마우스 5/6일 신 모델 실험 신부전 심근을 유도

요약

이 원고 마우스 5/6^일 부분 신 (PNx) 극 결 찰과 수행에 상세한 2 단계 수술 절차를 제공 합니다. 수술 후 4 주 운영 하는 가짜 쥐에 비해 PNx 마우스 개발 장애 신장 기능, 빈 혈, 심장 비 대, 심장 섬유 증, 및 심장 수축 기 및 diastolic 기능 감소.

초록

만성 신장 병 (CKD) 심혈 관 질환 이벤트 및 사망률에 대 한 큰 위험 요소 이며 "신부전 심근" 라는 임상 표현 형에 점차적으로 발전 한다. 여기 극 결 찰, 수술 4 주 후에 신부전 심근 개발 5/6^일 부분 신 (PNx) 라는 하는 실험적인 CKD 마우스 모델을 설명 합니다. 이 PNx 모델 2 단계 수술에 의해 수행 되었다. 단계 1 수술에서 왼쪽된 신장의 두 극 출혈 했다. 수행 단계 1 수술 후 7 일, 2 단계 수술에서 오른쪽 신장은 제거 되었다. 가짜 수술 같은 수술 절차 수행 하지만 없이 왼쪽된 신장 결 찰 또는 오른쪽 신장 제거 장 대. 수술 절차는 쉽고 보다 적게 시간이 걸리는 다른 방법에 비해. 그러나, 나머지 기능 신장 질량 신장 동맥 결 찰으로 쉽게 제어 되지 않습니다. 수술 후 4 주 운영 하는 가짜 쥐에 비해 PNx 마우스 개발 장애 신장 기능, 빈 혈, 심장 비 대, 심장 섬유 증, 및 심장 수축 기 및 diastolic 기능 감소.

서론

CKD, 일컬어 만성 신부전, 신장 기능의 진보적인 손실 결국 영구적인 신부전으로 발전 하는 시간이 끝났습니다. CKD, 끝 단계 신장 질병 (ESRD)을 초기 단계 신장 질병 상태에서 심혈 관 질환 이벤트 및 사망률에 대 한 큰 위험 요소 이며 점차적으로 "신부전 심근"^1, 라는 임상 표현 형을 개발 ^2,3. CKD 또는 ESRD 환자에서 신부전 심근은 심장 혈관 이상, 주로 좌 심 실 (LV) 압력 및/또는 볼륨, LV 비 대 (LVH), LV 팽창 및 LV 수축 부전^{4의 오버 로드로 인 한 연관 ,,56}. 심장 섬유 증 심장 준수 LV 확장기 부전 결과로 감소 신부전 심근의 또 다른 일반적인 병 적인 과정 이다. 심각한 심장 섬유 증은 그 없이 심장 증상⁷에 갑작스런 심장 죽음으로 이어질 수 있습니다.

5/6^일 PNx은 신부전 심장 근육 병 증, 고혈압, 신부전을 포함 하는 동물 연구에 대 한 일반적으로 사용 되 CKD 동물 모델 이다. PNx 5/6 신장 실질의 제거에 의해 달성 된다. 쥐 모델 처음 개발한 두와 함께 가장 일반적인 프로토콜 외과 절제술 또는 경색 되 고 고용. 쥐 PNx 모델은 혈압, 심장 비 대 및 장애인된 diastolic 기능에 상당한 고도 함께 신부전 심근을 공부 하는 매우 유용한 모델. 나중에, 마우스 PNx 모델, 쥐 모델로 비슷한 기술로 운영 넓은 가용성 및 마우스 시스템에 유전자 조작의 용이성으로 인해 개발 되었다.

그것은 잘 문서화 된 조직의 산화 스트레스는 모두 임상 및 실험 신부전 심근^8,9의 일정 기능입니다. 게다가, 산화 스트레스 신부전 증후군¹⁰에 기여 하 고 신부전 심근^11,,1213에서 심장 종양의 병 인에 중요 한 역할을 한다. 이 시점에, 우리가 보여준 그 설치류 5/6^일 PNx 모델 발생 생리, 형태학, 생화학 기능과 신부전 심근^14,,1516, 의 ¹⁷. 여기에 설명 된 마우스 PNx 모델에서 운영 하는 PNx 마우스 개발 중요 한 산화 스트레스, Na/K-ATPase 함수를 PNx 중재 실험 신부전 심근에 중요 한 신호에 의해 적어도 부분적으로 중재. Na/K-ATPase 신호 감쇠 뿐만 아니라 산화 증폭 줄어들지만 또한 PNx 중재 실험 신부전 심근¹⁸phenotypical 변화를 살펴볼.

프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 마샬 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 국립 보건원 (NIH) 가이드에 의해 승인 했다. 남성 C57BL/6 마우스 (10-12 주 이전) 지정 객실 12 h 명암 주기에서 공기를 정화 제공 연습장을 갖추고 병원 체 무료 동물 시설에 보관 되어 있었다. 음식과 물 공급된 광고 libitum 했다.

1. 수술 준비

참고: 수술 도구와 재료 수술 작업에 특정 하지 않은 다른 소스에서 얻을 수 있습니다. 악기와 다른 소스 로부터 자료 또한 동일한 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 수술 악기의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.

1. 수술에 대 한 준비
   1. 장소 운영 곳 다음 테이블: 온난화 패드, 할로겐 램프, 산소 탱크 및 isoflurane 탱크, isoflurane 기화 기, 머리 깎기, 제 모 크림, 비늘, 살 균 세트, 소독된 외과 넨, 면봉, 70% 알코올, polyhydroxydine 솔루션 (1% 요오드 포함), 0.9 %NaCl 용액, 1 mL 주사기 및 바늘 (30 G), 3-0와 4-0 비단 봉합 buprenorphine, 페니실린, 항생제 연 고를 운영 하 고 윤 활 유 눈 연 고.
   2. 감 금 소를 청소 하 고 수술 후 주택 마우스 침구 아래 열 패드 배치.

2. 단계 1 수술: 극 결 찰의 왼쪽 신장

참고: 수술 동안 멸 균 상태를 유지. 압력가 마로 소독 외과 기구 살 균 패드와 함께 커버. 수술 동안 교차 오염을 방지 하기 위해 더 이상의 수술 외과 악기의 하나 이상의 세트를 손에 계속. 악기를 다시 사용 해야, 여러 수술의 경우 betadine 솔루션 및 70% 에탄올, 악기를 소독 하 고 5 분 소독 70% 에탄올과 운영 지역에 대 한 germinator 유리 구슬 소독 기에 소독. (커버 코 입)를, (헤드 커버)에 모자, 마스크, 가운을 착용 하 고 멸 균 장갑 한 켤레. 각 수술 후 장갑 변경.

1. 세척 및 손 소독 및 멸 균 수술 장갑을 착용. 머리 모자와 마스크 착용.
2. 테이블 70% 알코올로 소독. 마 취에서 눈 건조를 방지 하기 위해 마우스의 두 눈에 윤활제 눈 연 고를 적용.
3. Isoflurane 기화 기 시스템의 유도 실에서 마우스를 배치 하 고 2.5% isoflurane 1-2 분에 대 한 100% 산소 (0.8-1.2 L/min)의 혼합물으로 마 취 유도
   참고: 마 취의 효능 통증 반사 종을 반사의 부재에 의해 뿐만 아니라, 꼬리를 곤란 하 게 하 여 눈 꺼 풀을 만져 elicited의 부재에 의해 결정 되었다.
4. 페니실린 (40000 단위/kg 몸 무게, 임)과 buprenorphine (0.02 mg/kg 몸 무게, 사우스 캐롤라이나) 수술 중 통증과 감염을 방지 하기 위해 주입.
5. 유지 절차 동안 체온 37 ° C의 주위를 감시 하는 직장 온도계로 지구 온난화 패드 (처음에 42 ° C에서 설정)에 마우스를 놓습니다. 마우스 코 코 콘으로 놓고 0.8-1.2의 혼합물으로 환기 % isoflurane 100% 산소 (0.8-1.2 L/min) 수술 하는 동안.
6. 는 오른쪽에 마우스를 놓습니다. 머리 깎기로 외과 영역의 머리를 면도 하 고 제 모 크림으로 제거. 뒤에 70% 에탄올 (1% 요오드 포함) polyhydroxydine 솔루션 사이트를 소독. 외과 영역에 압력가 수술 린 넨 정렬.
7. ~1.0 cm 허리 절 개를 하 고 근육과 근 노출 메스 집게 ( 그림 1a)를 사용 하 여 왼쪽된 신장 분리.
8. 당겨 왼쪽된 신장 밖으로 아주 부드럽게 perirenal 지방에 작은 무뚝뚝한 집게와. 과정에서 부 신 샘을 방해 하기 위하여 이동 아드레날린 선 위쪽으로 신장에서 집게.
9. 무딘 집게를 사용 하 여, 부드럽게 결합 조직과 신장 혈관에 입력 하 고 출구의 중간 pylorus 향해 신장의 우수한 끝에서 아드레날린 선 애타게. 식별 하 고 격리 ureter.
   참고: 열 등 한 결합 조직에 포함 된 및 빛에서 명확 하 게 보이는 신장 절반 주위 ureter 거짓말.
10. 부드럽게 잡아 결합 조직 및 ureter 출혈 되지 보장 하기 위해 신장 조직에서 분리.
11. 폴라 ligations 전에 신장의 뛰어난 및 하 부 1/3 부분을 식별 하는 메 마른 자를 사용. 마우스 신장은 일반적으로 1.25-1.5 cm 오래 주위
12. Ligate 3-0 비단 봉합 문자열과 적절 한 힘을 사용 하 여, pylorus의 중앙으로 우수한 부분에서 약 0.4 c m와 마찬가지로, 0.4 cm pylorus ( 그림 1a, 점선으로 열 등 한 부분에서 라인).
13. 두 극 ( 그림 1b) ligating, 후 아니 출혈은 되도록 2 분 관측 시간 허용.
    참고:이 과정에서 매우 중요 하다 부 신, 신장 동맥, 및 ureter 결 찰을 피하기 위해. 왼쪽된 ureter 출혈 하는 경우 마우스의 2 단계 수술에서 오른쪽 신장 제거 후 죽을 것 이다. 결 찰 힘 내 신장 출혈을 유발 하지 않고 폴란드에 혈액 흐름을 제한할 수 있습니다. 결 찰 후 1-2 분 이내 폴란드는 폴란드에 혈액 흐름의 제한으로 인해 변색.
14. 밀어 왼쪽된 신장 다시 원래 장소. 근육과 피부를 4-0와 3-0 비단 봉합 문자열에 각각 닫습니다. 더 나은 복구 및 소독에 대 한 외과 영역에 항생제 연 고를 적용.
15. 결 찰, 후 집에 별도로 마우스 열 램프와 감 금 소에는 침구 영역 (온도계와 모니터링), 37 ° C 가까이 개별 장에 동물을 배치 하기 전에.
    참고: sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 마우스를 모니터.
16. 복구 하는 동안 물과 음식에 쉽게 액세스를 허용합니다. 페니실린과 buprenorphine 감염 및 고통을 방지 하기 위해 첫 3 일 후 수술에 대 한 모든 12 h.
    참고: 마우스 2-3 일 이내 수술의 외상에서 회복 해야 하 고 다시 정상적인 식사, 음주와 이동 하는 것. 이 시간에서 전체 복구에 대 한 개별적으로 마우스를 집. 다음 모니터링 해야 합니다: 음주, 식사, 패턴, 어 색 한 걸음 걸이, 돌출, 눈 또는 비 강 방전 뒤로하고 공격적인 행동을 걸어. 발작, 혼 수 상태, untreatable 감염, 어려움 걷기, 걸음 걸이, 음식과 음료, 수 없습니다의 손실 및 15%의 손실의 어떤 표시 든 지 표시 하는 경우 마우스를 안락사 사전 작업 무게.

3. 단계 2 수술: 오른쪽 신장의 제거

1. 7 일 후, 단계 2.1에 2.10, 마우스의 왼쪽된 측면에 배치를 제외 하 고 왼쪽된 신장에 대 한 설명 된 대로 오른쪽 신장 노출.
2. 리넨에 오른쪽 신장 고 무딘 집게와 주변 지방과 결합 조직 취소.
3. 신장 동맥과 정 맥, 식별 하 고 두 개의 합자 (3-0 실크) 각 단일 느슨한 매듭 혈관 주위 장소. 부드럽게 결합 조직과 부 신을 애타게 중간 pylorus 무딘 집게를 사용 하 여 신장으로 신장의 우수한 끝에서 선. 부드럽게 열 등 한 끝에서 ureter을 치환 하 고 모든 넥타이 혈관 함께 (3-0 실크) 출혈 발생 하지 않고.
4. 혈관을 따라 두 개의 느슨한 묶인 매듭을 이동합니다. 복 부 대동맥 쪽을 향해과 다른 하나 하나 신장 쪽을 향해.
5. 먼저 넥타이 (복 부 대동맥 측면)으로 묶인 매듭을 두 배 매듭, 단단한 매듭 오른쪽 신장의 색을 변경 합니다. 두 배 매듭 (신장 측)으로 묶인 매듭을 묶어. 합자 매듭을 절단 하지 않고 두 매듭 사이의 혈관을 잘라 수 있도록 이러한 두 개의 두 배 매듭 사이의 충분 한 공간을 두고.
6. 두 매듭 사이의 신장 혈관 고 오른쪽 신장 제거. 가능 신장 혈관의 출혈에 대 한 확인 하십시오.
7. 오른쪽 신장 멸 균 거 즈를 사용 하 여 건조 하 고 그것의 무게
8. 4-0 비단 봉합 문자열 근육 절 개를 닫고 다음 3-0 비단 봉합 문자열 피부 절 개를 닫습니다.
9. 복구에 적어도 24 시간을 위한 음식과 물에 쉽게 접근할 케이지 (단계 2.15) 동안 열 램프와 깨끗 한 독방에 별도로 마우스를 집. 페니실린과 buprenorphine 감염 및 고통을 방지 하기 위해 3 일에 대 한 모든 12 h.
   참고: 마우스 2-3 일 이내 수술의 외상에서 회복 해야 하 고 다시 정상적인 식사, 음주와 이동 하는 것.
10. 수술 후 3 일, 그리고 하루에 실험의 기간에 대 한 다음 한 번에 대 한 마우스를 두 번 매일 모니터링. 수술 후 모니터링 및 치료 단계 2.16에서에서 설명한 절차에 따라.

4. 수술 가짜

1. 가짜 수술에 대 한 노출의 신장, 조직, 그리고 상처 폐쇄, 하지만 왼쪽된 신장 극 결 찰 없이 해 부 또는 오른쪽 신장의 제거를 포함 하 여 동일한 수술 절차를 수행 합니다.

5. 실험적인 신부전 심근 평가의

1. 희생 하기 전에 1 일 transthoracic 심장 초음파 검사를 수행 하 고 캡처 이미지 ¹⁸.
   참고: 여기, transthoracic 심장 초음파 처리 테이블 고 직장 온도계 마우스와 함께 수행 되었다. Echocardiographic 이미지 이미징 시스템에 연결 된 동작 주파수 변환기는 18-38 MHz를 사용 하 여 점령 했다. 우리가 ¹⁸ 설명한 상대 벽 두께 (RWT), 심근 성과 지표 (MPI), 그리고 좌 심 실 질량 지 수 (LVMI) 계산 했다.
2. 희생의 때에 몸 무게를 측정. 제조 업체에 따라 HCT 원심 분리기가 (HCT) 측정 ' s 지시. 4 ° c 탁상 냉장된 원심 분리기에서 1500 x g에서 10 분 동안 혈액 샘플 centrifuging 여 헤 파 린 코팅 된 튜브를 사용 하 여 플라즈마 샘플을 준비 합니다. Cystatin C, 크와 벤 다음 제조 업체 키트를 사용 하 여 측정 ' s 지시. 중복에는 측정을 수행.
3. 실험의 끝에, anesthetize xylaxine (10 mg/kg, IP) 케 타 민 (90 mg/kg, IP)와 쥐와 thoracotomy 희생. 가슴에서 그것을 제거한 후 심장 무게를 측정 합니다. ^{18 , 19} 전에 설명한 것 처럼 Type 1 콜라겐 (1 열), c-Src 및 단백질에서 인 산화의 결정 뿐만 아니라 심장 (LV) 및 신장 homogenates을 준비.

결과

데이터 표시이 수정 5/6^일 극 결 찰에 의해 PNx 모델은 신부전 심근을 조사 하는 간단 하 고 효과적인 모델. 수술 4 주 후,이 PNx 모델 선물 심장 섬유 증, 심장 비 대, 빈 혈, 신장 기능 장애 및 심장 수축 기 및 diastolic 기능 감소. 결과 아래에 요약 된다.

수술 4 주 후, PNx 쥐 인간의 신부전 심근의 phenotype과 일치 심장 형태학 및 생화학 적인 변화 뿐만 아니라 장애인된 신장 기능 개발. 이러한 PNx 중재 변경 포함 운영 하는 가짜 쥐에 비해 다음과 같은 관찰이 됩니다. 첫째, 예상 했던 대로, PNx 수술 신장 기능의 중요 한 장애를 발생 합니다. 그림 2에서 같이, PNx 수술 크게 증가 Cystatin C의 플라즈...

토론

쥐 5/6^일 PNx 모델 널리 CKD를 공부 하는 데 사용 되었습니다. 크기 때문에 훨씬 작은 신장 마우스에서, 클래식 동맥 결 찰 및 극 절제 가능한 높은 사망률 및 예기치 않은 출혈/혈액 손실이 마우스 모델에서 매우 어려운 있습니다.

우리는 출혈/혈액 손실을 극복 하기 위해 극 결 찰 마우스 PNx 모델을 채택 했다. 이 PNx 모델 향상 된 생존 율 및 높은 재현성으로 시간이 적게 걸립니다. 이 극 결 찰 모델 4 주 수술 후, 당시의 인간의 신부전 심근의 phenotypic 변화를 개발 하 고 따라서 따라 장치를 마더보드 및 치료 대상을 연구 하는 모델을 제공 합니다.

이 PNx 모델에서 5/6^일 PNx는 이후, 신장 질량 감소의 대략적인 추정 이며 지금까지, 정확 하 게 다른 크기/질량에 있는 두 콩 팥의 남은 신장 질량을 계산 하는 방법은 없습니다. 그러나,는 결 찰 작업 편차를 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아이리스 가위, 11.5 cm, 스트레이트	월드 정밀 기기	501758
WPI 스위스 핀셋 #5 11 cm, 0.1x0.06 mm 팁	월드 정밀 기기	504506
보석상 #5 집게, 11cm, 스트레이트, 티타늄	월드 정밀 기기	555227F
아이리스 집게, 10cm, 스트레이트, 톱니 모양의	세계 정밀 기기	15914
트위저 #3, 11cm, 0.2x0.4mm 팁	World Precision Instruments	501976
Medesy Iris 4.5" 곡선 가위, 스테인레스 스틸	Net23	3512	www.Net32.com
Dr. Slick Iris 가위; 3.5"	Avid Max	220-1-965-IrisScsrs-P	www입니다. Avid Max.com
Miltex 아이리스 가위 4 1/8" 곡선	4mdmedical	V95-306	www.4mdmedical.com
5" 지혈 박수, 곡선 턱	PJTool	4355	www.pjtool.com
sklar Knapp 홍채 가위, 직선적이고 날카롭고 뭉툭한 4"	의료 기기 창고	64-3430	www.medicaldevicedepot.com
켈리 혈압 집게 직선 5.5"	Pilgtimmedical	FA710-50	www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 마우스	Hilltop Lab Animals Inc.
마우스 취급 테이블 및 직장 온도계	Visualsonics
MicroScan 변환기	Vevo 1100	MS400
Vevo 1100 이미징 시스템	후지필름 비주얼소닉스 주식회사
시스타틴 C ELISA 키트 및 마우스 크레아티닌 키트	크리스탈 화학 Inc.
마우스 BUN ELISA 키트	마이바이오소스 주식회사