수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 퇴행성 질환은 종종 영향을받는 사람들에게 치명적인 영향을 미칩니다. 망막 신경절 세포 (RGC)의 소실은 정상적인 노화뿐만 아니라 당뇨 망막 병증 및 녹내장을 비롯한 여러 질병에 영향을 미친다. RGC의 중요성에도 불구하고 RGC는 지금까지 부분적으로 망막의 다양한 세포 중 일부만으로 구성되어 있기 때문에 지금까지 연구하기가 극도로 어려웠습니다. 또한, 현재의 분리 방법은 세포 내 마커를 사용하여 비 생존 세포를 생성하는 RGC를 확인합니다. 또한 이러한 기술에는 긴 격리 프로토콜이 필요하므로 RGC를 얻고 분리하기위한 실용적이고 표준화 된 신뢰할 수있는 방법이 부족합니다. 이 연구는 양성 및 음성 선택 기준 모두에 근거한 프로토콜을 사용하여 생쥐 망막에서 주요 RGC를 분리하는 효율적이고 포괄적이며 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 장래의 RGC에 대한 연구를 허용하며,신경 퇴행성 질환에서 기능성 RGC의 손실로 인한 시력 감소.
서론
RGC는 말단 분화 된 뉴런이므로 일차 세포가 실험에 필요합니다. 일차 생쥐 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리 및 농축을위한 프로토콜의 개발은 시험 관내에서 RGC 건강 및 변성의 기전을 밝히는 데있어 기본적이다. 이것은 RGC 기능을 촉진하고 사망을 최소화 할 수있는 잠재적 인 치료법을 개발하려는 연구에 특히 중요합니다. RGC의 퇴행은 녹내장, 당뇨 망막 병증 및 정상 노화와 같은 망막 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. RGC 소실의 원인이되는 특정 세포 기전이 불분명하지만 일련의 위험 요소가 확인되었습니다. 시신경 머리 1 , 2 , 3 에서 산소가 부족하면 RGC가 사망하고 4 , 흥분제와 i의 활성화 사이의 항상성의 교란으로 작용합니다개별 RGC 5,6 내의 억제 수용체. 일련의 과제는 심층 연구를 위해 이러한 세포의 사용에 대한 진전을 방해합니다. 첫째, 쥐 망막에 존재하는 RGC의 수가 적습니다. RGCs는 총 망막 세포 7 ,
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프로토콜
다음 프로토콜에 자세히 설명 된 모든 절차는 테네시 보건 과학 센터 (UTHSC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 검토위원회의 승인을 얻었으며 사용을위한 안과 및 안과 연구 협회 (ARVO) 실험실 동물 실험 지침 (Laboratory Animal Resources, 실험실 동물의 인간애 보살핌 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책)에 추가하여 안과 및 시각 연구 동물을 대상으로합니다.
1. 도구, 솔루션 및 미디어 준비
주 : 프로토콜에보고 된 재료, 시약, 도구 및 도구에 관한 모든 정보는 재료 표에 명시되어 있습니다.
- 모든 해부기구를 오토 클레이브하고 멸균 지역에 보관하십시오. 다음 악기를 사용하십시오 : 표준 포셉 4 개 (길고 짧음 2 개)와 가위 2 개,해부학을위한 2 개의 포셉 (1 개의 길이와 1 개의 짧은)과 1 개의 가위뿐만 아니라. 여분의 세트를 백업으로 보관하십시오.
- 세척, immunolabeling 절차 및 셀 정렬 단계 동안 사용할 멸균 PBS / 1 % FBS 솔루션 100 ML을 준비합니다. 4 ° C에서 용액을 식힌다.
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결과
RGC에 대한 심층적 인 연구는 저주파수와 격리를위한 강력하고 표준화 된 방법론의 부족을 비롯한 여러 요인으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 그림 1 은 망막 격리에 사용 된 방법을 보여줍니다. 탈핵 절차의 변형은 탈핵이 생체 실험 27의 일부인 경우와 같은 분석 유형을 기반으로합니다. 이 프로토콜에서 핵 제거는 안락사 마우스에서 수행됩니다. 그림 1A - B 에서 볼 수 있듯이, 겸자는 눈 아래에 배치하고 최소한의 출혈을 일으키고 손상되지 않은 시신경을 가진 안구를 제거하기 위해 위로 잡아 당깁니다.
다른 마우스 쥐에서 RGC의 수에 차이가 있으며, 특히.......
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토론
FACS는 세포 집단을 정제하는 기술입니다. 다른 단리 방법으로는 면역 주사, 자성 비드 및 보체 고정 고갈이 있습니다. 이러한 다른 방법론에 비해 FACS의 장점은 다양한 강도의 강도를 가진 세포 표면 마커의 동시 식별에 기반합니다. 분자의 형광 강도는 단백질 발현 양에 비례합니다. 지금까지 RGC의 분리는 사용 된 격리 방법에 관계없이 Thy1 (CD90) 양성 및 CD48 음성성 15 , 16 , 22 , 34 에 단독으로 기초를 두었습니다. 최근에 Thy1 + CD48 neg 표현형이 RGC 세포 내 마커를 발현하는 세포의 균질 집단을 분리하는데 충분하지 않음이 밝혀졌습니다 23 . RGC 개체의 확인은 격리에 .......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 기술 비디오 지원을 위해 미생물학, 미생물학 및 생화학 분야의 선임 일러스트 레이터 Tim Higgins 씨에게 감사드립니다. Matthew W. Wilson 박사와 Jablonski 및 Morales-Tirado 연구소의 토론에 도움을 주셨습니다. 이 작품은 Alcon Research Institute의 Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T)의 지원을 받았다. Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), 국방부 육군 의학 연구 및 재료 명령 (VMM-T), 실명 예방을위한 연구로부터의 무제한 보조금.
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재료
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| 브릴리언트 바이올렛 421 염소 안티 마우스 IgG | BioLegend | 405317 | 클론 Poly4053 |
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| , SuperScript, VILO cDNA 합성 키트 | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA 합성 |
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| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | 세포 내 항체 |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | 세포내 항체 |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | 세포 내 항체 |
참고문헌
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P.
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