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방법 논문

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

15.7K 조회수

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DOI:

10.3791/55785

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2017년 7월 5일

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1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

이 논문에서

요약

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

초록

신경 퇴행성 질환은 종종 영향을받는 사람들에게 치명적인 영향을 미칩니다. 망막 신경절 세포 (RGC)의 소실은 정상적인 노화뿐만 아니라 당뇨 망막 병증 및 녹내장을 비롯한 여러 질병에 영향을 미친다. RGC의 중요성에도 불구하고 RGC는 지금까지 부분적으로 망막의 다양한 세포 중 일부만으로 구성되어 있기 때문에 지금까지 연구하기가 극도로 어려웠습니다. 또한, 현재의 분리 방법은 세포 내 마커를 사용하여 비 생존 세포를 생성하는 RGC를 확인합니다. 또한 이러한 기술에는 긴 격리 프로토콜이 필요하므로 RGC를 얻고 분리하기위한 실용적이고 표준화 된 신뢰할 수있는 방법이 부족합니다. 이 연구는 양성 및 음성 선택 기준 모두에 근거한 프로토콜을 사용하여 생쥐 망막에서 주요 RGC를 분리하는 효율적이고 포괄적이며 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 장래의 RGC에 대한 연구를 허용하며,신경 퇴행성 질환에서 기능성 RGC의 손실로 인한 시력 감소.

서론

RGC는 말단 분화 된 뉴런이므로 일차 세포가 실험에 필요합니다. 일차 생쥐 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리 및 농축을위한 프로토콜의 개발은 시험 관내에서 RGC 건강 및 변성의 기전을 밝히는 데있어 기본적이다. 이것은 RGC 기능을 촉진하고 사망을 최소화 할 수있는 잠재적 인 치료법을 개발하려는 연구에 특히 중요합니다. RGC의 퇴행은 녹내장, 당뇨 망막 병증 및 정상 노화와 같은 망막 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. RGC 소실의 원인이되는 특정 세포 기전이 불분명하지만 일련의 위험 요소가 확인되었습니다. 시신경 머리 1 , 2 , 3 에서 산소가 부족하면 RGC가 사망하고 4 , 흥분제와 i의 활성화 사이의 항상성의 교란으로 작용합니다개별 RGC 5,6 내의 억제 수용체. 일련의 과제는 심층 연구를 위해 이러한 세포의 사용에 대한 진전을 방해합니다. 첫째, 쥐 망막에 존재하는 RGC의 수가 적습니다. RGCs는 총 망막 세포 7 , 8 , 9 의 1 % 미만을 차지합니다. 둘째, 대부분의 RGC 특이적인 마커는 세포 내 단백질 10 , 11 , 12 입니다. 이러한 마커를 기반으로 한 선택은 세포를 비 생존 가능 상태로 남겨 두어 다운 스트림 기능 분석을 배제합니다. 마지막으로, 현재 사용 가능한 프로토콜은 길고 표준화가 부족합니다 13 , 14 . 조기 RGC 격리 프로토콜은 면역 주사 방법에 기반을 두었습니다. Barres et al. 15 명 고전적인 면역 반응을 적응시켰다.anning 기술을 사용하여 세포 표면 마커 인 항 - 흉선 세포 항원 (Thy1)에 면역 반응을 일으키는 양성 선별 이전에 망막 세포에서 단구 및 내피 세포를 배제한 두 번째 단계를 추가했다. 몇 년 후, 홍 외 ( Hong et al. 셀 구분 전략과 결합 된 자기 비드 분리 기술을 통해 고순도의 RGCs를 분리합니다. 자성 비드의 사용은 여전히 ​​많은 과학적 응용 분야에서 사용되고 있습니다. 함께, 자기 구슬 및 유동 세포 계측법 프로토콜은 분리 된 세포의 순도를 향상시켰다. 그러나, 이러한 정제 시스템은 해리 된 망막으로부터 쥐 RGC를 단리하기 위해 아직 표준화되지 않았다.

유동 세포 계측법은 세포 현탁액의 광학 및 형광 특성을 측정하는 강력한 분석 방법입니다. 세포는 높은 수준의 감도로 정량적으로 및 질적으로 분석되어 세포 집단에 대한 다차원 분석을 제공한다ation. 세포 분별은 두 가지 주요 물리적 특성, 즉 세포 크기 또는 표면적 및 입상 성 또는 내부 복잡성에 기초합니다. 유사한 여기 파장 및 상이한 방출을 갖는 형광색으로 표지 된 항체를 조합함으로써 다차원 분석을 수행 할 수있다. 유세포 분석은 빠르고, 재현성 있고, 민감합니다. Multitpe 레이저는 유동 세포 계측법에 의한 단일 세포의 다차원 분석을 훨씬 더 허용합니다. 따라서, 그것은 세포 표본의 연구를위한 매력적인 방법론입니다. Fluorescence activated cell sorting (FACS)은 유동 세포 계측법으로 확인 된 다차원 적 표현형 차이를 이용하여 개개의 세포를 별개의 하위 집단으로 분류합니다.

지난 10 년 동안 다중 표면 및 세포 내 단백질이 뉴런을 포함한 세포 선택을위한 잠재적 바이오 마커로 확인되었습니다. 쥐에서 RGC를 분리하려고했던 초기 연구는 Thy1을 신경절 세포로 사용했습니다마커. 불행히도 Thy1은 CD90으로, 다른 설치류 종 18 , 19 , 20에 여러 개의 isoform을 가지고 있으며 여러 망막 세포 유형 19 , 20에 의해 발현되어 RGC의 비 특이성 마커가됩니다. 또 다른 표면 마커 인 CD48은 대 식세포와 소교암을 포함하여 망막의 단핵 세포 집단에서 발견됩니다. 이 두 가지 표면 마커를 사용하여 변형 된 RGC 시그니처 Thy1 + 및 CD48 네거티브 세포가 개발되었습니다 ( 15 , 16 , 21 , 22) . 불행하게도,이 두 가지 선택 기준은 고도로 농축 된 RGC 개체군을 선택하기에 충분하지 않습니다. 이러한 충족되지 못한 요구를 해결하기 위해 다층 양성 및 음성 선택 기준에 기반한 유동 세포 계측 프로토콜이 개발되었습니다1 차 쥐 RGC를 풍부하게하고 정제하기 위해 알려진 세포 표면 마커.

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프로토콜

다음 프로토콜에 자세히 설명 된 모든 절차는 테네시 보건 과학 센터 (UTHSC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 검토위원회의 승인을 얻었으며 사용을위한 안과 및 안과 연구 협회 (ARVO) 실험실 동물 실험 지침 (Laboratory Animal Resources, 실험실 동물의 인간애 보살핌 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책)에 추가하여 안과 및 시각 연구 동물을 대상으로합니다.

1. 도구, 솔루션 및 미디어 준비

주 : 프로토콜에보고 된 재료, 시약, 도구 및 도구에 관한 모든 정보는 재료 표에 명시되어 있습니다.

  1. 모든 해부기구를 오토 클레이브하고 멸균 지역에 보관하십시오. 다음 악기를 사용하십시오 : 표준 포셉 4 개 (길고 짧음 2 개)와 가위 2 개,해부학을위한 2 개의 포셉 (1 개의 길이와 1 개의 짧은)과 1 개의 가위뿐만 아니라. 여분의 세트를 백업으로 보관하십시오.
  2. 세척, immunolabeling 절차 및 셀 정렬 단계 동안 사용할 멸균 PBS / 1 % FBS 솔루션 100 ML을 준비합니다. 4 ° C에서 용액을 식힌다.
    참고 : 나트륨 아자 이드 (NaN 3 )를 용액에 첨가하지 마십시오. 살아있는 세포에 독성을 나타낼 수 있습니다.
    1. 99 ML의 PBS와 1 ML의 FBS와 PBS / 1 % FBS 100 ML을 준비합니다.
  3. 수집 및 배양 매체로 사용하기 위해 3 % FBS ( 재료 표 참조)가 보충 된 무균 신경 세포 배지 100 ML을 준비합니다. 4 ° C에서 세포 배양 매체를 무균 상태로 유지하십시오. 사용하기 전에 실내 온도 (RT)로만 따뜻하게하십시오.
    1. 신경 세포 배양액 97 mL와 FBS 3 mL를 사용하여 3 % FBS가 보충 된 100 mL의 신경 세포 배지를 준비한다.
  4. pre-chill 채취 튜브 (15 mL 튜브) 5 mL의 수집 매체로 미리 코팅얼음 양동이에 헴. 세포가 튜브 표면에 달라 붙지 않도록 폴리 프로필렌 튜브 만 사용하십시오.
  5. 바이오 안전성 캐비닛에 40mm 접시, 70μm 나일론 스트레이너, 주사기, 셀 스트레이너 용 펠렛, 멸균 폴리 프로필렌 튜브를 놓으십시오. 절차 전 모든 항목을 소독하고 절차 전반에 걸쳐 살균 방식으로 유지하십시오.
    참고 : 망막 채취 후 모든 단계는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행됩니다.

2. 핵 제거

참고 : 표현형 CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg로 1.0 × 10 6 RGC를 분리하기 위해 총 10 명의 어린 (5-7 주 된) C57BL / 6J 마우스를이 실험에 사용했습니다.

  1. 자궁 경부 탈구 후 CO2 흡입을 사용하여 마우스를 안락사. 안락사를 마친 동물이 죽었는지 확인하기 위해 항상 2 차 안락사 방법을 사용하십시오.
    참고 : 이산화탄소의 대안으로 이소 플루오 란을 사용할 수 있습니다. Ketamine은 마취 유도제로 사용되는 경우 안압 상승 (IOP)의 증가와 관련되어 있으므로 권장하지 않습니다 ( 24 , 25) .
  2. 눈의 글로브 아래에 집게를 삽입하고, 시신경을 잡고 위로 당깁니다. 지구는 핵을 완전히 제거하고 시신경을 손상시키지 않습니다. 수집 한 눈을 PBS가 들어있는 유리 병에 넣고 다음 단계까지 얼음 위에 보관하십시오.
    참고 : 모든 직원은 실험실 동물 관리 단위 (LACU)로부터 적절한 훈련을받은 후에이 단계를 수행 할 수 있습니다.

3. 망막 세포 현탁액의 제조

  1. 각막 절개를 시작하기 위해 해부 현미경의 기본 판에 수집 된 눈을 놓습니다. 각 눈을 개별적으로 해부하십시오.
  2. 신중하게 포셉을 사용하여 시신경 기지에서 글로브를 개최. 이 단계에서는 1 개의 lon을 사용하십시오.g, 하나의 짧은 표준 포셉.
  3. 30 게이지 (30G)의 날카로운 바늘을 사용하여 각막을 뚫고 방수 유액이 눈에서 빠져 나와 포셉으로 눈을 쉽게 잡을 수있게합니다.
  4. 집게로 각막을 잡고 가위로 각막 절개를하십시오. 부드럽게 포 셉를 사용하여 각막과 공막을 껍질. 글로브가 중간에 벗겨지면 포셉을 사용하여 망막과 렌즈를 굴립니다. 각막, 공막 및 렌즈를 폐기하십시오.
    참고 : 이 방법은 망막이 나머지 눈에서 완전히 분리되도록합니다.
  5. PBS / 1 % FBS가 들어있는 작은 40mm 페트리 접시에 망막을 놓습니다.
    참고 : 페트리 접시의 대안으로, 세포 배양 접시를 사용할 수 있습니다. 생리 조건 에서처럼 항상 망막을 촉촉하게 유지하십시오.
    1. biosafety 캐비닛 내에서 신선한 멸균 PBS / 1 % FBS로 각 망막 세 번 씻으십시오.
  6. 12 개의 망막을 위에 올려 놓으십시오.PBS / 1 % FBS로 축축한 멸균 된 70-μm 나일론 여과기. 10mL 주사기의 백 엔드를 사용하여 세포를 분리하기 위해 원형 운동을 사용하여 망막을 조심스럽게 침강시킵니다.
    1. 양자 택일로, 세포 스트레이너 maceration을위한 유봉을 사용하거나 15 IU / ML 파파인, 5 MM L - 시스테인, 그리고 PBS와 함께 비활성화에 따라 37 ° C에서 15 분 200 U / mL DNase I의 조합으로 효소 소화를 사용합니다 / 10 % FBS.
      참고 : 효소 소화가 주사기의 뒤끝 또는 유봉과 함께 침용과 비교되었을 때 회수 된 세포의 백분율 변화는 관찰되지 않았다.
  7. 격리 된 세포를 옮기려면 멸균 70 μm 나일론 스트레이너를 폴리 프로필렌 수집 관 위에 올려 놓습니다. 수집 한 세포를 P1000 피펫을 사용하여 여과기를 통과시킵니다. PBS / 1 % FBS로 스트레이너 ( 단계 3.6 )를 헹구어 나머지 세포를 방출하고 수집 튜브로 옮깁니다.
  8. Ach에 PBS / 1 % FBS 첨가즉, 망막 당 1 mL의 최종 부피. 200 XG와 RT에서 7 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.
    참고 : macerated retinae (<6 retinae)의 수에 따라 세포 펠렛이 너무 작아서 보이지 않을 수 있습니다.
    1. 세포 상청액을 버리고 5 retinae 당 1 ML의 비율을 사용하여 PBS / 1 % FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend.
  9. hemocytometer를 사용하여 세포를 계산합니다.
    1. 70 % 알콜로 유리 hemocytometer 및 coverslip을 청소하십시오. 부드럽게 망막 세포 현탁액이 균등하게 배포되도록 세포가 들어있는 튜브를 소용돌이 친다. microcentrifuge 튜브에 0.4 % trypan 파란색의 장소 20 μL 및 세포 현탁액의 20 μL와 섞는다.
    2. 부드럽게 혼합하고 hemocytometer에 0.4 % trypan 블루 / 세포 현탁액 믹스 10 μL를 적용하여 두 챔버를 채 웁니다; 모세관 작용은 coverslip 아래 0.4 % trypan 블루 / 세포 현탁액 믹스를 그릴 것입니다. 현미경을 사용하여 모든 트리 판 블루 - 네가티브 세포를 센다; 티s 숫자는 살아있는 세포를 나타냅니다.
    3. 다음 공식을 사용하여 세포 생존력을 결정합니다 : 생존 세포 수 / 총 세포 수 = 생존력 %.
      참고 : 세포의 생존 가능성이 95 % 미만인 경우, FACS 동안 세포 생존력 차별을위한 형광 염료의 사용이 필요합니다.
  10. 살아있는 세포에 비 투과성 인 형광성 생존 염료를 사용하십시오. 혈청을 제거하기 위해 PBS로 세포를 씻으십시오. 100 μL의 최종 부피에서 5.0 x 10 6 세포 당 세포 생존력 차별을위한 형광 염료 1 μL를 첨가하십시오. 빛으로부터 보호 된 15 분 동안 RT에서 인큐베이션하십시오. PBS / 1 % FBS의 10 배 부피를 추가하십시오. 200 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리기.
  11. 필요한 경우 4에서 밤새 세포 현탁액을 품어. 이것이 완료되면 PBS / 1 % FBS보다는 신경 세포 매체로 세포 현탁 관을 채 웁니다. 튜브를 수평으로 놓고 4 ° C에 유지하십시오.

4. 면역 표지순화 세포

  1. 다음과 같은 변환을 사용하여 세포 번호 당 항체의 양을 결정하십시오 : 100 μL 부피의 5.0 x 106 세포 당 항체 2 μL.
  2. 세포를 씻고 PBS / 1 % FBS에서 그들을 유지. 소량의 세포 (5.0 x 10 6 세포)를 소트 (sort) 설정시 음성 대조군 (표지되지 않음)으로 사용하십시오.
    참고 : 이 음의 제어는 셀 분류기의 올바른 교정에 중요합니다.
  3. Fcγ 수용체 II 및 III을 발현하는 세포에 대한 항체의 비특이적 결합을 최소화하기 위해, PBS / 1 % NaHCO3를 사용하여 50 μL 최종 부피에서 1.0 x 106 세포 당 항 마우스 CD16 / 32 항체 1 μL를 첨가한다. FBS. RT에서 10 분 동안 품어 낸다.
  4. 샘플에 항체 칵테일을 첨가하고 pipetting하여 부드럽게 섞는다. 얼음 통에서 30 분 동안 품어 낸다. 빛이 태그 fluoro의 photobleaching으로 인해 실험을 손상 수 있으므로 얼음 통이 덮여 있는지 확인하십시오phores.
    1. 형광 표지 된 항 마우스 항체 인 CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE 및 표지되지 않은 CD57을 사용하여 항체 칵테일을 준비한다.
      참고 : 각 항체에 대해 5.0 x 10 6 세포 당 다음과 같은 농도를 사용하십시오 : CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE- 시아닌 -7, 0.4 μg; CD15 PE, 0.02 μg; 및 표지되지 않은 CD57, 0.4 μg.
      1. 다음 계산에 따라 용적을 사용하십시오 ( 물질 표에 나열된 상업적으로 이용 가능한 항체를 기준으로 함) : 총 5.0 x 10 7 개의 세포를 표지 할 것; 5.0 x 106 세포 당 2 μL = 각 항체 20 μL; 4 가지 항체 = 80 μL의 항체 칵테일; 최종 부피 = [(5.0 x 107 총 세포) /5.0 x 106 세포] × 100 = 1,000 μL; 80 μL Abs + 50 μL anti-mouse CD16 / 32 + 870 μL PBS / 1 % FBS = 1,000 μL.
        참고 : 이 조합은장비 구성을위한 형광색의 최적 조합. 다음 매개 변수는 방출 및 여기를 요약합니다. AF-700, 638nm 빨간색 다이오드 레이저로 여기하면 719nm 방출, PE-Cyanine7, 488 nm 청색 다이오드 레이저로 여기 시켰을 때 767 nm의 방출; 및 PE, 488nm 청색 다이오드 레이저로 여기 될 때 575nm의 방출.
  5. 30 분 배양 후, PBS / 1 % FBS를 사용하여 5 mL까지 부피를 가져온다. 샘플을 200 xg 및 RT에서 7 분간 원심 분리하여 씻으십시오. 모든 언 바운드 항체를 제거하려면이 절차를 한 번 반복하십시오.
  6. 2 차 항체 (0.1 μg) 2 μL를 첨가하면 5.0 x 10 6 세포의 CD57에 결합합니다. 4.4 와 같이 얼음 양동이에 30 분 동안 품어 둔다. 4.5 단계 에서와 같이 세포를 두 번 세척하십시오.
    1. 단계 4.4 에서 태그가 지정되지 않은 기본 항체가 사용 된 경우 세포에 2 차 항체를 표시합니다.
      참고 : 두 번째이 구성에 적합한 항체는 Table of Materials에 나와 있습니다 . 421 nm의 방출 파장을 갖는다. 405nm에서 바이올렛 다이오드 레이저로 여기하면 450/50 nm의 밴드 패스 필터와 함께 사용하십시오.
    2. 다음 계산에 따라 용적을 사용하십시오 ( 물질 표에 나열된 시판중인 항체를 기준으로 함). 5.0 x 106 세포 당 2 μL = 2 차 항체 20 μL; 최종 부피 = [(5.0 x 107 총 세포) /5.0 x 106 세포] x50 = 500 μL; 20 μL의 Abs + 480 μL PBS / 1 % FBS = 500 μL.
  7. PBS / 1 % FBS에 표시 세포를 유지. hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 3.0 ~ 4.0 x 107 세포 / mL의 최종 망막 세포 농도를 사용하십시오.
    참고 : 페놀 레드가자가 형광을 증가시킬 수 있으므로 세포 배양 배지를 사용하여 세포를 희석하지 마십시오 .ive와 긍정적 인 세포. 체적 당 최종 세포 농도는 기기 구성의 체적 유량에 따라 크게 달라집니다.
  8. 형광 유출을 최소화하기 위해 설정 중에 단색 컨트롤을 사용하십시오.
    참고 : 보정이라고도하는이 단계는 형광체 조합으로 생성 된 노이즈를 보정하는 데 적용됩니다. PBS / 0.1 % BSA / 2 mM NaN 3의 폴리스티렌 미립구는 여러 종의 형광 태그가 붙은 면역 글로불린 (Ig) 아이소 타입을 결합 할 수있는 능력을 가지고있어 보상을 설정할 수있는 긍정적 인 컨트롤을 제공합니다.
    1. fluoropore 당 하나를 할당 멸균 FACS 튜브에 폴리스티렌 microspheres 3 방울을 놓으십시오. 각 튜브에 각 fluorophore 1 μg을 추가합니다. 빛으로부터 보호, RT에서 15 분 동안 품어. 샘플 튜브에 PBS / 1 % FBS 3 ML을 추가합니다. 200 XG 및 RT에서 5 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 상등액을 제거하고 PBS / 1 % FBS 250 μL로 resuspend.
    2. 부정적인 제어를 설정하려면Ig에 결합하지 않는 폴리스티렌 마이크로 스피어를 사용하십시오. 필요한 경우 전날이 단계를 수행하십시오.

5. 셀 정렬 전략

참고 : 355 nm, FACS를위한 계측기 설정을위한 구체적인 지침; 405 nm, 보라색; 488 nm, 청색; 2, 5, 및 3 형광 채널 분포를 갖는 640nm, 적색 레이저를 포함한다. 운영 소프트웨어는 DIVA 버전 8.0.1입니다. 셀 정렬은 70μm 노즐, 70 psi 외장 압력, 87.5 주파수, 48.6 진폭, 333에서의 첫 번째 드롭 브레이크 오프, 6의 갭 어셋 (tap asetting), 정렬 정밀도를 기본 순도 마스크 (32 순도 마스크로 4 방향 순도로 설정) 및 드롭 구슬을 사용하여 지연 시간을 42.98로 조정.

  1. 15 mL 폴리 프로필렌 원뿔 튜브를 수집 용기로 사용하십시오. 각 튜브에 수집 매체 (세포 배양 배지) 5 ML을 추가하고 벽을 코팅 튜브를 회전.
    참고 : 이 단계는 세포가 t의 측면에 달라 붙는 것을 방지합니다.그 수집 튜브. 대안으로, 튜브는 희석되지 않은 FBS로 코팅 될 수 있습니다.
  2. 셀 분류기의 효율을 고려하여 최종 세포 수확량을 계산하십시오.
    참고 : 정렬 효율은 사용 된 유동 세포 계측기에 따라 다릅니다. CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg 표현형을 갖는 RGC는 모든 망막 세포의 약 1 %를 구성한다.
  3. 숙련 된 운영자가 셀 정렬을 수행하도록합니다 (일반적으로 핵심 시설에서). 장비를 세척하기 전에 70 % 에탄올로 세척하고 멸균해야합니다. 조심스럽게 70 % 에탄올로 수집 튜브의 외부를 닦으십시오.
  4. 세포가 침전되거나 응집 된 경우 세포를 위아래로 피펫 팅하고 획득하기 전에 살균 40 μm 나일론 여과기를 통해 현탁액을 여과하십시오. 세포 분류가 수행되는 동안 온도를 조절하고 4 ° C에서 유지하십시오. 이렇게하지 않으면 셀을 줄일 수 있습니다.l 항복.
  5. 실험을 수행하기 전에 세포 분류 작업자와 함께 그 종류의 세부 사항을 토론하십시오.
    참고 : 실험시 셀 분류기 운영자는 cytometer 수집 소프트웨어의 작업 공간 도구 모음에서 일련의 버튼을 클릭합니다. 이것들은 Browser , Cytometer , Inspector , Worksheet , Acquisition Dashboard 입니다. 여기에 사용 된 셀 정렬 전략은 2-way 정렬이라고합니다. 농축 된 RGC와 다른 모든 세포 유형의 두 가지 집단이 수집됩니다. 추가 모집단을 모으는 경우, 최대 2 개의 모집단을 4-way 소트로 분리 할 수 ​​있습니다. 추가 인구가 수집되는 경우, 세포 분류기는 다른 수집 튜브 및 설치가 필요합니다.
  6. fluorophores에서 스펙트럼 중복에 대한 수정 보상을 수행합니다.
    참고 : 이 프로세스는 조정을 통해 수동으로 수행 할 수 있습니다.각 설정을 사용하거나 사용중인 소프트웨어의 일부로 자동으로 수행 할 수 있습니다. 세포 선별 장비를위한 대부분의 소프트웨어에는 자동 보정 옵션이 있습니다. 그것은 금 표준이며 보상의 가장 정확한 유형으로 간주됩니다. 실험에 사용 된 모든 관련 단일 클론 항체를 바인딩하기 위해 특별히 제조 된 폴리스티렌 미세 구 (보상 비드)로 제조 된 음성 (형광 물질 없음) 샘플 및 단일 대조 물을이 단계에서 사용할 것이다.
    1. 실험> 보상 설정> 보상 컨트롤 만들기를 선택하십시오. 화면에 표시된 목록에서 형광 단 특정 컨트롤을 추가하십시오. 확인을 클릭하십시오.
      참고 : 각 컨트롤에 대한 보정 튜브가 표시됩니다.
      1. 전방 산란광 (FSC), 측면 산란광 (SSC) 및 초기 모집단 (P1)을 확인하기 위해 표지되지 않은 대조군 (형광 물질 없음, 단계 4.2 )을 사용하십시오.
    2. cytometer에 부정적인 제어 튜브를 설치하고로드를 클릭하십시오. 관심 인구가 표시되는지 확인하고 선택하십시오. 인구 1 (P1)입니다. P1 게이트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 보상 컨트롤에 적용을 선택 하십시오 . 데이터 레코드를 클릭하십시오. 녹음이 끝나면 Unload를 클릭하고 튜브를 제거합니다.
    3. 화면에 표시된대로 cytometer에 다음 튜브를 설치합니다. 컨트롤의 모든 데이터가 기록 될 때까지 5.6.2 단계를 반복 합니다 .
    4. 실험> 보상 설정> 보상 계산을 선택하십시오. 설정을 저장하고 실험 이름을 지정하십시오. 링크 및 저장을 클릭 하십시오 .
      참고 : 보정은 감지기 사이의 스펙트럼 겹침을 제거하므로 필수 단계입니다.
    5. 수동 보상이 필요한 경우, 양의 신호의 수단을 조정하여 eac의 음화와 같도록 조정하십시오h의 형광 색소를 사용했다.
      참고 : 이 단계는 셀 분류기 작업으로 수행되며 30 분이 소요될 수 있습니다.
  7. 게이팅 전략 ( 그림 3A ).
    1. FSC 대 SSC를 플로팅하여 P1을 설정하십시오. FSC는 크기를 나타내고 SSC는 세포의 내부 복잡성을 나타냅니다. 그림 3A 참조.
    2. 단계 5.7.1 (P1)에서 선택된 모집단을 사용하여 SSC-H (높이) 대 SSC-W (폭)의 의사 색자를 그립니다. 의사 컬러 플롯은 서로에 대한 셀의 밀도의 시각적 표현을 허용합니다.
      참고 : 낮은 셀 밀도는 파란색과 녹색으로 표시되는 반면 빨간색과 오렌지 영역은 높은 셀 밀도를 나타냅니다.
      1. 단일 셀만 수집하려면이 단계를 수행하십시오. 단일 셀 게이트는 P2라고 불린다. 그림 3A 참조.
    3. 5.7.2 단계를 반복하십시오.P2를 사용하여 FSC-H 대 FSC-W를 플롯합니다. "이중 첩 (doublets)"또는 세포 덩어리 (clump)로서의 단일 세포의 선택이 양성 및 음성 양성 마커를 모두 포함하여 거짓된 양성을 제공하는지 확인하십시오.
    4. CD90.2 대 CD48의 의사 컬러 플롯을 그립니다. RGC 농축에서 단핵 세포를 제거하기 위해 모든 CD90.2 + CD48 neg 세포를 선택하십시오; 이 게이트를 CD90.2 + CD48 neg 또는 P3이라고 부르십시오. 그림 3A 참조.
    5. 선택된 CD90.2 + CD48 neg population 또는 P3 gate를 사용하여 CD57 대 CD15의 pseudocolor 작도를 그려 RGC 농축에서 무 축삭 세포 오염 물질을 제거합니다. CD15 neg CD15 neg 모집단을 문지릅니다. 그림 3A 참조.
  8. "정렬 레이아웃"창에서 샘플에 대해 수집 할 모집단을 정의하고 셀 정렬을 진행하십시오. 수집 할 샘플은 CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg이다. p>.
    참고 : 정렬 할 모집단은 정렬 창의 드롭 다운 추가 메뉴에서 선택됩니다. 모집단을 추가 한 후에는 대상 이벤트 또는 수집 할 이벤트 수를 묻습니다. 채우기가 포함 된 정렬 위치 필드를 클릭하여 언제든지 정렬 레이아웃을 편집 할 수 있습니다. 표현형 CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg를 갖는 RGC의 0.9 % ± 0.3은 어린 (5-7 주령) 및 0.5 % ± 0.3 및 구형 (> 12 개월령) C57BL / 6J 마우스에서 얻는다.
  9. 25,000 개의 세포를 사용하여 순도 점검을 수행하십시오 23 . 그림 3B -E를 참조하십시오.
    참고 : 순도 검사는 정렬 된 셀을 다시 분석하여 셀 정렬의 정확성을 확인하는 프로세스입니다. 정렬 된 세포의 작은 분취 량을 분류의 유효성을 확인하기 위해 cytometer에 적재합니다.
_title "> 6. RGC 세포 내 마커 확인

  1. 세포 내 라벨링.
    1. 1 시간 동안 분류 된 세포를 고정시키고 4 ° C에서 투과성으로하여 세포를 대사 적으로 비활성으로 만들고 세포 내 항체의 침투를 허용합니다.
    2. permeabilization 솔루션에서 다음 항체를 희석하십시오 : 100 μg / mL 주식에서 1 : 100 희석에서 다중 스 플라이 싱 (RBPMS)이있는 항 -RNA 결합 단백질; 항 syncyin 감마 (SNCG), 1 mg / ml 주식에서 1 : 100; 두뇌 특유의 homeobox / POU 도메인 단백질 3A (BRN3A), 200 μg / ML 주식에서 1 : 100; 및 1mg / mL의 주식에서 1 : 100의 anti-neuron 특이적인 class III beta tubulin (TUJ1)을 포함한다. 뚜껑을 덮은 얼음 통에서 1 시간 동안 세포와 항체 용액을 부화시킵니다.
    3. PBS / 1 % FBS로 두 번 샘플을 씻으십시오.
    4. 얼음 양동이에 30 분 동안 1 : 200 희석하여 적절한 AF488 - 태그 보조 항체의 세포를 Resuspend.
    5. 6.1.3 단계 와 같이 샘플을 씻으십시오 . 세포를 안으로 넣어 둬라.PBS / 1 % FBS (250 μL)로 분석 할 때까지.

7. qPCR 분석을 통한 셀 정렬 검증

참고 : 그림 4를 참조하십시오.

  1. RNA 추출 23 .
    1. 세포 용해 및 균질화에 의해 5.0 × 10 5 정렬 된 세포에서 RNA를 추출하고 클로로포름을 첨가한다.
    2. 무색상의 상층 액을 깨끗한 마이크로 튜브로 옮겨 알코올 침전시킨 다음 스핀 컬럼에서 농축액을 추출한다. 컬럼에서 DNAse 분해를 수행하십시오.
    3. RNA를 추출하기 위해 RNase가없는 물로 컬럼을 씻는다.
    4. 분광 광도계로 RNA 농도를 평가하십시오.
  2. cDNA 합성 및 사전 증폭.
    1. 100 ng의 RNA 물질을 사용하고 역전사 효소, 재조합 ribonuclease 억제제 (RNA 분해를 피하기 위해), 염화 마그네슘 (MgC2 ), 및 deoxynucleotides.
    2. 튜브 내용물을 혼합하고 25 ° C에서 10 분간 품어 42 ° C에서 60 분간 기다립니다. 85 ° C에서 5 분 보육과 반응을 마칩니다. 사용할 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 결과 cDNA를 저장하십시오.
      참고 : cDNA 물질은 전 증폭 단계를 즉시 수행 할 수없는 경우 최대 한 달 동안 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
  3. cDNA의 사전 증폭.
    1. 무수정 망막 세포, 무 축삭 세포, 성상 세포, 뮐러, 양극성, 수평, 광 수용체 및 망막 색소 상피 세포를 포함한 여러 망막 세포 유형에 특이적인 일련의 프라이머를 사용하여 cDNA 물질을 미리 증폭한다 (참고 문헌 23 및 표 2 참조). 자료 .
      참고 : 전 증폭 반응은 정량을위한 검출 민감도를 높이기 위해 준비됩니다. 전 - 증폭 반응은 프라이머재료 표 에서 믹스; 100 ng의 RNA에서 시작된 2.5 μL의 cDNA; 역전사 효소; 및 10 μL의 최종 부피의 핵산 분해 효소가없는 물.
    2. 95 ° C에서 10 분간 효소 활성화 단계를 수행 한 다음 95 ° C에서 15 초간 14 번 반복하고 60 ° C에서 4 분간 지속하십시오. 미리 증폭 된 물질을 Tris EDTA 완충액에서 1:10으로 희석하고 사용할 준비가 될 때까지 -20 ° C에 보관하십시오.
  4. 7.4 qPCR 반응.
    1. 희석되고 사전 증폭 된 cDNA (2.5 μL), 프라이머 ( 재료 표에 나와 있음), nuclease-free water 및 DNA 중합 효소 및 deoxynucleotides가 포함 된 농축액을 사용하여 10 μL 최종 부피의 모든 qPCR 반응을 준비하십시오.
    2. 다음 기기 조건을 사용하여 qPCR을 실행하십시오 : 50 ° C에서 2 분간 유지 단계, 95 ° C에서 10 분간 유지 단계. 95 ° C에서 15 초 동안 총 40 회,이어서 60 ° C에서 1 분 동안 실행하십시오. 모든 measur 수행ements는 3의 복제본입니다.
    3. 하우스 키핑 유전자와 각 표본의 표적 유전자에 대한 C T 값을 결정한 후 비교 임계치 (C T )를 사용하여 상대적인 정량화를 수행하십시오. 다음 방정식을 사용하여 상대 배수 변화 (R q )를 계산하십시오. R Q = 2 T -ΔC , 여기서 ΔC T = C T 표적 유전자 -C T 참고 유전자 23 .
      참고 : C T 는 리포터 염료의 형광 신호가 임의로 배치 된 임계 값을 교차하는 PCR 사이클로 정의됩니다. C T 는 반응에서의 앰플 리콘 (PCR 생성물)의 양에 반비례한다.

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결과

RGC에 대한 심층적 인 연구는 저주파수와 격리를위한 강력하고 표준화 된 방법론의 부족을 비롯한 여러 요인으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 그림 1 은 망막 격리에 사용 된 방법을 보여줍니다. 탈핵 절차의 변형은 탈핵이 생체 실험 27의 일부인 경우와 같은 분석 유형을 기반으로합니다. 이 프로토콜에서 핵 제거는 안락사 마우스에서 수행됩니다. 그림 1A - B 에서 볼 수 있듯이, 겸자는 눈 아래에 배치하고 최소한의 출혈을 일으키고 손상되지 않은 시신경을 가진 안구를 제거하기 위해 위로 잡아 당깁니다.

다른 마우스 쥐에서 RGC의 수에 차이가 있으며, 특히...

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토론

FACS는 세포 집단을 정제하는 기술입니다. 다른 단리 방법으로는 면역 주사, 자성 비드 및 보체 고정 고갈이 있습니다. 이러한 다른 방법론에 비해 FACS의 장점은 다양한 강도의 강도를 가진 세포 표면 마커의 동시 식별에 기반합니다. 분자의 형광 강도는 단백질 발현 양에 비례합니다. 지금까지 RGC의 분리는 사용 된 격리 방법에 관계없이 Thy1 (CD90) 양성 및 CD48 음성성 15 , 16 , 22 , 34 에 단독으로 기초를 두었습니다. 최근에 Thy1 + CD48 neg 표현형이 RGC 세포 내 마커를 발현하는 세포의 균질 집단을 분리하는데 충분하지 않음이 밝혀졌습니다 23 . RGC 개체의 확인은 격리에 ...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

저자는 기술 비디오 지원을 위해 미생물학, 미생물학 및 생화학 분야의 선임 일러스트 레이터 Tim Higgins 씨에게 감사드립니다. Matthew W. Wilson 박사와 Jablonski 및 Morales-Tirado 연구소의 토론에 도움을 주셨습니다. 이 작품은 Alcon Research Institute의 Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T)의 지원을 받았다. Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), 국방부 육군 의학 연구 및 재료 명령 (VMM-T), 실명 예방을위한 연구로부터의 무제한 보조금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티 마우스 CD15 PEBioLegend125606클론, MC-480
안티 마우스 CD48, PE-Cy7BioLegend103424클론 HM48-1
안티 마우스 CD57시그마 알드리치C6680-100TST클론 VC1.1
안티 마우스 CD90.2 AF700BioLegend105320클론 30-H12
브릴리언트 바이올렛 421 염소 안티 마우스 IgGBioLegend405317클론 Poly4053
정제된 안티-마우스 CD16/32BioLegend101302FcgRII/III 블록, 클론 93
좀비 아쿠아 BioLegend423102Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead KitThermo Fisher ScientificA10497Multi-species Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049배양 전에 배지에 혈청을 첨가하십시오.
Thermo Fisher Scientific10010049 식염수 해
부 현미경OlympusSZ-PT 모델스테레오 현미경
Sorvall 원심분리기Thermo ScientificST 16R모든 원심분리 RT Base Plate &ndash
; Dissection PanFisher ScientificSB15233FIM왁스 플레이트도 사용할 수 있습니다
집게Aesculap5002-74 ½ 인치
아이리스 가위, 직선Aesculap13605 ½ 인치
Falcon 15 mL 원뿔형 튜브Fisher Scientific352097폴리프로필렌 튜브
Falcon 50 mL 원뿔형 튜브Fisher Scientific352098폴리 프로필렌 튜브
BD FACS 튜브Fisher Scientific352003폴리 프로필렌 튜브
40mm 접시MidSciTP93040조직 배양 처리
70 μ m 나일론 스트레이너MidSci70ICS멸균
40 μ m 나일론 여과기MidSci40ICS멸균
  BD 10 mL 주사기Fisher Scientific301604일회용 주사기 (바늘 없는
봉MidSciPEST멸균
Wheaton 바이알Fisher Scientific986734라이너 없음
BD 30 G 바늘Fisher Scientific3051281인치
Hausser Scientific Bright-Line 유리 계수 챔버Fisher Scientific0267151B혈액계
Gibco Trypan blue 0.4% 용액Fisher Scientific15250061 생존력 염료
Eppendorf 튜브Fisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS 플로이드 세포 이미징Thermo Fisher Scientific447113 20X 대물렌즈를 사용한 형광 이미징
100% 에탄올Fisher Scientific04-355-45270% 에탄올을 만드는 데 사용
Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+Rainin17014282LTS 피펫
Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+Rainin17014391LTS 피펫
Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+Rainin17014392LTS 피펫
랙 LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack 멸균 팁
랙 LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092Green Rack 멸균 팁
랙 LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090레드 랙 멸균 팁
FACSAria II 세포 분류기BD BiosciencesN/A맞춤 주문
LSR II CytometerBD BiosciencesN/A맞춤 주문
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Mü ller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Mü ller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1망막 색소 상피 세포
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1광수용체
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1 Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1양극성, 무축삭
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1망막 신경절 세포
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1무축삭
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1 망막 신경절 세포
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1광수용체
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1 망막 색소 상피 세포
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1Astrocytes
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1 Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Retinal Ganglion Cells
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Ganglion Cells
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Mü ller cells
Taqman Universal Master Mix, Thermo Fisher Scientific4440047qPCR 시약
miRNeasy 미니 키트Qiagen217004RNA Isolation
, SuperScript, VILO cDNA 합성 키트Thermo Fisher Scientific11754250cDNA 합성
Taqman PreAmp Master Mix, Thermo Fisher Scientific4391128사전 증폭 단계
BD Cytofix / CytopermBD Biosciences554714고정 / 투과 화 완충액
BD Perm / WashBD Biosciences554723투과 용액
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815세포 내 항체
SNCGGene TexGTX110483세포 내 항체
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429세포내 항체
TUJ1BioLegend801202세포 내 항체
, . 유) , , , , ,

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