생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
Circadian 리듬 동작 자 유전자 발현에서 배열 하는 생물 학적 과정을 조절 하는 기본적인 생리 과정 모든 생물에 존재 이다. 척추 동물, circadian 리듬 (SCN, 중앙 맥 박 조정기) suprachiasmatic 핵 및 가장 주변 조직을 구성 하는 개별 셀 기능 분자 발진기에 의해 제어 됩니다. 더 중요 한 것은, 밤에 빛, 환경 스트레스 또는 유독 하 여 circadian 리듬의 만성 질환과 노화의 위험 증가와 연결 됩니다. 중앙 및 주변 생물 학적 시계를 중단 시킬 수 있는 에이전트와 에이전트 방지 또는 circadian 중단의 효과 완화 수 있는 식별 수 만성 질환의 예방에 중요 한 의미를 갖는다. 설치류 모델 노출 및 유도 또는 circadian 중단 방지/완화 하는 에이전트를 식별 하는 데 수 있습니다, 비록이 실험 동물의 많은 수를 필요 합니다. Vivo에서 연구는 또한 중요 한 자원과 인프라를 요구 하 고 밤새 일 하는 연구원을 필요로. 따라서, 있다 시스템 적절 한 체 외에서 세포 형에 대 한 긴급 한 필요 환경 circadian 분리기 및 강화 셀 형식에 대 한 화면을 다른 기관과 질병 상태에서. 우리는 인간 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 진 핵 세포에서 정한 luciferase의 전사를 구동 하는 벡터를 건설 한다. 이 circadian 기자 구조는 안정적으로 인간 유 방 상피 세포로 페 그리고 circadian 응답 기자 세포 생체 외에서 생물 발광 분석 결과 개발 하기 위해 선정 됐다. 여기, 우리는 상세한 프로토콜을 설정 하 고 분석 결과 제시. 우리는 더는 vivo에서 다양 한 화학 물질의 효과 세포 생물 학적 시계에 정리 분석 결과 생체 외에서 우리의 수를 보여주는 개념 실험의 증거에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 결과 분석 결과 다양 한 종류의 세포에 대해 환경 분리기 및 circadian clock의 chemopreventive 강화를 적용할 수 있습니다 나타냅니다.
서론
Circadian 시계 넓은 범위 조절 유전자 약 24 h. 역학의 주기 예측 가능한 리듬 동작 자를 일주 식에서 생물 학적 과정의 연구 좋습니다 circadian 그 만성 장애 리듬의 유 방 및 교대 근로자, 간호사, 항공 승무원1,2,3등 전립선 암 위험을 증가 시킵니다. 이러한 결과 지속적인 빛, 밤에 빛, 또는 빛 사이클-시차 증가 종양 발생률을 모방 하 고 종양 성장을4,5가속을 노출을 보여주는 설치류 연구에 의해 뒷받침 됩니다. 인간과 설치류 학문에서 데이터를 바탕으로, 암 연구에 대 한 국제 기구의 분류는 가능성이 인간의 발암 물질 (유형 2A) 20106교대 작업.
우리는 설명 하는 이전에 유 방 종양 특정 발암 물질, Nnitroso의 단일 발암 복용량-N-methylurea (NMU) 중단 circadian 표현의 주요 circadian 유전자 (CGs) (예를 들어, 기간 2 , Per2) 여러 circadian 제어 유전자 (CCGs), 포함 한 DNA 손상 응답 키 및 대상 유선 (에 간) (DDRR) 유전자를 복구. 또한, 정상을 향해 Per2 와 DDRR 유전자의 circadian 식 식이 L의 chemopreventive 처방에 의해 다시 설정-메 틸-셀레노시스테인 (MSC) 63%로 종양의 발생률을 감소. 이러한 연구 결과 circadian 리듬, 화학 발암 및 자성7,8간의 기계적 링크를 표시 하는 첫번째 이었다. 기타 환경 유독 circadian 유전자 식에 vivo에서 방해를 표시 하는 노출 환경 질병9,10의 증가 위험과 관련 된 있습니다. 환경 유독 병 인 여 circadian 중단 연결 메커니즘을 이해 질병 예방에 mechanistically 기반 접근을 이어질 수 있습니다. 그러나, 연구는 노출 사이 상호 작용을 정의 목적 및 circadian 리듬은 일반적으로 수행 vivo에서. 24 또는 48 h 동안 모든 3-4 h를 수집는 전형적인 vivo에서 실험 조사 circadian 리듬에 미치는 영향 필요, 동물의 많은 수에서 3 개 이상 조직 제어 및 3 노출된 동물 되어야 합니다. Vivo에서 관찰 및 메커니즘이 검증 된 시험관에 시스템의 개발 따라서 뿐만 아니라, 동물의 수를 줄일 것 이라고 하지만 실험 비용 및 요구 사항 또한 극적으로 감소 하는 연구팀은 24-48 h 동안 지속적으로 작동합니다. 또한, 시스템 검증 된 시험관에 circadian 리듬, 또는 환경 스트레스 또는 유독 그것의 응답에 영향을 주는 유전 변경 화합물의 높은 처리량 검열 사용 될 수 있습니다. 따라서, 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델과 실험의 협력 조합 다른 초점으로 다른 통찰력을 얻기 위해 필요 합니다.
포유류에서 circadian 발진기는 SCN의 특수 신경 뿐만 아니라 가장 주변 셀 형식에 존재 한다. 이 분자 시계는 비슷합니다 설립된 fibroblast 세포 선 및 기본 섬유 아 세포에서 배아 또는 성인 동물; 그러나, 조직 유형 특정 휴대 전화 모델11에 대 한 필요가 있다. 따라서, 운동 활동에서 vivo에서, SCN의 전통적인 연구 explants 비보 전, 그리고 불멸 하 게 fibroblast 세포의 체 외에서 세포 기반 분석은 널리 셀 자치 circadian 결함을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 fibroblast 세포 기반 분석 결과 circadian 메커니즘을 정리 수 있습니다 나타내는 증거가 없다 하 고 다른 주변 장기에 vivo에서의 셀에 응답 제시. 다른 세포 유형 유전자 발현, xenobiotic 물질 대사, 및 DDRR, 독특한 패턴을 가질 수 있으며 독성과 circadian 유전자 발현 사이의 링크 셀 형 수 있습니다 특정 및 다른 생리 적인 매개 변수에 의해 변조. 또한, 섬유 기반 시스템에서 circadian 발진기는 하지 되었습니다 완전히 평가 환경 유독, 스트레스 및 질병 개발 및 예방의 메커니즘에 노출 링크 예방 에이전트에 대 한 응답에 대 한. 따라서, 손쉬운, 유효한 셀 유형 전용, 생체 외에서 생물 발광 분석 실험 연구 기관 특정 환경 circadian 분리기에 대 한 필요가 있다. 다양 한 세포 시계 모델 (예를 들어, 간, keratinocytes, 지방 세포 뿐만 아니라 다리 셀 선)는 최근 몇 년 동안12,,1314, 에서 개발 되었습니다. 15, 여기서 설명 하는 분석 결과 유 방 상피 세포, 그리고 vivo에서 환경 스트레스, 유독, 마약과 chemopreventive 대리인 응답을 정리를 첫 번째 데모에서 첫 번째 세포 시계 모델입니다.
Renilla luciferase (rLuc) 및 반딧불 luciferase 30-61 kDa 단위체 단백질 효소 활동에 대 한 처리 posttranslational 필요 하지 않은 및 번역 즉시 유전 기자로 서 기능을 할 수 있습니다. 일단 기판 연결 luciferase 효소, 생 화 확 적인 반응을 촉매 빛의 플래시를 생성 합니다. 따라서, luciferase 구문은 진 식 기자 시스템에서 생체 외에서 그리고 에 비보로 널리 사용 됩니다. 그러나, circadian 리듬 연구, luciferase 기자의 유틸리티 luciferase 단백질의 상대적으로 긴 반감기에 의해 제한 됩니다 (T1/2 = 3.68 h) 기간 (특히 짧은 기간) circadian 유전자에 변화에 대 한 상대적인 식; 그러나, 수많은 연구 년 동안 성공적으로 사용 luciferase 유전자 빠르게 분해 luciferase 같은 circadian 리듬, 특히 오랜 기간 함께 리듬에 대 한 보고를 위해 필요 하지 않을 수 있음을 나타내는 pGL3 벡터에 24 h입니다. 따라서, 기자 플라스 미드 정한 luciferase 벡터를 사용 하 여,: pGL [Luc2P/Neo] hPEST (단백질 불안 시퀀스)를 포함 하는 개발 되었습니다, 현재 체 외 circadian 기자 벡터로 사용 하 수 있도록 생물 발광 분석 결과. Luc2P 에 의해 단백질은 훨씬 더 짧은 반감기 (T1/2 = 0.84 h) 따라서, 응답 보다 신속 하 고 더 큰 크기와 변화에 야생-타입 보다 transcriptional 활동에 나그것은 될 수 있는 ndicating luciferase 실시간16에 정확 하 게 PER2 발기인에 의해 규제의 리듬 표현 모니터링 하는 데 사용.
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프로토콜
1. PER2 발기인 구동 불안정 Luciferase 기자 벡터의 건설
- pLS 사용자 정의 구입 [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 인코딩 rLuc 및 인간 cDNA를 포함 하는 벡터 PER2 발기인 조각 (hPER2P, 941 bp) Sac 사이 사이트에서 나 고 뒷 다리 여러 복제 지역 17에 III.
- 인간의 PER2 발기인 조각 잘라 (hPER2P, 941 bp)는 벡터에서.
- 추가 2.5 µ L 제한 효소 버퍼, 10 µ L (180 기) pLS [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 벡터 및 1 µ L 각 금지 효소, Sac의 I (10 단위 / µ L) 및 뒷 다리 III (10 단위 / µ L)는 DNA/RNA/뉴클레오티드-무료에 microcentrifuge 튜브입니다. 부드럽게 pipetting으로 초순 (10.5 µ L) 25 µ L와 믹스를 추가.
- 난방 블록에 90 분 동안 37 ° C에서 품.
- 0.7 %agarose 젤 0.0001 %ethidium 평범한 사람 (EtBr) 벡터에서는 hPER2P을 포함 하는 제한 효소 반응의 전체 볼륨 (25 µ L) 실행.
참고: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium 브 로마 이드 (CAS 등록 번호: 1239-45-8)은 무 취 붉은 액체. 그것은 일반적으로 사용 되는 형광 태그 (핵 산 얼룩) agarose 젤 전기 이동 법으로 및 UV 빛에서 오렌지 색상으로 표시 하는 intercalating 에이전트입니다. 규제 기관 중 발암 물질 18로 분류 하지만 돌이킬 수 없는 돌연변이 효과의 가능한 위험 실험 동물에서 발생 합니다. 따라서, 우리가 포함 된 화학 위험 폐기물로 EtBr 사용된 agarose 젤과 전기 이동 법 버퍼 수집과 Rutgers 환경 건강 요청 & 안전 (REHS)를 선택 하 고 안전 하 게 처분 하. - Agarose 젤 941에 EtBr 형광 밴드를 포함 하는 한 조각 잘라 bp, 260 nm 파장에서 흡수 밀도 (OD)를 측정 하 여 정량화는 분 광 광도 계에 따라 DNA 젤 추출 키트, 젤에서 hPER2P 조각 정화.
- 정한 반딧불 luciferase 식 벡터: pGL의 선형화 1.0 µ L (1 µ g) [Luc2P / 네오] 단계 1.2.1-1.2.2에 설명 된 대로 동일한 방법으로. 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 위에서 설명한 뒤 DNA 정리 키트는 벡터를 추출.
- 선형화 벡터: pGL에는 hPER2P 선 [Luc2P / 네오].
참고: 제조 업체 당 ' s 명령, 삽입 및 벡터의 이상적인 어 금 니 비율 2:1입니다. 50 ng 벡터, 삽입의 이상적인 금액은 23.6로 계산 수식, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb 벡터와 ng] (2/1) x 23.6 ng 삽입 =]. HPER2P의 농도에 따라 (7.26 ng / µ L) 및: pGL [Luc2P / 네오] (50 ng / µ L), 50 ng: pGL의 볼륨 [Luc2P / 네오] 23.6 ng hPER2P 각각 1 µ L 3.26 µ L로 계산 됩니다.- 추가 2 µ L T4 DNA 리가 반응 버퍼 (10 배) (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl 2, 1 mM ATP, 그리고 10 mM DTT), 3.26 µ L (23.6 ng) hPER2P, 1 µ L (50 기): pGL [Luc2P / 네오], 13.74 µ L 물 최대 20 µ L 부드럽게 혼합.
- 1 µ L T4 DNA 리가 (400 단위 / µ L) 추가 부드럽게 혼합 고 thermocycler, 하룻밤 사이에 16 ° C에서 품 어, 다음 제조 업체 마다 얼음에 합자 벡터 진정 ' s 지시.
- 합자 벡터: pGL 변환 [hPer2P / Luc2P / 네오] 화학적으로 유능한 대장균을 19.
- 42 ° c, catabolite 억압 (S.O.C.) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 따뜻한 물 목욕을 설정 (2 %Tryptone, 0.5% 효 모 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl 2, 10 m m MgSO 4 및 20 m m 포도 당) 실 온에서 Luria Bertani (파운드) 한 천 배지 (100 µ g/mL 암 피 실린, 80 µ g/mL X gal 및 0.5 µ M IPTG 포함) 37 ° C 배양 기에서 따뜻하게 하 고 얼음에 녹여 각 변환에 대 한 세포의 유능한 대장균 한 유리병.
- 추가 6 µ L (21 기) 벡터 또는 1 µ L 출혈 (30 ng) 화학적 유능한 대장균 (50 µ L)에의 한 튜브를 벡터 (부정적인 제어)을 다음 부드럽게 혼합 튜브를 플립. 30 분에 대 한 얼음에 품 어
- 30 42 ° C 물 욕조에 충격 열 동요 없이 하 고 얼음을 반환 s
- 블루/화이트 심사를 사용 하 여 합자 벡터와 변형 대장균 식민지 선택.
- 변환 된 대장균에 추가 250 µ L S.O.C. 매체 튜브 및 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.
- 10-50 µ L의 변형된 대장균 파운드 한 천 격판덮개의 표면에 균일 하 게 확산. 넣어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.
참고: 효율적인 복제 반응 몇 백 식민지를 생산 한다. 두 개의 다른 볼륨을 도금 적어도 하나의 접시 큰, 분명 흰색 또는 파란색 색상과 잘 간격된 식민지 해야한다 되도록 것이 좋습니다. 식민지는 너무 작은 때 색상은 구별할 수 10 배 (50 X) 현미경을 사용 하 여 도움이 됩니다. - 소독된 치아 막대기, 격판덮개에서 3-6 백색 식민지를 선택 하 고 50 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 문화 매체의 4 mL를 포함 하는 하나의 문화 관으로 각 식민지를 놓습니다.
- 200 rpm에서 밤새 흔들어 37 ° C에서 튜브를 품 어. 4 mL의 2 개 mL를 사용 하 여 DNA를 추출 플라스 미드 DNA 추출 미니 준비 키트 제조 업체 당 대장균 배양 ' s 지시.
- 확인 하 고 삽입을 분석 (hPER2P, 941 bp)
- 플라스 미드 DNA 제한 효소로 소화 하 고 삽입 확인 하십시오 단계 1.2.1-1.2.3에 설명 된 대로 전기 이동 법을 실행.
참고: 긍정적인 제어 (hPER2P 단계 1.2.4에서 정화) 부정적인 제어 (대장균 빈 벡터와 변형)에 포함 된 및. - 방향 19 플라스 미드 삽입의 순서를 확인 하려면 M13 앞으로 및 역방향 M13 뇌관을 사용 하 여 선택 된 플라스 미드 DNA 시퀀스.
주: 전기 및 올바른 방향에 hPER2P 및 시퀀싱 결과에서 시퀀스의 정확한 크기와 삽입을 했다 단 하나 식민지가 선정 됐다. - 인간의 PER2 발기인 조각 분석 (hPER2P, 941 bp) CCAATC, 전자 상자 모티브 (Bmal1 바인딩 사이트, 고양이/CGTG)를 포함 하 여 circadian 규제 요소에 대 한 시퀀싱 GC 상자, 및 녹음 방송 시작 사이트 (CAGCGG) 20.
- 플라스 미드 DNA 제한 효소로 소화 하 고 삽입 확인 하십시오 단계 1.2.1-1.2.3에 설명 된 대로 전기 이동 법을 실행.
- 증폭 추가 하 여 선택 된 대장균 남은 2 mL 200 mL 파운드 문화 매체 50 µ g/mL 암 피 실린 포함 하 고 다음 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 하룻밤 배양으로 대장균 배양.
- 추출 DNA 플라스 미드도 없는 맥시와 당 키트 준비 제조 업체 ' s 명령 후는 분 광 광도 계와 OD 260 nm 파장에서 측정 하 여 계량 하는 고. 약 수와 저장소 플라스 미드 DNA: pGL [hPer2P/Luc2P/네오], 나중에 사용-80 ° C 냉장고.
2. 일시적인 Transfection
- 구매 문화 MCF10A 셀
- 구입 상업에서 불멸 하 게 하 고, 변형 비 정상적인 인간 유 방 상피 세포 라인 (MCF10A) 세포 은행, 셀 cytogenetically는 어디 테스트와 함께 인증 된 짧은 탠덤 반복 동결 하기 전에 분석. 해 동 하 고 유지 하는 최대 8 주 문화에 냉동된 셀의 각 유리병.
참고: 다른 세포와 달리이 세포 있다 접촉 금지 그들은 ~ 70% 합류에 도착. 그 하위 ~ 70%에서 실시는 필요 합니다. - 유 방 상피 기저 매체 (MEBM), 성장 보조 제, 그리고 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2에서 셀 문화 인큐베이터에서 콜레라 독 소 유 방 상피 세포 성장 매체 (MEGM), 셀 문화.
참고: 준비-사용 성장 요인 제공 하는 SingleQuot (SQ)를 구매 하 고 별도로 콜레라 독 소를 얻을. 성장 보충의 최종 농도 0.4% 소 뇌 하 수 체 추출, 0.1% 인슐린, 0.1% 하이드로 코 티 손, 0.1% 인간 표 피 성장 인자, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 0.05 %gentamycin 황산 및 0.05% 암포 B. - 10 mL 트립 신/대 한 EDTA를 가진 외피에 의해 10 cm 배양 접시에 셀 해리 ~ 20 분 다음 10 mL trypsin 중화 솔루션을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 모든 셀 HEPES 소금물 (HBSS)를 버퍼링 하는 수집.
- 거꾸로 현미경 hemocytometer와 셀 단일 세포 현 탁 액의 농도 계산 하 고 필요에 따라 셀의 특정 숫자를 씨앗. 각 접시에 셀의 동등한 배급을 얻기 위해 철저 하 게 접시를 소용돌이 친다. 셀에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 품 어.
참고: 포함 된 트립 신/EDTA, 트립 신 중화 솔루션 및 사용 HBSS subculture 시 약 팩 구입.
- 구입 상업에서 불멸 하 게 하 고, 변형 비 정상적인 인간 유 방 상피 세포 라인 (MCF10A) 세포 은행, 셀 cytogenetically는 어디 테스트와 함께 인증 된 짧은 탠덤 반복 동결 하기 전에 분석. 해 동 하 고 유지 하는 최대 8 주 문화에 냉동된 셀의 각 유리병.
- 건설 circadian 벡터에 포함 된 셀의 과도 transfection.
- 35mm 문화에 균등 하 게 시드 2 x 10 5 MCF10A 세포 MEGM와 접시와 20-30% 합류 (다음 날)에 성장.
- 따뜻한은 감소를 혈 청 미디어 (예를 들어, Opti 메모리) 37 ° C 물 목욕과 transfection 시 약 30 분에 대 한 실 온에서 희석 플라스 미드 DNA 건설 (: pGL [hPer2P / Luc2P / 네오])와 엔도-독 소 무료 30 ng / µ L를 트리 스-EDTA (테) 버퍼 및 실내 온도 유지.
- 63.6 µ L 따뜻한 감소 된 혈 청 미디어를 먼저 추가한 다음 추가 33.4 µ L (0.1 µ g) 플라스 미드 DNA, 플라스 미드 transfection 혼합물 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서를 준비 하 고 pipetting, 하 transfection의 3 µ L에 마지막으로 추가 하 여 부드럽게 혼합 벽을 건드리지 않고 튜브의 센터에 직접 시 약. 부드럽게 pipetting으로 혼합, 후 30 분에 대 한 실 온에서 계속
- 접시에 매체의 센터 표면에 직접 전체 플라스 미드 혼합물 (100 µ L)를 삭제 하 고 요리를 떨고 하 여 부드럽게 섞는다. 추가 48-72 헤에 대 한 CO 2 배양 기에서 셀 문화
참고: 그것은 최고의 transfection 효율 그들의 접촉 저해에 때문에이 세포의 40-70% 합류에 있을 것을 예상은 ~ 70%. 따라서, transfection 작품에서 최고의 시작 ~에서 20% ~ 70% 합류.
3. 뚜렷이 페 MCF10A 세포의 체 외에 생물 발광 분석 결과의 설립
- 24 h. 위한 성장 인자 없이 MEBM에서 (후 48-72 h transfection) 합류 점 ~ 70%에서 경작된 한 세포를 굶 어
- 동기화 에이전트 (예를 들어, 50% 말 혈 청 (HS)) MEBM에 CO 2 배양 기에서 1.5 h에 대 한 세포 치료.
참고: 이상적인 동기화 에이전트, 10 µ M 산림, 1 nM 멜 라 토 닌, dexamethasone 0.1 µ M, 50 %HS, 및 100%의 선택을 위한 SQ 비교 되었다 circadian 진폭 및 기간 circadian 벡터 transfected 세포에. 100% 빈 벡터 transfected 세포 처리 됩니다 부정적인 컨트롤로 SQ. - Pre-prepare 20 mL 녹음 매체 (10-30mm 문화 요리)에 대 한 MEGM의 5 mL, 15 mL MEBM, 150 µ L 나트륨 중 탄산염, 200 µ L HEPES, 및 40 µ L 소를 추가 하 여 재고 솔루션 (50 mM) 50 mL 소독 원심 분리기 튜브에서.
참고: 각 부품의 최종 농도: 20% 광장 및 20 ng/mL 콜레라 독 소, 0.06% 나트륨 중 탄산염, 1% 페니실린/스, 그리고 10 mM HEPES. 따뜻하게 미리 준비 된 매체를 기록 하 고 37 ° C 물 욕조에 30 분 동안 1 x PBS를 소독. 사용 직전 100 µ M 소 추가. - 씻어 따뜻한 1 셀 Dulbecco x ' s Phosphate-Buffered 염 분 (D-PBS) 3에 대 한 동기화 에이전트와 함께 부 화 후 시간과 기록 매체 2 mL를 추가 합니다.
- 증발을 방지 하기 위해 다음 측에 레이블을 실리콘 윤활제를 사용 하 여 멸 균된 커버 클래스와 접시를 봉인.
- 밀폐 접시 루미 노, 안쪽 자리에 놓고 폴더에 파일 위치를 저장 하기 위한 옵션 (세부 사항, 섹션 6을 참조).
4. 안정적으로 페 셀 선택
- 최적화 제조 업체에 따라 죽 일 곡선 분석 결과와 이상적인 G418 농도 (800 µ g/mL) ' 안정적 transfected 세포의 선택에 대 한 지침 s.
- 48 h 또는 72 h에 대 한 과도 transfection, 후 subculture와 씨 5000 큰 요리에서 MEGM 셀 셀/접시 (100 mm). 24 시간 후 문화 (37 ° C, 습도 95%, 및 5% CO 2), 셀 문화 인큐베이터에서 매 3-4 일 2 주 동안 800 µ g/mL G418를 포함 하는 새로운 매체 오래 된 매체를 대체 하 여 G418의 800 µ g/mL로 세포 치료.
- Subculture 안정적으로 살아남은 500µg/mL G418 hPer2P/Luc2P의 안정적인 식 유지 하 고 차후 사용을 위해 액체 질소에서 동결을 포함 하는 MEGM와 함께 1-3 구절에 대 한 식민지 transfected.
- 생물 발광 분석 결과 생체 외에서의 결과에 생물 발광 강도 많은 구절에서 사용 후 점차적으로 낮은 경우 일반 subculture 셀의 안정적 transfected 인구를 다시 선택 후 500µg/mL G418 치료.
5. 화학 물질과 치료
- 에서
- 48 h 또는 72 h 후 transfection 24 헤에 대 한 MEBM에 성장 요인에서 세포를 굶 어
- 50% 동기화 후 2 시간에 대 한 HS 치료 0.25 m m 또는 0.5 m m nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527, 또는 MEBM 포함 하는 20 %1 h 1 µ M cambinol 셀 평방
- 1 세척 후 x D-PBS, 혼자, 또는 20 EX527 또는 셀에 1 µ M cambinol와 함께 중간 포함 12.5 µ M MSC 기록 추가. 모니터링은 루미 노와 생물 발광.
- 치료 안정적 transfected MCF10A / PER2-0.5, 1 또는 2 m m, 40 nm, EX527 또는 2.0 µ M, 50% 동기화 후 1 시간에 Cambinol에서 NMU dLuc 셀 HS, MSC의 중간 포함 12.5 µ M 기록에서 세포를 품 어 고 또는 n-진 (NAC)의 다른 복용량 (5, 10, 또는 20 µ M). 루미 노, 기록에에서 접시를 놓고 3.6 절에 설명 된 대로 4-8 일에는 생물 발광 루미 노에 의해 저장.
참고: NMU methylated nitrosourea 화합물, 발암 성, 변이 원 성 및 않았음 속성입니다. NMU는 직접 연기 alkylating 에이전트 있으며 짧은 반감기 (T 1/2 = ~ 30 분). 그것은 알칼리 성 상태 (pH 9-10)와 온도 20 ° c. 이상에서 불안정 하지만 산 성 상태 (pH 4-5)에서 안정 양측 검정 청소 벤치 표면 및 NMU soluti에 의해 잠재적으로 오염 하는 랩 실력에 대 한 효율적인 비활성화 요원으로 10%에서 표 백제를 사용 하는 따라서,. 남은 재고 솔루션은 선택 하 고 REHS에 의해 안전 하 게 폐기. 화학 물질의 행동의 모드에 따라, 동기화 된 세포는 녹음 매체에서 경작 하기 전에 짧은 시간에 대 한 치료 수 있습니다. 있으 나 셀 긴 시간 (몇 일) 녹화 매체에서 또한 대우 될 수 있다.
6. 데이터 수집, 분석, 및 프레 젠 테이 션
참고: 세포 생존 능력 표시 같은 시간에 대 한 동일한 농도에서 세포의 치료 후 표준 방법 (예: MTT 분석 결과)를 사용 하 여 결정 해야. 생체 외에서 생물 발광 분석 결과에서 사용 하는 모든 치료 농도 30% 치 사 농도 (LC30) 보다 낮은 했다. 모든 실험은 3 중에서 실시 됐다 그리고 대표 결과 발표 됐다.
- 로드 없이 H 2 O와 CO 2, 37 ° C에서 설정 하 고 컴퓨터에 연결 하는 인큐베이터 안에 유지 되는 루미 노에 좌석에 요리 접시 (3.5 단계) 씰링, 후.
- 클릭 " 저장 " 폴더 및 해당 요리에서 기록 된 발광 신호 저장할 파일 이름을 입력 하 고.
참고: 시스템에 발광 신호를 감지 개별 위치에서 접시에 셀에서 실시간. 신호 광 전 증폭 관 관 4-광자-카운트를 통해 컴퓨터에 전송 및 저장 및 데이터 수집 소프트웨어에 의해 컴퓨터에 표시 됩니다. - 4-7 일, 중간 변경 및 필요한 경우 두 번째 주에 대 한 지속적인 기록에 따라 수에 대 한 녹음 후 신호 분석.
참고: circadian 매개 변수, 위상, 기간 길이, 및 포함 한 리듬 진폭, 속도, 댐핑을 우리 루미 노 분석 소프트웨어를 사용 생물 발광 데이터를 분석. - 실행 평균, 원시 데이터를 detrend 하 고 기간, 위상, 진폭, 고 속도 21 , 22 감쇠를 사인파에 최고 맞는 분석.
- 치료 및 중간 변경 시 높은 과도 생물 발광으로 인해 분석에서 데이터의 첫 번째 사이클 제외.
- 데이터 프레 젠 테이 션에 대 한 플롯 시간 (h 또는 주)에 대 한 원시 데이터 (생물 발광, 수/s). 필요한 경우 데이터 기준선을 뺍니다 진폭 및 위상 비교를 그릴 수 있습니다.
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결과
Circadian 생물 발광 기자 벡터: 인간의 PER2 발기인 기반 표현의 정한 luciferase 변종
941 bp 조각으로 구성 된 DNA 순서: pGL circadian 기자 벡터를 생성 하는 데 사용 하는 인간의 PER2 발기인에서 파생 된 [hPer2P/Luc2P/Neo, 처음 규제 요소 규제 알려진 존재에 대 한 분석 circadian 진 식입니다. 생물 정보학 분석이 보여주었다이 발기인 조각 내는 3 개의 다른 Bmal1 바인딩 사이트 (E 상자) (고양이/CGTG), 두 circadian 전사 강화 사이트 (CCAATG), 두 개의 GC 상자 및 녹음 방송 시작 위치 (그림 1). 따라서이 기자 벡터 circadian 유전자 발현을 반영...
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토론
포유류 세포 주기 circadian 클록의 상호 transcriptional/변환 피드백 루프에 의해 통제 된다. Heterodimers의 Bmal1 시계 및 Npas2 코어 CGs, Per2 , 외침및 수많은 CCGs4등의 발기인의 E 상자 요소에 바인딩하여 circadian 전사 조절. 그들은 셀, heterodimers의 축적으로 당: 외침 post-translationally 수정 및 시계: Bmal1 transcriptional 활동을 억 누르기 위해 핵 수송. 이 부정적인 피드백 루프 코어를 CGs 자신의 녹음 방송 규제와 CGs와 CCGs23의 리듬 표현 설정 수 있습니다. 개별 셀에 시계 두 기본 조건 (예를 들면, 산화 환 원 잠재력)에 의해 동기화 할 수 있습니다 비록 대부분 포유류 세포는 본질적인 circadian 시계, 및 외부 환경 자극24<...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품으로는 2012 사회의 독성 (SOT) 지원 되었다-그렇지 연구 (M. 팡) Colgate Palmolive 그랜트와 국제 협력 연구 기금 동물 및 식물 검역 기관, 한국 공화국 (M. 팡), 그리고는 NIEHS 부여 P30ES005022 (H. Zarbl). 우리는 그의 도움이 토론, 씨 Shao-An 후안 그의 실험적인 지원을, 및 그녀의 증거 독서에 대 한 양 키 미 나카타 첸 청 (맥 거 번의과 대학 대학에서 휴스턴에서 건강 과학 센터 택 사스의) 감사 하 고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] 벡터 | SwitchGear Genomics | S700000 | 맞춤형 벡터 |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] 벡터 | Promega | 9PIE673 | 불안정화된 루시페라아제 발현 벡터 |
| T4 DNA 리가제 | Invitrogen | 15224041 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | |||
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | 제한 효소 |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | 제한 효소 |
| CutSmart 버퍼 | New England BioLabs | B7204S | 제한 효소 버퍼 |
| DNA 젤 추출 키트 | Qiagen | 28704 | 아가로스 젤 PCR 정제 키트에서 DNA 단편 정제 |
| Qiagen | 28104 | DNA 클린 | |
| 업 LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | 변형된 대장균 배양용 |
| LB 한천 플레이트 | TEKNOVA | L1902 | 흰색/파란색 선택 |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | 플라스미드 DNA 추출용 |
| EndoFree 플라스미드 맥시 준비 키트 | Qiagen | 12362 | 플라스미드 DNA 추출용 |
| FuGene HD | Promega | E2311 | 트랜스펙션 시약 |
| Opti-MEM 감소 혈청 배지 | Invitrogen | 31985-062 | 트랜스펙션 |
| MCF10A 세포주 | 미국형 배양 컬렉션 | CRL-10317 | 유방 상피 세포 |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | 유방 상피 성장 배지 |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | 유방 상피 기저 매체 |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | 용품 및 성장 인자 |
| 시약Pack | Lonza | CC-5034 | 계대 배양 |
| 용 시약 D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | 배양 접시에서 세포 세척 |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | 묽은 10X D-PBS |
| 조직 배양 접시 (35 mm) | BD / Falcon | 353001 | 세포 배양 접시 LumiCycle |
| 실리콘 그리스 | Fisher에 적합 | NC9044707 | 기록 매체로 접시를 밀봉하기 위해 |
| 원형 커버 유리 | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | 기록 매체로 접시를 밀봉하기 위해 |
| Sigma | C8052 | 성장 매체 | |
| G418 황산염 (Geniticin) | 을 위한 보충제 Invitrogen | 10131035 | stabliy transfected cells 암 |
| 피실린 | 선택을 위한 항생제시그마 | A9393 | 콜로니 선택용 |
| 포스콜린 | 시그마 | F6886 | 동기화 에이전트 |
| 멜라토닌 | 시그마 | M5250 | 동기화 에이전트 |
| 덱사메타손 | 시그마 | D4902 | 동기화 에이전트 |
| 호스 세럼 | 시그마 | H1138 | 동기화 에이전트 |
| D-루시페린, 나트륨 염 | Invitrogen | L2912 | 루시페라제 기질 |
| IC261 | Sigma | 10658 | 일주기 교란 물질에 대한 양성 대조 |
| 메틸니트로소우레아(NMU) | Sigma | N1517 | 유방 특이 발암물질 |
| 메틸셀레노시스테인(MSC) | Sigma | M6680 | 유기 셀레늄(화학반응제) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 특이적 억제제 |
| 캄비놀 | 시그마 | C0494 | SIRT1 & SIRT2 억제제 |
| NanoDrop 분광 광도계 | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | 정량화 뉴클레오티드 |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | 분자 생물학 실험용 |
| CO2 인큐베이터 | NAPCO | 시리즈 8000 DH | 37°C에서 5% CO2에서 세포 배양용; C |
| 리프레저레이터가 있는 탁상용 원심분리기 | Eppendorf | 5430R | 분자생물학 실험용 |
| 스윙 버킷이 있는 원심분리기 | Eppendorf | 5810 R | 세포 배양용 |
| 도립 현미경 | Nikon | 80124 | 위상차 선택적 |
| 조직 배양 후드 | Labconco | Class II A2 | BSL-2 인증 |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | 를 사용할 수 없음 | 광도 검출기 |
참고문헌
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