물 (i) 잔류물 (i-1) 순차 연결에서 얻은 것입니다 N _i (CO _i-1) CA _i-1 그리고 N _i (CO _i-1) CX _i-1 실험, PDSD ¹³ C-¹³ C를 사용 하 여 두 분극 전송.
   5. CcpNmr 분석 ⁴⁴ 등 스파키 ⁴⁵ 선택은 NMR 분석 프로그램
   6. 2D 스펙트럼 (CcpNmr 분석 exemplified) 소프트웨어에 로드 하 고 기본 단백질 시퀀스 로드.
   7. C-¹³ C PDSD 스펙트럼 짧은 혼합 ¹³에서 보이는 아미노산 종류의 식별으로 시작합니다. 연결 수 있도록 스핀 시스템의 탄소 원자는 " 잔류물 형 " 특정 할당; 트레오닌 잔류물의 할당에 대 한 그림 4A 참조. 최대한; 많은 잔류물을 식별 이 단백질 소 단위 크기, 스펙트럼 분해능 및 분산에 따라 달라 집니다.
   8. 오버레이 중간 혼합 ¹³ C-¹³ C PDSD 스펙트럼과 짧은 혼합.
      참고: 중간 혼합 PDSD에서 볼 수 보충 봉우리 순차에서 주로 발생 (잔류물 i-찌 꺼 기 i±1) 연락처. 그림 4B에서 2 잔류물 순차적 할당에 대 한 예 보여 줍니다.
      1. 스핀 시스템의 공 진 봉우리를 표시 하 고 다른 스핀 시스템의 공 진 주파수를 가진 중간 혼합 PDSD에 상관 관계를 찾을. 작은 단백질 또는 펩 티 드, 그것은 2D ¹³ C-¹³ C PDSD 실험에 따라 전체 순차적 공명 임무를 달성 하기 위해 가능한 수.
         참고: β 물가 이차 구조 모티브 잔류물에서 i-찌 꺼 기 i±2 ¹³ C-¹³ C 연락처 표시 될 수 있습니다 순차 연락처 공간;에 그들의 근접 때문에 보다 더 강한 신호 α 나선형 이차 구조 모티브 잔류물에서 i-찌 꺼 기 i±3 ¹³ C-¹³ C 연락처 또한 이어질 수 있습니다 강렬한 신호.
   9. 에 선택적으로 ¹³ C 라는 샘플 PDSD 실험 중간 혼합 사용할 수 있다면, 짧은 혼합 스펙트럼에 오버레이 (에서 사용 가능한 경우는 선택적으로 ¹³ C 표시 샘플)는 추가 할당 봉우리, 선택적 ¹³ C 라벨 고려 패턴 (1, 3-¹³ C와 2-¹³ C 글리세롤 ^{32 , 33} 또는 1-¹³ C 및 포도 당 ¹³ C 2 ^{29 , 30 , 31}.
      참고: 예를 들어에서 2-¹³ C 글리세롤 레이블이 여러 아미노산 종류는 인접 한 탄소 없이 Cα 위치에 표시 된 샘플 (Cβ와 C ') 표시, 따라서 Cα Cα을 애 용 인접 한 잔류물 사이 전송. 선택적으로 레이블이 지정 된 샘플에서 장거리 ¹³ C-¹³ C 상관 관계 수 쌓아 이미 중간 혼합 ¹³ C-¹³ C PDSD 실험. 피크는 순차 상관 관계에 의해 설명할 수 없는, 경우 그것은 장거리 접촉에서 발생할 수 있습니다. 고분자 어셈블리에 균질 소 단위 구조, 높은 주문에 대 한 공명 집합이 하나만 스펙트럼에 표시 될 예정 이다. 두 배 (또는 더 곱한) 공명 표시 됩니다 ¹³ C 원자에 대 한 또는 단백질 등뼈 뻗어, 원자 또는 어셈블리에 기본 시퀀스 스트레치에 대 한 두 가지 (또는 그 이상) conformations 각각 존재.
   10. 각 잔여물에 대 한 ¹⁵ N 공명 주파수를 식별 하기 위해 내부 잔류물 ¹⁵ N-¹³ Cα 상관 관계를 포함 하는 2D NCA 스펙트럼을 사용 합니다. ¹³ C 차원에서 해결 하지 않으면 충분 한, 2D NCACB 내 잔류물 ¹⁵ N 공명 주파수를 식별 하기 위해 Cβ 공명에 대 한 보충 정보 사용.
   11. 사용 하 여 2D NCACB 및 NCACO 스펙트럼 내 잔류물 ¹⁵ N-¹³ C-¹³ C 상관 포함 (i) 내부 잔류물 ¹⁵ N 주파수를 식별 하 고 (ii) ¹³ C-¹³ C에서에서 모호성을 해결 하려면 PDSD 추가 ¹⁵ N 차원의 도움으로. 꿈 전송으로 인해 신호 반전의 일반적인 Cα Cβ 상관 관계는 Cα 신호는 긍정 및 부정적인 Cβ 신호 관찰 이끌어 낸다. 또한 사이드 체인 ¹³ C, 스펙트럼에 표시 되는 경우는 긍정적인 다시.

그림 4: 2-차원 ¹³ C-¹³ C SSNMR PDSD 균일 하 게 정돈에 실험 ¹³ C, ¹⁵ N 표시 된 단백질 조립. A) 짧은 혼합 시간 PDSD (혼합 50 밀리초). B) 오래 혼합 시간 PDSD (200 ms 혼합)의 짧은 혼합 시간 PDSD 오버레이 사용 하 여 2 잔류물 스트레치 Ile32-Thr33의 할당입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 이차 구조 결정
   ,
   1. 사용 ¹³ Cα ¹³ Cβ 화학 변화 값을 계산 하는 보조 화학 이동 ⁴⁶ ΔδCα-ΔδCβ 이차 구조의 지표. ¹³-¹³ Cα (랜덤 코일)와 Cβ(assigned) ¹³-Cα(assigned) ¹³ Cβ (랜덤 코일)을 계산.
      참고: 랜덤 코일 구조에서 잔류물에 대 한 화학 변화 값 ³⁸에서 얻을 수 있습니다.
      1. 줄거리 ΔδCα-ΔδCβ, 음수 또는 양수 값을 > 연속에서 3 잔류물 β 물가 또는 α 나선형 구조를 각각 나타냅니다; 글리신 그리고 프롤린 잔류물으로 특이 한 화학적 이동 값을 표시할 수 있습니다 그들은 종종 역할 " 이차 구조 분리기 ".
   2. TALOS + ^{47 , 48} 또는 PREDITOR ^{49 , 50}를 사용 하 여 할당 된 화학 변화에서 단백질 2 면 각을 예측. 예측된 피/Psi 2 면 각 단백질 subu의 보조 구조를 반영니트와 모델링 과정을 통해 서 구조 지지대 사용.
3. 구조 억제의 컬렉션
   1. 설정 하 고 2D ¹³ C-¹³ C PDSD 장거리 ¹³ C를 감지 하 긴 혼합 시간 실험-¹³ C 상관 관계를 기록. 전형적인 혼합 범위 400 ms에서 1 시간 미 사용 선택적으로 ¹³ C 표시 샘플, 스핀 희석 크게 먼 탄소 사이 분극 전송 향상.
   2. 오버레이 긴 혼합 2D ¹³ C-¹³ C PDSD 기록 중간 혼합 ¹³에 선택적으로 레이블된 샘플에 C-¹³ C PDSD, 가능 하면 같은 선택적으로 레이블된 샘플에 기록. 더 먼 ¹³ C 원자 사이의 상관 관계에서 발생 하는 추가 봉우리. 공명 할당 하는 동안 고려해 선택적 라벨링 제도.
   3. 신중 하 게 정의 할당 허용 창, 즉이 신호에 기여할 수 있는 특정 ppm 범위에서 스펙트럼 분해능 공명에 의존 하는 스펙트럼의 해상도 평가. 할당 정밀도의 표준 편차 CcpNmr 분석 등 스파키 NMR 배정 프로그램에 자동으로 계산 됩니다.
   4. 신호는 순차적으로 설명 될 수 있는 경우 (잔류물 i-찌 꺼 기 i±1) 또는 중간 범위 ¹³ C-¹³ C 접촉 (잔류물 i-잔류물 나 ± 2, 3 또는 4), 릴레이 된 양극 화 이후이 할당 유지 전송 설명할 수는 상관 관계 ¹³ C-¹³ C 거리가 예상된 표시 연락처 범위 위에 경우에.
   5. 는 연락처 장거리 ¹³ C-¹³ C의 할당 주파수 애매 하 고 모호한 신호를 분류합니다. 명확한 주파수 할당의 경우 하나의 공명 지정 배정 허용 창에 관하여 가능 하다.
      참고: 모호한 과제 공차 창 내에서 모든 가능한 공명 할당 포함. 모호함 수 해제 동시에 구조 계산 중 아리아 등 계산 루틴에서 수행 명확한 억제만을 사용 하 여 계산 하는 예비 구조에 따라 명확성의 반복 라운드 ⁵¹ 또는 ⁵² UNIO. 또한, 다른 생물 소스 (예: 돌연변이 또는 소 단위 구조 솔루션 NMR 또는 엑스레이 결정학, 길이 당 질량 측정, cryo-EM 지도 의해 잘립니다)에서 구조 데이터 또한 사용할 수 있습니다에 대 한 모호성의 수준을 줄이기 위해 예 ^{1 , , 3 53 , 54 , , 55 56} 참조 ^{, 57 , 58}.
4. 대칭 단백질 조립에 intermolecular 거리 지지대의
   1. 에 2D ¹⁵ N-¹³ C 통증-CP ⁵⁹ 실험 설정 혼합된 (50/50) U-¹⁵ N-/ U-¹³ C 표시 된 샘플. 고통을 CP 스펙트럼에 신호 간 분자 ¹⁵ N-¹³ C 근거리에서 발생 한다. Intermolecular 연락처의 임무를 수행 하기 위해 이전 할당 된 공명 사용.
   2. 설정 2D ¹³ C-¹³ C PDSD 오래 혼합 시간 (> 600 ms)는 (50/50)에 혼합 (1, 3-¹³ C)-/ (2-¹³ C)-글리세롤 또는 (1-¹³ C)-/ (2-¹³ C)-포도 당 샘플.
      참고:이 ¹³ C-¹³ C 스펙트럼 감지 신호에서에서 발생할 내부 분자와 분자 간 ¹³ C-¹³ C 근거리. 그러나, 두 개의 라벨 제도의 높은 complementarity 간 분자 연락처, 예: 떠들고 CA에서에서 명확 하 게 발생 하는 특정 공명 쌍 수는 (2-¹³ C)-포도 당에서 떠들고 CB 상관 하위 단위 표시는 (1-¹³ C)-소 단위를 표시 하는 포도 당.
      1. 오버레이 2D ¹³ C-¹³ C 스펙트럼을 혼합된 샘플의 스펙트럼에 균질 분류 기록 샘플 ((1,3-¹³C)-와 (2-¹³ C)-글리세롤 또는 (1-¹³ C)-와 (2-¹³ C)-포도 당 샘플 표시). 혼합된 샘플에 기록 하는 스펙트럼에 추가 신호 분자 간의 상호 작용에서 발생 한다.
5. SSNMR 데이터에서 구조 모델링
   1. SSNMR 구속 목록 구조 계산에 필요한 준비: (1) 단백질 시퀀스; (2) 내부 분자 명확한 거리 억제; (3) 내부 분자 모호한 거리 억제; (4) TALOS 기반 2 면 각 억제; (5) 간 분자 명확한 거리 억제; (6) 간 분자 모호한 거리 억제; (다른 생물 기술 (예: 길이 당 질량, 대칭 매개 변수)에서 7) 추가 데이터.
   2. 여러 리뷰 제공 보완 구조 데이터 ^{14 , 60 , 15}와 함께 SSNMR 데이터에 따라 구조 모델링에 ^{, 19 , , 61 62} 예비에 관하여 구조 계산 하는 동안 모호한 거리 지지대를 disambiguated 수 주 명확한 거리 억제에 따라 구조 모델입니다. 구조 정확도 보장을 위해 신중 하 게 구조 단일 배를 수렴 하는 경우 관찰.

그림 5 : 내부-그리고 intermolecular 대칭 단백질 어셈블리에서 연락처. 나선형 고분자 어셈블리에 내부-대 intermolecular ¹³ C-¹³ C 장거리 연락처의 도식 적인 표현입니다. 소 단위는 화이트와 레드는 subunits의 혼합 라벨, 즉 두 개의 다른 라벨 제도의 1:1 혼합물을 수행한 어셈블리 전에 설명으로 표시 (예: 1-¹³ C 포도 당 및 1-¹³ C 포도 당). A) Intramolecular ¹³ C-¹³ C 장거리 연락처 (파란색 파선된 화살표); B) intermolecular ¹³ C-¹³ C 장거리 연락처 (레드 점선 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Results

전형적인 SSNMR 워크플로 그림 1에 나와 있는 몇 가지 단계를 포함 합니다. 일반적으로 단백질 소 단위는 시험관에서 분리 식에서에서 생성 대장균, 정화 그리고 조립 떨고 아래 하지만 때로는 또한 정적 조건에서. SDS 젤 착 색 인쇄기 (그림 2A) 식과 단백질 소 단위의 정화를 뒤. 고분자 어셈블리의 대형 다음 전자 현미경 (EM) 분석에 의해 확인 될 수 있다 (filamentous 어셈블리의 예는 그림 2B 참조).

SSNMR 회전자에 단백질 어셈블리의 도입, 후 터는 분석기에 삽입 하 고 매스 주파수 및 온도 규제 스펙트럼 기록 된다. 첫 번째 통찰력 1 D SSNMR 기법에 의해 얻을 수 있습니다. 그림 3 은 전형적인 SSNMR FID 구조적으로 균질 단백질 샘플, ¹H-¹³C CP 스펙트럼,¹³C 공명 단백질 소 단위에서의 경직 된 코어에 드러내는에 ¹³C 채널에는 조립과 모바일 잔류물을 대표 한 2D ¹H-¹³C 부적 절 한 스펙트럼. 에 대 한 원자 어셈블리 구조의 경직 된 코어, 다차원 SSNMR 실험 필요에 기록 균일 하 게 그리고 선택적으로 표시 된 샘플을 먼저 SSNMR 공명을 할당 한 다음 장거리 근거리 ( 그림 4를 참조 하십시오 감지 ).

모든 스펙트럼 및 처리 SSNMR 공명 할당 하 고 내부-그리고 intermolecular 거리 (그림 5) 추출 적절 한 소프트웨어로 분석. SSNMR 거리 지지대는 혼자 사용 되거나 또는 보완적인 기법에서 데이터와 함께, 있는 모델링 프로그램으로 통합 될 수 있습니다.

고분자 어셈블리 SSNMR 기술로 해결의 대표적인 원자 구조에 대 한 그림 6 세균성 부속 및 녹말 체 소 여러 filamentous 어셈블리를 보여 줍니다.

그림 6:Filamentous 고분자 구조 고체 NMR 접근 방식에 의해 결정: 세균성 필 라 멘 트와 녹말 체 단백질 소. A) uropathogenic 대장균, PDB 코드 2N7H ⁴;의 유형 1 pilus B) ASC 필 라 멘 트, PDB 코드 2N1F ⁶³; C) 유형 III 분 비 시스템 바늘, PDB 코드 2MME, 2LPZ 및 2MEX ^2,,364; D) 아 밀 로이드-베타 AB42 소, PDB 코드 2NAO, 5KK3, 2MXU ^65,,6667 및 오사카 돌연변이 PDB 코드 2MVX ⁵⁷, 아이오와 돌연변이 PDB 코드 2MPZ ⁵⁸; E) 알파 synuclein 소, PDB 코드 2N0A ⁶⁸; F) 한의 프리온 도메인, PDB 코드 2RNM, 2KJ3^{, 6970}. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

고체 NMR (SSNMR)는 원자 수준에서 고분자 단백질 어셈블리 특성화에 대 한 선택의 방법입니다. SSNMR 기반 구조 결정에 중앙 문제 중 하나는 일반적으로 저해상도 모델 (포함 하는 보조에서에서 배열 하는 다양 한 정밀의 3 차원 구조 모델 구축 있도록 조사 시스템의 스펙트럼 품질 구조 요소와 약간의 3D 정보) 의사 원자 3 차원 구조. 수량 및 품질의 구조 정보를 다차원 SSNMR 실험에서 추출 어셈블리의 고해상도 NMR 구조 계산 하 키입니다.

설명된 프로토콜 ¹³C-¹³C ¹⁵N-¹³C 구조 억제 여러 2D (그리고 때로는 3D) 스펙트럼 높은 신호-잡음 기록 요구의 검출에 의존 합니다. 적당 한 매스 주파수에서 (< 25 kHz), 샘플은 단백질 양의 최대 ~ 50 mg, 샘플 수 분에 의존에 대 한 허용 하는 3.2-4 m m 직경의 크기와로 터에 도입. 회전자 내부 샘플의 금액은 SSNMR 스펙트럼에서 신호 대 잡음 비율, 장거리 거리 지지대의 검색 및 그들의 명백한 할당에 대 한 결정적 요인에 직접 비례 합니다.

스펙트럼 해상도 순차 공명 할당 및 억제 컬렉션 중 중요 한 매개 변수. 최적의 결과 얻으려면 샘플 준비 매개 변수는 소 단위 및 어셈블리 조건 (pH, 버퍼, 진동, 온도, 등등)의 정화에 특히 최적화가 필요 합니다. 샘플 최적화는 여러 가지 조건에 대 한 어셈블리 관찰 되었습니다, 레이블이 없는 샘플 준비 하 고 1 D ¹H-¹³C CP 스펙트럼 (2.1 단계에서 설명) 각 준비 샘플에 기록 하는 것이 좋습니다. 스펙트럼 스펙트럼 분해능 및 분산 기반으로 최적의 조건을 확인할 수 있습니다 다른 준비 사이 비교를 제공 합니다.

SSNMR 데이터의 품질 강력 하 게 특히 편광 전송 단계에 NMR 인수 매개 변수 선택에 따라 달라 집니다. 높은 자기 분야 강점 (≥600 m h z ¹H 주파수)를 사용 하 여 높은 감도 및 스펙트럼 분해능, 고분자 단백질 어셈블리 같은 복잡 한 목표를 직면 하는 때 필요한 필수적 이다.

많은 경우에 제한 요소가 분석기 가용성 이다. 따라서, 준비를 샘플의 현명한 선택 분석기 세션을 앞에 해야 합니다. 어떤 경우에, 균일 하 게 ¹³C, ¹⁵에 N 표시 된 샘플은 순차적이 고 내부 잔류 공명 할당을 수행 하는 필수. 단백질 고체 NMR 기법에 의해 할당 된⁷¹참조. 적당 한 매스 주파수에서 고분자 어셈블리의 구조 결정 필요 선택적으로 ¹³C 표시 샘플; 장거리 ¹³C-¹³C와 ¹³C-¹⁵N 감지 주소록 샘플 기반 1, 3-¹³C-및 2-¹³C-gylcerol / 1-¹³C-및 2-는¹³C-포도 당 라벨 일반적으로 위에서 설명한 대로 사용. 두 가지 레이블 구조 사이 선택 스펙트럼 신호 대 잡음 비율 및 해상도 기반으로 합니다. 인트라넷 및 intermolecular 장거리 연락처 사이 구별, 혼합된 레이블 및 희석 샘플 효율적인 밝혀졌다.

즉, 원자 SSNMR 구조 연구를 위한 중요 한 단계는: (i)의 준비는 소 단위 및 어셈블리 최적화 될 필요가 우수한 샘플 수량 및 품질을 얻기 위해, (ii) 분석기 필드 강도 및 수집 매개 변수 될 필요가 선택 신중 하 게; (3) 선택적 라벨 전략 3 차원 구조 결정을 위해 요구 되 고 필요한 데이터의 데이터 품질 및 무료 데이터의 가용성에 따라 다릅니다.

막 단백질에서 homomultimeric 나노-개체에 이르기까지 supramolecular 시스템의 다양 한 범위에 그것의 적용에도 불구 하 고 SSNMR는 종종 mg-isotopically 분류 자료의 수량에 대 한 필요에 의해 제한 됩니다. 최근 기술 개발 ¹H 검출 NMR로 길을 열어 초고속 마스 (≥100 kHz) SSNMR 고 밀어 최소한의 샘플 수량 제한 하위 mg ^72,,7374. 그럼에도 불구 하 고, 상세한 구조 연구에 대 한 ¹³C 라는 샘플 불가결 SSNMR 조립 샘플에서 생체 외에서 또는 어디 셀에서 최소한의 매체에 생존 하는 유기 체에 표현 하는 시스템에 적용을 제한 하는 SSNMR (리뷰 ^75,,7677,78참조)을 위해 새로운 방법입니다.

고해상도 3D 구조를 가져올 SSNMR 응용에서 중요 한 요소는 스펙트럼 분해능: 어셈블리에 기본 구조적이 스펙트럼 해상도 스펙트럼 분석을 제한할 수 있습니다. 잔류물 특정 ¹³C 라벨 수 있습니다 어떤 경우에는 대안을 제공 (최근 예제 참조 ^79,80)에 대 한 구조 모델을 얻기 위해 전략적 잔류물에 특정 거리 정보를 가져옵니다.

3 차원 구조 결정을 위한 SSNMR 여전히 필요 합니다 종종 긴 데이터 수집 시간 방식과 시스템에 600-1000 MHz (¹H 주파수) 주 몇 일에 따라 정교한 악기에 여러 데이터 집합의 컬렉션을 분 광 계입니다. 따라서, 분석기 시간에 대 한 액세스-깊이 SSNMR 연구에 제한 요소를 수 있습니다.

^3,,5764,70, SSNMR에서에서와 같은 구조적 지지대의 높은 숫자를 식별 하기 위해 충분 한 품질의 SSNMR 데이터를 선도 하는 homomultimeric 단백질 어셈블리의 경우 여전히 액세스할 수 없는 미세한 크기에 있습니다. 따라서, homomultimeric 어셈블리의 de novo SSNMR 구조 결정에 그들 또는 길이 당 질량 (MPL) 데이터 이상적으로 보완 SSNMR 데이터를 대칭 매개 변수를 파생. 혼자 SSNMR 데이터는 원자 내부-및 intermolecular 인터페이스 제공

SSNMR는 높은 EM 또는 MPL 측정 등 구조 기술로 보완 하지만 데이터 또한 완벽 하 게 엑스레이 결정학 또는 솔루션 NMR 돌연변이 또는 잘린 소 단위에 의해 얻은 원자 구조와 결합 될 수 있다. 다른 구조적 데이터의 함께 고분자 어셈블리 (대표 예를 들어 그림 6 참조)의 원자 3D 모델을 결정 하기 위한 수 있다 문학에서 연구의 증가 수를 찾을 수 있습니다.

구조 생물학의 분야에서 연구를 유망 기술로 SSNMR 나온다원자 수준에서, 즉 제공 구조 데이터 원자 규모에서 불용 성 및 비 결정 어셈블리입니다. 이 점에서 SSNMR는 솔루션 NMR와 분자 어셈블리, 막 단백질 RNA 뿐만 아니라 바이러스 성 봉투, 세균성 필 라 멘 트 또는 amyloids, 그들의 기본 환경 및 단백질 어셈블리에 포함 하 여 x-선 결정학을 펜 던 트와 RNA-단백질 복합물 (참조 예:⁸¹). 그것의 매우 다양 한 응용 프로그램에 체 외에서 세포 맥락에서 2 차, 3 차 및 4 급 구조 변경 내용 추적 등 원자 규모 (예: ⁸²) 파트너 분자와 상호 작용 표면 식별 및 조립된 단지의 맥락에서 매핑 분자 역학 복잡 한 바이오 어셈블리에 미래 구조 연구에 SSNMR의 중요 한 잠재력을 나타냅니다.

구성 요소	M9 매체
NaCl	0.5 g/L
KH2포4	3 g/L
나2HPO4	6.7 g/L
MgSO4	1mm
ZnCl2	10 Μ M
FeCl3	1 Μ M
CaCl2	100 Μ M
MEM 비타민 믹스 100 X	10 mL/L
13 C-포도 당	2 g/L
15 NH4Cl	1 g/L

표 1: 재조합 단백질에 대 한 최소한의 표현 매체의 구성 에서 생산 대장균 BL21 셀.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
NMR 분광계 (> 11.7 Tesla)	Bruker-triple
resonance MAS SSNMR 프로브 헤드	Bruker-SSNMR
로터 4mm	Bruker	K1910
원심분리기 5804 R	Eppendorf	5805000629
GeneQuant 1300 분광계	Dutscher	28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L	Dutscher	228001
MaxQ 4450 벤치탑 오비탈 쉐이커	Dutscher	78376
튜브 리볼버 교반기	Dutscher	79547
sonopuls HD 3100	Bandelin	3680
MicroPulser electroporator	Biorad	165-2100
mini-PROTEAN 테트라 셀 시스템	Biorad	165-8000
AKTA 순수 시스템	GE Healthcare	29-0182-24
캐필러리 마이크로맨 M25 피펫	Gilson	F148502
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>Materials
amiconR ultra-15	sigma	Z740199-8EA
모세관 및 피스톤	Gilson
주걱	Fisher	13263799
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Reagents
D-glucose 13C6	시그마	389374
암모늄-15N-클로라이드	시그마	299251
1,3 13C2 글리세롤	시그마	492639
2 13C 글리세롤	시그마	489484
카나마이신	시그마	K1876
카르베니실린	시그마	C3416
인산나트륨 이염기성	시그마	S7907
인산칼륨 일염기	시그마	P5655
염화나트륨	시그마	71380
염화칼슘	시그마	C1016
황산마그네슘	시그마	208094
염화철	시그마	157740
염화아연	시그마	793523
MEM 비타민 용액 (100×)	시그마	M68954
IPTG	피셔	BP1755
트리즈마 베이스	Sigma	T1503
Tricine	Sigma	T0377
SDS	Sigma	436143
아지드 나트륨	시그마	71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid	Sigma	178837
Name	Company	>카탈로그 번호	Comments
Softwares
Unicorn 6.3	GE Healthcare		Akta systems
ccpNMR	CCPN		분광계 시스템