방법 논문

신생아 Hypoxic-허 혈 성 뇌 손상의 마우스 모델에서 Neurobehavioral 평가

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DOI:

10.3791/55838

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2017년 11월 24일

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1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

이 논문에서

요약

우리는 출생 후 하루에 일방적인 경 동맥 폐색을 수행 7-10 CD-1 신생아 hypoxic-허 혈 성 (HI) 모델을 만드는 새끼 마우스와 뇌 손상의 영향을 조사. 우리는 운영 되지 않은 정상 쥐에 비해 이러한 마우스 neurobehavioral 함수 공부.

초록

우리 신생아 hypoxic-허 혈 성 (HI) 모델을 만들려면 CD-1 마우스에 일방적인 경 동맥 폐색을 수행 하 고 비 운영 (즉, 에 비해 이러한 마우스 neurobehavioral 함수를 공부 하 여 신생아이 뇌 손상의 영향을 조사 일반) 쥐입니다. 연구 기간 동안 쌀 있습니다 방법은 출생 후 하루 7-10 (p 7-10) 쥐에 신생아이 뇌 손상 유발 하 사용 되었다. 이 작업은 일방적인 경 동맥 결 찰 및 hypoxia (8% O2 와 90 분의 92% N2 )에 노출에 의해 새끼에서 수행 되었다. 수술 후, 1 주일 손상 된 두뇌 반투명 두개골을 통해 육안으로 평가 되었다 고 부재 ("대뇌 피 질의 부상" 그룹) 또는 피 질 손상의 존재 ("대뇌 피 질의 부상" 그룹)에 따라 하위 그룹으로 분류 했다 오른쪽 반구에 병 변을 등 주 6 일에 다음 neurobehavioral 테스트를 수행한 인식과 모터 기능을 평가 하기: 수동 회피 작업 (PAT), 사다리, 테스트 및 그립 강도 테스트. 이러한 행동 테스트 신생아이 뇌 손상의 효과 결정 하는 데 도움이 되 고 신경 퇴행 성 질환의 다른 마우스 모델에서 사용 됩니다. 이 연구에서 신생아 안녕 뇌 부상 쥐 우 반구 손상에 대응 하는 모터 적자를 보여주었다. 행동 테스트 결과 인간의 신생아이 환자, 뇌성 마비 등 신생아 뇌졸중 환자에서에서 관찰 하는 적자와 관련이 있습니다. 이 연구에서 신생아이 뇌 손상의 마우스 모델 그리고 설립 되었다 모터 적자와 비 운영 쥐에 비해 인지 장애의 다른 정도 보여주었다. 이 일이 마우스 모델에 기본 정보를 제공합니다. MRI 이미지 다른 고기, 모터 및 인지 테스트 구분 뇌 손상의 심각을 보여줍니다.

서론

신생아이 뇌 손상 초기 아 동기 (어린이 1000 당 약 2 명의 환자)1,2,3,,45발생합니다. 신생아이 뇌 손상에 관한 연구는 중요 한, 그리고는 설립된 신생아 안녕 뇌 부상 마우스 모델을 사용 하 여이 뇌 손상에 vivo에서 전 임상 연구를 촉진할 수 있다.

전통적인이 모델 성인 쥐6에 사용 됩니다. 신생아 모델에 대 한 쌀 있습니다 메서드는 P7 쥐7,8에 주로 사용 됩니다. 그러나, 때문에 쥐와 생쥐 약간 다른9,10, 비록 그들은 둘 다 설치류, 우리 수행 수정된 쌀 있습니다 방법 p 7-10, p 7-10 기간은 보여준 이전의 연구에 따라 CD-1 강아지에 특징 미 숙 oligodendrocytes, 인 간에 게 해당 용어 P011,12. 신생아이 마우스 모델 p 7-10 새끼에 모두 일방적인 경 동맥의 결 찰 및 8% 산소와 산소를 쥐의 노출을 통해 설정 됩니다.

쥐 오른쪽 반구의 posterolateral 영역에서 뇌 병 변의 다양 한 학위를 보여주 하는 절차를 거쳐야 합니다. 인식과 모터 적자, neurobehavioral 평가 팻에 따라 식별, 사다리, 테스트 및 그립 강도 테스트 수행 했다. 비 운영 (즉, 일반)와 쥐의 차이점 분석 되었다. 이 일이 마우스 모델에 대 한 기본 정보를 제공합니다. MRI 이미지에는 다른 고기, 모터 및 인지 테스트를 사용 하 여 뇌 손상의 심각도 따라 보여 줍니다.

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프로토콜

모든 동물 시설 평가 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC)에 대 한 협회에 의해 신임 된 주어진 음식에에서 대 한 표준 케이지 (27 × 22.5 × 14 cm3)에서 지 내게 및 광고 libitum 번갈아 12 h 빛/어둠 아래 물 사이클입니다. 저자 뒤 동물 보호 규정, 그리고 실험적인 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학 대학의과 대학에 의해 승인 되었다 (IACUC No. 2010-0252; 2013-0220).

1. 마우스 모델 신생아이 뇌 손상의

  1. Isoflurane와 강아지 anesthetize
    1. Anesthetizing 상자에 강아지 (5 미만)을 놓고 뚜껑을 닫습니다.
    2. 약 15 분; anesthetizing 시스템 설정 가스 및 isoflurane 테이블 상단 마 취 기계를 사용 하 여 조정 합니다. 1.5 L/분 조절 마 취의 유도 대 한 3-5 %isoflurane 기화 기에 산소 유량을 조정 합니다.
    3. 15 분 후 마 취의 유지 보수에 대 한 1-2 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다.
  2. 해 부 현미경 (복 부 연구원 직면) 완전히 마 취 강아지를 테이프와 함께 그것을 확보.
  3. 소독된가 위를 사용 하 여 목에 절 개를 ~0.7-mm을 확인 합니다.
  4. 조심 스럽게 소독된 집게를 사용 하 여 지방 조직을 제거 하 고 일방적인 오른쪽 경 동맥을 노출.
  5. 5-0 흡수 봉합으로 일방적인 오른쪽 경 동맥 선
  6. 5-0 봉합 사로 봉합 목에 절 개.
  7. 복구에 대 한 1 시간 37 ℃ 따뜻한 hypoxic 챔버에 각 강아지를 배치 합니다. 챔버 뚜껑을 닫지 마십시오.
  8. 수술 후, 1 h 새끼 완전히 깨어 있을 때 산소 챔버 뚜껑 닫고 hypoxic 조건 (8% O2 와 92% N2) 확립 가스 수준을 감소.
  9. 산소의 90 분 후에 그들의 감 금 소에 강아지를 반환 합니다.
  10. 1 주일이 뇌 손상 후 1 단계를 반복 합니다.
    1. 마 취, 후 소독된가 위와 오른쪽 뇌의 posterolateral 영역에서 뇌 병 변 식별에 집게 사용 두 피에 절 개를 확인 합니다.
      참고:이 치료는 강아지에서 hypoxia를 유도합니다. 존재와 모든 쥐에서 뇌 손상의 정도 반투명 두개골을 통해 육안으로 시각적으로 부과 됩니다. 크기 또는 변색 (즉, 뇌 병 변)의 볼륨에 따라, 새끼 그룹으로 분류 됩니다. 보이는 대뇌 피 질의 상해 없음 경우 마우스 "대뇌 피 질의 부상" 그룹으로 분류 됩니다. 보이는 대뇌 피 질의 부상 (즉, 오른쪽 뇌에 병 변을) 있는 경우에, 마우스 "대뇌 피 질의 부상" 그룹으로 분류 됩니다. 뇌 샘플의 형태학 희생1,2,3의 때에 명확 하 게 정의 그룹화 수정할 수 있습니다 때문에 그룹으로 쥐의 분류는 수술 후 1 주, 4.

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그림 1: 신생아이 뇌 손상 생쥐에서 모델링.
(A) 7-하루-오래 된 마우스 강아지 수술 하 고 일방적인 오른쪽 경 동맥 출혈 했다. (B) 새끼는 8% O2 와 92% N290 분의 산소 챔버에 배치 했다. (C, D 및 E) 신생아이 부상으로 두뇌 손상의 다양 한 심각도 그리고 손상의 정도에 따라 분류 했다. 14 주, 두뇌를 가져온, 그리고 병 변의 시각화 했다. (C)는 "대뇌 피 질의 상해 없음"으로 분류 하는 두뇌의 이미지. 둘 다 (D) 및 (E) "대뇌 피 질의 부상" 그룹으로 분류 했다. (F, G 및 H) (C)의 대표적인 MRI (D), 및 (E) 쥐, 각각. (F) 해 마에 피해는 노란색 화살표가 표시 되 고 오른쪽 뇌 병 변 (G 및 H) 노란색 화살표도 표시 됩니다. 스케일 바 1 mm = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 신생아 행동 테스트

참고: 여기, 행동 테스트 나이의 6 주에 수행 했다.

  1. 수동 제거 작업입니다.
    참고: 메모리 기능 학습 및 혐오 자극의 제거에 따라 평가, 팻 단계를 통해 2 구획 이어야 한다 실시13,14,,1516.
    1. 유리 야 셔틀 상자 (41.5 × 21 × 35 cm3) 팻 기구의의 밝은 구획에 마우스를 놓습니다.
    2. 30 후 s, 단두대 문을 열고 어두운 구획으로 이동 하려면 마우스에 대 한 대기 시간을 기록 (최대 300 s).
    3. 마우스의 모든 4 개의 사지는 완전히 어두운 구획 안에 단두대 문을 닫습니다.
    4. 전기 발 충격을 관리 (0.5 mA) 2 s 및 그것의 감 금에 반환 마우스.
    5. 전기 발 충격 후 24 h 밝은 칸에 마우스를 교체 합니다.
    6. 단두대 문 10 s 후 마우스는 완전히 밝은 칸에 열고 어두운 구획으로 이동 하려면 마우스에 대 한 대기 시간을 기록 (최대 300 s).
  2. 사다리 워킹 테스트 합니다.
    참고: 사다리 가로 대 걷는 작업 질적 결합 하 여 모터 기능의 미묘한 소요와 숙련 된 걷는17,18의 정량 분석 사이 차별에 대 한 허용 됩니다.
    1. 비디오 카메라를 켭니다.
    2. 사다리의 시작 패널에 마우스를 놓고 즉시 녹화를 시작 합니다.
    3. 마우스 팔 다리에 초점을 맞추고 비디오를 기록 합니다.
    4. 마우스는 사다리의 마지막 패널에 닿을 때 녹음을 중지 합니다. 뒤로-및-앞뒤 여행 4 번 반복 합니다.
    5. 비디오 녹화를 분석 하 고 수동으로 각 forelimb의 수를 다음과 같이 계산:
      1. 느린 속도로 컴퓨터에 비디오 녹음 재생 (0.1 x) 단계를 수동으로 계산 하 고.
  3. 그립 강도 테스트 합니다.
    참고: 그립 강도 테스트 푸시 풀 스트레인 게이지를 포함 하는 그립 강도 측정기를 사용 하 여 수행 됩니다.
    1. 아크릴 패널에 그립 강도 장치를 수정 합니다.
    2. 아크릴 패널에 마우스를 놓고 꼬리를 개최 합니다.
      1. 마우스에 도달할 수 있도록 꼬리를 들고 손과 그립 기구의 금속 와이어를 이동 합니다.
    3. 마우스 그립 금속 와이어 (직경에서 2mm);의 삼각형 조각 때까지 여러 실험을 허용 피크 힘 기구에 의해 그램에 자동으로 등록 됩니다.
      참고: 3 개의 시험의 평균 피크 힘을 사용 하 여 분석19,,2021.

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결과

모든 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM) 의미의로 표현 됩니다. 두 그룹 사이의 변수 비교 독립 또는 쌍 t를 사용 하 여 실시 했다-SPSS 통계 소프트웨어에 대 한 테스트. P-값 < 0.05 통계적으로 중요 하 게 고려 되었다.

신생아이 부상으로 두뇌 손상의 다른 심각도 그리고 그러므로 분류 했다 (그림 1 c-E). 두뇌 주 14에서 가져온 하 고 병 변 시각화 했다. 그림 1C 는 "대뇌 피 질의 부상" 두뇌, 그림 1D 로 분류 하는 두뇌 두뇌 가벼운 부상으로 분류 고 그림 1E 심각 하 게 손상 된 두뇌를...

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토론

이 연구에서 우리 신생아 P7-10 CD-1 마우스에이 뇌 손상을 유발 하 고 관련 인식과 모터 적자와 함께 뇌 병 변 확인. 이 절차 동안, 일방적인 오른쪽 경 동맥의 폐색 중요 했다. 이 단계에서는 동맥 손상 고 해체 될 수 있습니다. 동맥 눈물을 경험 대부분 새끼 죽 었 다. 반대로, 연구원은 일방적인 오른쪽 경 동맥 대신 다른 혈액 정 맥 출혈, 강아지의 뇌만 약간 손상, 그리고 아무 중요 한 표현 형24관찰 될 수 있었다.

이 연구, 쥐 및 병 변 볼륨, 두뇌에 있는 변이 때문에 (그림 1 C H) 여러 그룹으로 분류 했다. 가벼운 부상된 두뇌와 여러 쥐 해 마에만 대뇌 피 질의 영역 (그림 1 층)13에 손상을 했다. 반대로, 심각 하 게 손상 된 두뇌 우 반구는 외피가의 손실된 대부분 심각 했다 여러 생쥐 (...

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공개 사항

저자 아무 경쟁 관심사 있다.

감사의 글

이 연구는 국립 연구 재단 (NRF 2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), 과학의 부 및 기술, 한국, 한국 건강 기술 R & D 프로젝트 (HI16C1012), 건강의 교육부에서 교부 금에 의해 지원 되었다 & 복지, 한국, 그리고 연세대 학교 의과대학 (6-2016-0126)의 "동화" 교수 연구 지원 프로그램

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
저산소챔버Jeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
PAT 기구양도바이오 & Plant CoExperimental Builder
사다리 가로대 걷기Jeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
SDI 그립 강도 시스템San Diego Instruments Inc.
그립 강도 측정기Ugo Basile47200
하버드 장치 플루오박 마취 시스템 Harvard Apparatus
Anesthetizing boxacryl box
I-Fran Liquid (Isofluorane)Hana Pharm. Co., Ltd.전신 마취제 (이소 플루란 100ml)
CD-1 마우스동양 주식회사
블루 나일론 모노 Non-Absorbbable 봉합사 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS 통계IBM버전 23

참고문헌

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