방법 논문

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링 2+ 센서 캐쳐 +

DOI:

10.3791/55822

⸱

2017년 5월 19일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Center of Diagnostics and Therapeutics (CDT), Georgia State University

이 논문에서

요약

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우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

초록

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세포 외 자극에 의해 유발 된 세포 내 칼슘 (Ca 2+ ) 과도 현상은 살아있는 유기체에서 수많은 생물학적 과정을 일으킨다. 세포 내 칼슘 방출의 중심에는 주요 세포 내 칼슘 저장 소기관, 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 및 근육 세포에서보다 특이적인 소구엽 (sarcoplasmic reticulum, SR)이있다. 이러한 세포 소기관에서 칼슘의 동적 방출은 raranodine 수용체 (RyR)와 이노시톨 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 (IP 3 R)에 의해 매개되며, sarco / endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) 펌프를 통해 재충전이 일어납니다. ER / SR에서 급속한 칼슘 방출을 모니터링하기 위해 유 전적으로 코딩 된 칼슘 센서 (GECI) 인 CatchER를 만들었습니다. 여기에서 HEK293 및 C2C12 세포에서 개선 된 ER / SR 표적 GECI CatchER + 의 형질 감염 및 발현에 대한 상세한 프로토콜 및 IP 3 R, RyR 및 SERCA 펌프 매개 형 과도 단백질의 모니터링에 대한 적용s가 형광 현미경을 사용하여 HEK293 세포에서 설명됩니다. 수용체 작용제 또는 선택 억제제를 챔버 용액에 분산시키고 강도 변화를 실시간으로 기록한다. 이 방법으로 ER 칼슘의 감소는 4- 클로로 -m- 크레졸 (4-cmc)에 의한 RyR 활성화, 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)에 의한 IP 3 R의 간접적 활성화, 사이클로 피아 조 닉성을 지닌 SERCA 펌프의 억제 산 (CPA). 우리는 또한 in situ K d 를 결정하고 C2C12 세포에서 기저 [Ca 2+ ]를 정량화하기위한 프로토콜을 논의한다. 요약하면, CatchER + 와 함께 사용되는이 프로토콜은 ER / SR 칼슘 관련 병리학을 연구 할 때 ER에서 수용체 매개 칼슘 방출을 유도 할 수 있습니다.

서론

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세포 내 칼슘 (Ca 2+ ) 과도의 시공간적 특성은 다양한 생물학적 기능을 활성화시킨다 1 . 이러한 Ca 2+ 신호 전달 사건은 다른 자극을 통해 세포 외적으로 유발되어 주요 Ca 2+ 저장 기관과 수많은 Ca 2+ 펌프, 채널 및 Ca 2+ 결합 단백질에 의해 세포 내로 조절됩니다. Ca 2+ 과도 현상은 신호 변조로 인한 결함으로 인해 크게 달라질 수있어 다른 질병을 유발할 수 있습니다 2 . Ca 2+ 시그널링 시스템의 속도와 복잡성 때문에, 중심에서 endo- (ER)와 sarcoplasmic reticulum (SR)을 이용하여 빠른 속도론으로 포유류 발현을 위해 최적화 된 유 전적으로 암호화 된 Ca 2+ 프로브가 필요합니다 다른 세포에서 전지구 및 국부적 인 Ca 2+ 변화를 관찰 3 .

ER과 SR, 근육 세포의 대응, 주요 세포 내 칼슘 2 + 저장 organelles 있으며 칼슘 2 +

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프로토콜

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1. 슬라이드 준비

  1. 장소 당 22cm x 40mm 유리 현미경 슬라이드 6cm 세포 문화 요리, 접시 당 1 슬라이드.
  2. 멸균 후드에서 살균하기 위해 15-20 분 동안 자외선 (UV) 빛에 각 슬라이드뿐만 아니라 6cm 요리의 각 측면을 노출.
  3. parafilm으로 내부 슬라이드로 접시를 덮고 4 ° C에서 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오.

2. 배지, 완충액, 용액 및 시약의 준비

  1. 탈 이온수에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 L를 준비하고 10 MM HEPES, 5 MM NaHCO 3 및 1 MM EGTA를 추가합니다. NaOH로 pH 7.2-7.3으로 조정한다. 0.22 μm 필터를 가진 완충액을 오토 클레이브 한 병에 넣습니다.
  2. 탈 이온수에서 고 포도당 Dulbecco Modified Eagle 's Medium (DMEM) 900 mL를 준비한다. 44 MM NaHCO 3 를 첨가하고 HCl로 pH 7.2-7.3을 조정한다. Autoclaved 병에 0.22 μm의 필터와 미디어를 필터링합니다. 태아 보비 100 mL를 넣는다.(FBS)을 첨가하여 FBS 농도를 10 %로 ....

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결과

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이 섹션은 다른 수용체 매개 경로를 통해 ER / SR 칼슘 2 +의 변화를 모니터링하기 위해 최적화 된 ER / SR 타겟 GECI CatchER + 를 사용하여 이전에 설명한 방법을 사용하여 달성 된 결과를 설명합니다.

그림 1 은 200 μM 4-cmc로 자극 된 RyR을 통한 ER 비우기를 보여줍니다. 4-cmc는 RyR의 항진제입니다. 약물의 첨가는 CatchER + 형광 강도의 감소로 측정 된 ER 칼슘의 감소를 유도한다. 표시된 바와 같이, 여기에 약술 된 프로토콜은 ER Ca 2+ 의 변화에 ​​대한 정보를 제공하는 CatchER + 를 사용하여 수용체 매개 Ca 2+ 과도의 .......

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토론

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CatchER + 와 같은 형광 프로브의 라이브 싱글 셀 이미징은 수용체 아고 니스트 또는 길항제에 대한 반응으로 각 세포에서 복잡한 ER / SR Ca 2+ 신호 전달 프로세스를 분석하는 효과적인 기술입니다. 이 기술은 Fura-2에 필요하거나 CatchER + 와 Rhod-2를 함께 사용하여 ER과 cytosolic calcium change를 동시에 모니터링하는 것과 같이 동시에 여러 파장을 사용하여 이미징하는 데 유용합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 세포 형질 감염은 이미징의 생존 능력에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 낮은 형질 감염률은 칼슘 반응을 모니터링하기위한 GECI의 발현이 불충분해질 수 있습니다. 한편, CatchER +의 과발현은 합성 칼슘 염료와 관련된 문제인 ER / ER Ca 2+ 에 대한 완충 효과를 가지지 않습니다. Ca 2+ 프로브의 완충 효과는 세포 소기관.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant 및 NIH Supplemental Grant, FR, BB Fellowship to CM, RG CDT Fellowship에서 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-클로로-3-메틸페놀(4-CmC)시그마-알드리치C55402
515DCXR 이색성 거울Chroma Technology Corp.
아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물시그마-알드리치A26209
염화칼슘 이수화물EMD 밀리포어102382
코닝 조직 배양 처리 배양 접시 (100mm)시그마-알드리치CLS430167
코닝 조직 배양 처리 배양 접시 (60mm)시그마-알드리치CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)EMD Millipore239805
D (+) - 포도ACROS 유기물41095-0010
다우 코닝 111 밸브 윤활유 & 실란트워너 인스트루먼트64-0275
Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM)Sigma-AldrichD7777
에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)
테트라아세트산 (EGTA)		아크로스 유기물409911000 
태아 소 세럼 (FBS)ThermoFisher26140087
Fisherbrand 커버 안경 22x40 mmFisher Scientific  12-544B
행크스 Balanced Salts (HBSS)Sigma-AldrichH4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology GradeEMD Millipore391340
Immersion Oil without autofluorescenceLeica11513859
Ionomycin, Free AcidFisher Scientific50-230-5804
Leica DM6100B 도립 현미경, 냉각 EM-CCD 카메라HamamatsuC9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection 시약ThermoFisher11668019
Lipofectamine 3000 Transfection 시약ThermoFisherL3000015
로우 프로파일 오픈 다이아몬드 배스 이미징 챔버Warner InstrumentsRC-26GLP
염화마그네슘 육수화물Fisher ScientificM33-500
Opti-MEMThermoFisher51985034
염화칼EMD MilliporePX1405
인산칼륨, 이염기성EMD MilliporePX1570
인산칼륨, 일염기성EMD MilliporePX1565
사포닌Sigma-Aldrich47036
SimplePCI 이미지 분석 소프트웨어HamamatsuN/A
중탄산나트륨Fisher ScientificS233-3
염화나트륨Fisher ScientificS271-500
Sterivex-GV 0.22 &마이크로; m 필터EMD MilliporeSVGVB1010
Till Polychrome V 크세논 램프Till PhotonicsN/A
트립신(2.5%), 페놀 레드 없음(10x)ThermoFisher15090046
NC338059당 륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  2. Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
  3. Tang, S., Reddish....

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CatchER PlusERHEK293C2C12IP3RRyRSERCA

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