인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 루 경화 증 (ALS), 밀접 하 게 관련된 프리온 질환 등 신경 퇴행 성 질환은 proteinopathies의 점진적인 축적에 의해 특징 세제 불용 성 단백질 집계 동반 인지 뇌에서 떨어진다. ^{1 , 2} 이 공유 병 적인 기능 이상 이러한 신경 퇴행 성 질환의 병 인에 중심 역할을 담당할 생각 이다. ² 이러한 집계 일반적으로 β크로스 misfolded 단백질 전시의 단위를 반복으로 구성 된 고분자 녹말 체 섬유의 구성-구조. ^{1 , 2 , 3 , 4} 화학적, 녹말 체 집계는 화학 또는 열 변성을 가용 화, 그들의 정화, 분석에 독특한 도전을 선물 한다³ 높은 저항 하 고 전통적인 생 화 확 적인 기술을 통해 공부. ^{2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} unsurprisingly, 세제 불용 성 단백질 분수가 되었습니다 misfolded 단백질의 축적을 포함 하는 신경 퇴행 성 질환의 이상으로 많은 연구의 초점. ^{6 , 12 , 13 , 14}

생 화 확 적인 분류 기법 종종 사후 뇌 homogenates에서 세제 불용 성 부분을 풍부 하 게 이용 되어 있다. ^{6 , 12 , 13 , 14} 가장 일반적인 방법 중 하나는 버퍼와 조직 homogenates의 연속 추출과 엄중, 가용성과 불용 성 부분을 분할 하는 ultracentrifugation 다음 증가의 세제 포함 됩니다. 일반적으로 사용 되는 순차 분류 프로토콜^6,14 세제 무료 낮은 소금 (LS) 버퍼에서 냉동된 조직 샘플의 균질 화를 포함 하 고 결과 불용 성 펠 릿은 다음 순차적으로 추출 높은 소금, 비 이온 세제, 높은 자당을 포함 하는 버퍼, 이온 세제 그리고 마지막으로 chaotropes 요소 처럼. ^{6 , 14} 이러한 순차적 분별 프로토콜의 명백한 결점은 상당한 시간과 노동 투입을 완료 하는 데 필요한. 균질과 ultracentrifugation를 포함 하 여 전형적인 5 단계 분류 프로토콜 걸릴 수 있습니다 몇 시간 또는 일. ^{4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18} 또한, 많은 pathologic 단백질 집계 남아 모든 가혹한 조건^19,20 하지만 불용 성 생성 된 분수의 대부분은 제한 된 값의. 따라서, 높은 소금 농도 및 비 이온 세제 덜 엄격한 분류 단계 크게 중복 됩니다.

이전 연구는 이온 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 단순화 된 단일 단계 세제 분별 프로토콜에 대 한 우수한 후보 나타났습니다. ^{5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23} 변성 세제로 sarkosyl는 충분히 solubilizing misfolded 단백질 집계 베타-아 밀 로이드 (Aβ),^{6,11의 구성 없이 뇌에서 기본적으로 접힌된 단백질의 대부분을 solubilize 엄격한} phosphorylated 타우 (pTau),⁶ 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43),¹⁴ 알파 synuclein,^12,13 scrapie,²³ 또는 u 1 작은 핵 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) u 1-70 K 등. ^{5 , 21 , 22} Sarkosyl 유비 쿼터 스 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 보다 덜 엄격으로, SDS 처리를 견딜 수 없는 misfolded 단백질 집계의 덜 강력한 oligomeric 형태 유지 합니다. ⁹

이전에 우리는 더 힘 드는 순차 분류 방법론에 유사한 결과 달성 하는 약식된 세제 분별 프로토콜을 설명 합니다. ⁵ 덜 엄격한 분류 단계를 생략 하 여 우리 수 있었다 사후 인간의 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 손쉬운 단일 단계 분류 프로토콜을 개발. ⁵ 여기에 설명 된이 상세한 프로토콜 서쪽에 게 더 럽 히기에서 배열 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 적합 하 고 기능적인 단백질 misfolding 및 집계 시드를 질량 분석 기반 단백질 분석 실험. ^{5 , 6 , 21}

윤리 성명: 모든 뇌 조직에 모리 츠에서 가져온 ' s 질환 연구 센터 (ADRC) 두뇌 은행. 인간의 사후 조직 적절 한 제도적 검토 위원회 (IRB) 프로토콜에서 인수 했다.

1. 균질 및 분류

1. 조직 선택
   참고: 사후 담당 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 고정 광고 사례를 확인된은 모리에서 선정 되었다 ADRC 두뇌 은행 (n = 2). 녹말 체 패 배포의 사후 neuropathological 평가 츠에 대 한 레지스트리를 설정 하는 컨소시엄에 따르면 수행 했다 ' s 질병 반 정량적 기준 ²⁴, 비록 득점 neurofibrillary 얽힌 병리학 Braak 준비 시스템에 따라 평가 했다. ¹⁶
   1. 얻기 냉동 사후 뇌 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 확인 광고의 경우. 드라이 아이스, 집게 및 면도날의 컨테이너를 활용 하 여, 소비 세 ~ 250mg 부분 tared 일회용에 각 조직 샘플에서 회색 물질의 무게 배, 조직 해빙 하지 않도록 돌보는. 무 균 수를 각 작품의 무게를 기록.
   2. 소비 세 ~ 250mg의 회색 문제를 사용 하 여 집게와 면도기 시각적으로 검사 하 여 외부 회색 물질과 내부 백색 질 사이의 인터페이스를 찾습니다. 백색 질 및 더 중요 한 것은, 어떤 큰 혈관 또는 살 벌 한 지역, meninges, 또는 거미 집 모양의 메이 터. 신속 하 게 작업 하 고 자주 폴리스 티 렌 용기 마른 얼음에 뇌 조직으로 무게 배를 배치 하 여 절단 과정에서 냉동 조직 유지
   3. Excised 분석 균형을 사용 하 여 각 냉동된 조각에서 회색 물질의 정확한 무게를 기록 합니다. 계산 볼륨 낮은 소금 (LS) 버퍼의 dounce 균질 (5 mL/g 또는 20 %w / v)에 대 한 필요 (표 1 참조).
   4. 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 및 얼음에 진정 x 1 준비 10 mL LS 버퍼
   5. 무게 조직과 무게 보트에서 제거 드라이 아이스와 약 2 x 2 m m 조각으로 주사위로 그것은 녹은. 얼음에 2 mL 미리 냉장된 dounce 균질 화기 튜브에 전송
   6. 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 X 1와 차가운 낮은 소금 (LS) 버퍼의 5 mL/g (20 %w / v) 추가.
   7. Homogenize 높은 클리어런스 유 봉 A와 낮은 클리어런스 유 봉 b.의 15 획의 약 10 타를 사용 하 여 얼음에 뇌 조직
   8. 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 2 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 모든 homogenate를 전송. 와 함께 튜브 라벨 “ 일 ” (총 Homogenate), 조직의 경우 수, 그리고 homogenate 볼륨. 약 수 0.8 mL 레이블이 1.5 mL 튜브에. 어떤 과잉 homogenate 수 마찬가지로 aliquoted-80에 저장 ° c.
   9. 각 0.8 mL aliquot, 추가 100 µ L 각 5 M NaCl 및 10% (w/v) sarkosyl의 농도 0.5 M 및 1 %w / v, 각각. 반전에 의해 잘 튜브를 혼합 하 고 15 분 레이블 튜브에 대 한 얼음에 품 어 " TH-S " (총 Homogenate-Sarkosyl)는 homogenates sarkosyl-버퍼 (표 1)에 나타냅니다.
   10. 얼음에 30% 진폭에서 3 5의 펄스에 대 한 각 튜브를 sonicate (최대 강도 = 40%) 사용 하 여 microtip 프로브.
   11. bicinchoninic 산 (BCA)를 사용 하 여 homogenates의 단백질 농도 시험 ²⁵ 확인 방법.
       참고: 조직의 그램 당 5 mL LS에서 일 S homogenates의 평균 단백질 농도 15 ~ 20 mg/mL. homogenates 수 수 즉시 분류 한 또는 사용까지-80 ° C에 저장.
   12. 10 mg/ml 1 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 x 차가운 사크 버퍼 (표 1)를 사용 하 여 희석 TH-S homogenates.
   13. 전송 5 mg 단백질 (0.5 mL) 500 µ L 폴 리 카보 네이트 ultracentrifuge 튜브와 쌍-균형 사크 버퍼에 각 TH-S homogenate의. 미리 냉장된 회전자와 180000 x g 1.5 mL 튜브에 4 ° c. sarkosyl-수용 성 전송 supernatants (S1)에서 30 분에서 ultracentrifuge에 튜브를 로드 하 고-80에서 저장 ° c.
       참고: 사크-버퍼는 ultracentrifuge의 (선택적 세척) 추가 200 µ L 튜브 세제 불용 성 분수 (P1)를 포함 하 고 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 ultracentrifuge 튜브의 아래쪽에서 펠 릿 (P1)를 꺼내 려.
   2-3 s
   14. 짧게 펄스-스핀은 거꾸로 튜브 (≤ 2500 x g) 아래 1.5 mL 튜브에 펠 릿 (P1) 및 버퍼 전송 microcentrifuge에. 펠 릿 중단 되도록 아래로 pipetting으로 사크 버퍼에서 불용 성 펠 릿 (P1) resuspend.
   15. 쌍-균형, 그리고 4에서 추가 30 분 180000 x g에서 원심 분리기 ° c.
   16. 선택적 세척 상쾌한 (S2)를 폐기 하 고 1 요소 버퍼 (표 1)의 50-75 µ L에서 sarkosyl-불용 성 펠 릿 (P2)를 품 어 그림 (프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일) 실 온에서 30 분 동안 solubilize x는 펠 릿.
       참고: 따뜻한 요소 버퍼 SDS 강수량을 피하기 위해 사용 하기 전에 실내 온도에. 세제에 민감한 애플리케이션을 위해 요소 버퍼에서 SDS를 생략 하 고 요소 버퍼에 resuspending 전에 낮은 소금 버퍼에 불용 성 펠 렛 (P2) 세척을 고려.
   17. 0.5 mL 튜브에 resuspended 펠 릿 (P2)을 전송 하 고 간단한 사용 (1 s) 20% 진폭 microtip 쥡니다 (최대 강도 = 40%)을 완벽 하 게 알 약을 solubilize.
   18. Sarkosyl-수용 성 (S1)의 단백질 농도 결정 하 고-BCA를 사용 하 여 불용 성 (P2) 분수 시험 방법. 이 분수를 사용 하 여 즉시 또는 사용까지-80 ° C에 저장.

2. Immunoblotting

서양 blotting
1. 
   참고: 약간의 수정을 이전에 보고 된 절차에 따라 수행 했다 서쪽 blotting. ^{5 , 10}
   1. 준비 40 µ g 샘플 총 homogenates (TH-S), 사크 성 (S1) 및 5 mM의 TCEP ph 7 1 X Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼에 사크-불용 성 (P2) 분수의. 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 품 어
   2. 부하 샘플에는 캐스트 10 잘 4-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤. 첫 번째 센티미터 (10 분)에 대 한 V 80와 120 V 나머지 (60 분)에 대 한 또는 추적 염료는 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 electrophorese.
   3. 신선한 면도날과 젤 칼 분할-오픈 프리 카스트 젤 카세트를 사용 합니다. 부드럽게 버려야 빗과 신선한 면도날으로 젤의 끝.
   4. Pipetting으로 그림 고 아래로 1 x 200 µ l 사크-버퍼에 불용 성 펠 릿 (P1) resuspend.
   5. 0.2 µ m 니트로 막 더 럽 히 기계에 건조 전송 메서드를 사용 하 여 전송 (자료 표 참조).
   6. 차단 BB와 뒤를 0.05% 블로킹 버퍼 (BB) 트윈 20 30 분 없이 막 30 분 트윈 20 (BB/T). 차단, 후 린스 TBS/T에서 막 (0.1% Tween 20) 5 분 초과 차단 버퍼 제거.
   7. 준비 1:1,000 희석 주 항 체 pT231, 타우-2 (팬 타우), AT8의 그리고 BB/T에서 EEA1 (0.05% 트윈 20).
   8. 원형 동요와 4 ° C에서 하룻밤 1 차적인 항 체 솔루션에 막 품 어. 3 x 15 분에 대 한 큰 술/T에 막 씻어
   9. 어둠 통에 붙일 레이블 근처-적외선 이차 항 체의 BB/T에 실 온에서 60 분에 대 한 1:20,000 희석와 막 조사. Tbs.에 3 x 10 분 TBS/T와 2 x 5 분 막 씻어
   10. 스캔 이미징 시스템 (예: 700 nm (빨강 채널) 적외선 염료 680 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) 보조와 800 nm (녹색 채널) 적외선 염료 790 당나귀-토끼 IgG (H + L에 대 한 적절 한 여기 파장에는 적외선을 사용 하 여 막 보조)).
   11. 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 신호 강도 계량 제조자에 의하여 densitometry 측정 수행을 ' s 지시, 평균 전체 배경 설정 자동 배경 설정 보장.

축약된 한 단계 sarkosyl-분별 프로토콜 제어 및 광고 사후 뇌 (그림 1)에서 세제 불용 성 단백질 집계를 풍부 하 게 사용 되었다. TH-S, S1, S2, P2 분수에서 단백질 SDS-PAGE, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼와 부드러운 얼룩 뒤에 15 분에 대 한 고정 해결 했다. 때문에 s 2 분수에 단백질의 탐지 수준 물의 resuspension 단계는 선택 사항 (1.1.14 참조). 서쪽 오 점 분석 (그림 2A 와 B) 광고 두뇌 pathologic 높은 분자 무게 phosphorylated 타우 집계 했다 sarkosyl-불용 성, 그리고 아주 작은 pTau에 남아 있었다 명확 하 게 설명 합니다 sarkosyl-수용 성 분수입니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 반대로 제어 두뇌에 있는 pTau의 대다수 sarkosyl 수용 성 부분으로 분할. 5 , 6 , 10 반면, EEA1 주로 파티션을 제어 및 광고 뇌 (그림 2C) S1 분수에. 여기, EEA1는 본질적으로 sarkosyl 성5가장 기본, 비-pathologic 단백질에 대 한 일반 마커 역할을 합니다. 특히, EEA1의 작은 풀 가능성이 sarkosyl-불용 성,이 특정 항 체로 서쪽 오 점 하 여 탐지의 한계 아래 아직 나타내는 일 S 분수에 비해 녹는 분수 (S1)에서 EEA1에 대 한 약간은 덜 신호가입니다. 그것은 동등 하 게 가능한 수용 성 분수 (S1)에서 EEA1의 신호 강도에 약간의 감소 ultracentrifuge 튜브에 EEA1의 비 특정 바인딩 때문입니다 또한 예상된 결과에서 약간의 편차를 설명할 수 있다.

벤치 마크 (그림 3B), 전통적인 다중 단계 순차 분류 방법론에 대 한 약식된 단일 단계 분류 프로토콜 (그림 3A)의 효능 sarkosyl 불 용해성의 상대적 수준 녹말 체 선구자 단백질 (APP), 타우 (MAPT), 작은 핵 ribonucleoprotein U1-70 K (snRNP70)와 apolipoprotein E (APOE) 풀링된 제어 (Ctl), 가벼운 인지 장애 (MCI)에 걸쳐 레이블 무료 질량 분석 (MS) 기반 단백질에 의해 비교 되었다 및 광고 이전에서 사례 연구7,18 (그림 3). 세제 불용 성 애플 리 케이 션의 측정은 효과적으로 Aβ 펩 티 드를, 모든 완전히 tryptic APP 펩 티 드 정량으로 전체 길이 695 잔류물 APP 단백질7의 Aβ 영역에 매핑된 나타냅니다. 두 방법으로 모두 4 pathologic 단백질의 sarkosyl-불용 성 수준 인지 감소와 병 적인 부담 강한 상관 관계와 함께 일관 된 컨트롤에 상대적인 MCI 및 광고 경우에 위쪽으로 줍니다. 전반적으로, 농축 세제 불용 성 분수 (P2)에이 단백질의 현저 하 게 일관 된 단일 단계18 및 다단계 분류 프로토콜7를 사용 하 여 했다.

그러나, 유리 또는 정확한 특성에 따라 해로운 증명할 수 있는 두 가지 방법론 및 개별 실험의 목표 간의 약간의 차이가 있다. 그림 3 에 요약 비교 proteomic 데이터 특정 실험적인 매개 변수 및 응용 프로그램에 따라 사용 하는 프로토콜을 알릴 수 있습니다. 하나는 예상 하듯이, 일반 절충 샘플 농축 및 순도, 다단계 방법 보다 적은 단백질 손실 더 풍부한 샘플을 affording 단순화 된 분류 프로토콜입니다.

예를 들어 제어 불용 성 분수 (그림 3A) 간단한 프로토콜을 사용 하 여 준비 다단계 접근 방식을 통해 준비 보다 질병 관련 단백질의 약간 높은 배경 수준을 전시 한다. 반대로, 단일 단계 분류 기법 손실을 크게 줄일 수 있습니다 전반적인 샘플으로 낮은 풍부한 단백질에 대 한 유리한 수 있습니다. 예를 들어, MCI의 경우 sarkosyl-불용 성 APOE의 상대 농축 약식된 프로토콜(그림 3)을통해 준비 하는 불용 성 분수에 크게 높은 수준 이다.

두 방법 모두는 질병 관련 또는 pathologic misfolded 단백질 집계, 더 수많은에 상당한 증가 관찰 하는 것 보다 더 적절 한 광범위 한 분류 및 다단계 방식의 세척 단계 청소기를 생성할 수 있습니다 그리고 좀 더 구체적인 proteomic 서명입니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 데이터 단일 단계 분류 방법은 타우 neurofibrillary tangles (NFTs), Aβ 플 라크 등 scrapie prions 홍보 (Sc) pathologic 집계 sarkosyl에 용 해 되지 않습니다 게시 된 결과와 일치 한지 확인 그러나 기본적으로 접혀 들 유지 성. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26

컨트롤의 세제 불용 성 조각으로 분할 하는 단백질의 상대적 금액을 계산 하 여 (n = 3) 및 광고 (n = 3) 두뇌 (표 2)만 ~ 총 단백질 풀의 10%는 sarkosyl-불용 성. 때 뇌 homogenate (TH-S)의 5 mg 총 단백질은 분류 한, 10.4%와 11.3%는 프로테옴의 파티션을 제어 및 광고의 경우, 세제 불용 성 부분에 각각. 두 그룹 간에 큰 차이가 관찰 했다 광고 두뇌에서 풍성 하 게 하는 sarkosyl-불용 성 단백질의 총 금액은 컨트롤 보다 약간 더 높은, (p = 0.703). 이 단백질 misfolding 및 집계 광고 뇌에 광범위 하 게는 하지만 오히려 타우, Aβ 및 U1 등 단백질의 좁고 특정 하위 집합 제한 snRNPs을 나타냅니다. 7 , 21 , 22

그림 1: Sarkosyl 분류 계획. (A) A 사후 인간의 뇌 후 sarkosyl와 NaCl 각각 1 %w / v, 0.5 M의 최종 농도에 추가 되었고 얼음에 15 분 동안 incubated 낮은 소금 버퍼에서 무 균 했다. 쥡니다, 후는 homogenates 했다 분류 일 분 sarkosyl-수용 성 상쾌한 (S1)와 sarkosyl-불용 성 펠 렛 (P1)을 affording 180000 x g 에서 ultracentrifugation에 의해. P1 펠 릿 ultracentrifugation 최종 sarkosyl-불용 성 펠 렛 (P2)을 감당할 여 사크 버퍼와 다시 sedimented 세척 (선택적으로) 이었다. 이 P2 분수 깨끗 한 microtip 프로브와 3 x 5의 쥡니다 뒤 실 온에서 30 분 동안 요소 버퍼에서 solubilized 했다. (B) 단백질 (20 µ g) TH-S, S1, s 2에서 (10 µ L) 및 P2 분수 SDS 페이지, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼 하룻밤 실 온에서 부드러운 얼룩 뒤에 15 분 동안 고정 확인 했다.com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"target ="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 광고 두뇌의 세제 불용 성 부분에 phosphorylated 타우의 농축. (A 와 B) 단백질 (40 μ g) 총 (TH-S)의 성 (S1)과 불용 성 (P2) 분수 했다 트레오닌 231 (pT231)에 phosphorylated 타우에 대 한 항 체와 얼룩이 또는 AT8 (pSer202, pThr205)에서 pathologic 인 타우 종족의 농축을 입증 하는 광고 두뇌의 불용 성 부분 (P2)입니다. 광고 뇌에서 높은 분자량 집계 타우 세제 불용 성 (P2) 분수에 독점적으로 분할. (C) EEA1 수용 성 단백질 마커 및 총 (TH-S)와 제어 및 광고 두뇌의 용 해 (S1) 분수에 대 한 상대적 로드 제어로 제공. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 단일 단계 또는 여러 단계로 분류 프로토콜을 사용 하 여 pathologic 광고 단백질의 Proteomic 분석. 대표 sarkosyl-불용 성 단백질 응용 프로그램 (Aβ), 타우, snRNP70의 상대 수준 (K u 1-70) 및 다른 질병 사이 APOE 풀링 제어, (A) 단일 단계 또는 여러 단계 (B) sarkosyl를 사용 하 여 MCI 및 광고 사례 분류 방법입니다. 두 데이터 집합에 대 한 단백질 수준 선수 (Psm) 이들의 단백질, 식별 및 100 최대를 설정 하는 정규화 스펙트럼 펩 티 드에 의해 추정 되었다. 제어, MCI, 및 광고의 경우에서 Psm (n = 5 각) 집합 단일 데이터 집합에 대 한 사용 되었다. 다단계 접근, 제어의 2 개의 복제 수영장에서 Psm에 대 한 MCI 및 광고의 경우 (n = 5 각) 분석 했다. 오차 막대는 평균 ± S.E.M.의 값을 나타내는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 버퍼 목록입니다.

표 2: 단백질 양을 sarkosyl-불용 성 분수 (P2)에. 평균, 단백질의 비율을 제어의 sarkosyl-불용 성 부분으로 분할 (n= 3) 및 광고 (n= 3) 두뇌는 각각 10.4%와 11.3%, 이었다. 의해 입증 제어 및 광고 뇌에서 sarkosyl-불용 성 단백질의 양의 통계적으로 유의 한 차이가 없었다는 학생의 t-테스트 (p = 0.703)와 평균 (S.E.M.) 값의 표준 오차.

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