여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 세타 진동의 연구를위한 방법론 및 응용 프로그램의 최근 개선과 함께 고립 된 전체 해마, WT 및 유전자 변형 생쥐에서 준비하고 녹음 절차를 설명합니다. 고립 해마 준비의 간단한 특성 분석을 통해 내부 hippocampal theta 발진기와의 관계를 cornum ammonis-1 (CA1) 및 subiculum (SUB) 영역의 피라미드 세포 및 GABA 신경계 인터페론의 활성과 함께 검사합니다. 전반적으로, 우리는 고립 된 해마가 체외에서 본질적인 세타 진동 을 생성 할 수 있으며, 해마 내에 생성 된 리듬이 parvalbumin 양성 (PV) 신경 세포의 광학 유전 자극에 의해 정확하게 조작 될 수 있음을 보여줍니다. 시험관에서 분리 된 해마 제제는 시각적으로 확인 된 neu에서 동시에 현장 및 세포 내 패치 클램프 기록을 사용할 수있는 독특한 기회를 제공합니다theta 리듬 세대의 기본 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.
서론
Hippocampal theta oscillations (4 - 12 Hz)는 포유 동물의 뇌에서 가장 두드러진 리듬 활동 중 하나이며, 시공간 정보의 처리 및 일란성 기억 1 , 2 , 3의 형성과 같은인지 기능에서 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 공간 탐색 및 병변 연구와 함께 theta-modulated place-cell의 관계를 강조하는 몇 가지 생체 내 연구와 임상 증거는 hippocampal theta oscillations이 기억 형성 4 , 5 , 6에 관여한다는 견해를 뒷받침한다. 해마 생성의 세타 진동은 아직 완전히 이해되지 않았다. 초기 생체 내 조사는 세타 활성이 외인성 발진기, 특히 리듬 입력에 주로 의존한다고 제안했다중격과 entorhinal 피질 같은 구 심성 뇌 구조에서 7 , 8 ,<....
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프로토콜
모든 절차는 McGill 대학 동물 관리위원회 및 동물 관리에 관한 캐나다위원회에서 승인 한 지침 및 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 급성 해마 in vitro 준비
참고 : 손상되지 않은 해마 준비를 분리하는 것은 (1) 솔루션 및 장비 준비, (2) 해마 해부 및 (3) 본질적인 세타 진동 생성에 필요한 빠른 관류 속도 시스템 설정. 이 프로토콜에서 해부에서 기록에 이르기까지 적시에 수행되는 절차는 격리 된 해마가 밀도가 높지만 섬세한 준비를 이루기 때문에 중요합니다. 즉, 생체 외 구조의 기능적 연결성을 유지하는 데는 많은주의가 필요합니다. 모든 것을 사전에 준비하면 세포 d를 최소화하기 위해 적절한 수준의 재관류를 가능한 한 빨리 사용할 수 있습니다.생리 기능을 상실하고 유지하십시오.
- 자당 기반의 인공 척수액 (aCSF) 용액
- 해부 및 해부 후 부화에 사용되는 1X 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 표 1에 열거 된 모든 성분을 CaCl 2를 제외하고 1L의 탈 이온수에 넣고 4 ℃에서 2 주 동안 보관한다.
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결과
이 섹션 은 체외에서 마우스 격리 hippocampal 준비 에 세타 진동을 공부하여 얻을 수있는 결과의 예를 보여줍니다. 분리 된 해마를 추출하기위한 해부 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 준비를 사용하여 내장 된 세타 진동은 여러 필드 전극을 배치하는 동안 검사 할 수 있으며 전반적인 활동을 기록하고 격리 된 해마의 여러 지역 및 레이어에있는 연결 인구에 대한 시냅스 입력을 동기화 할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 동시 전체 세포 패치 클램프 및 세포 외 녹음의 대표 결과는 자발적인 해마 세타 진동 ( 그림 3 ) 동안뿐만 아니라 리듬 활동의 optogenetic 조작 중에 특정 세포 유형의 발화 및 시냅스 특성을 특성화하기 위해 제공됩니다g ".......
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토론
급성 hippocampal 조각에서 electrophysiological 녹음은 표준 체외 기술을 구성하는 동안, 여기에 제시된 방법은 고전적인 접근 방식과 크게 다릅니다. 특정 세포 층이 표면에서 볼 수 있고 직접 검사 할 수있는 얇은 슬라이스 준비와 달리 손상되지 않은 해마 준비물은 개별 층을 통과하면서 전극을 대상 뇌 영역으로 낮추는 생체 내 구성과 유사합니다. 해마의 무결성은 기능적 연결성 및 국부 연결 인구의 특성과 함께 보존됩니다. 이것은 해마에서 소규모 및 대규모 네트워크 진동을 조사하기위한 복잡하고 강력한 도구를 제공합니다. 예를 들어 네트워크에 사전 배선 된 회로와 셀 유형의 특정 특성이 결합되어있어 본질적으로 자발적으로 생성 된 리드 미칼 한 세타 및 감마 진동을 생성하여 히포카의 중요한 특징을 모방합니다생체 내에서의 mpal 활성. 이 프로토콜에 제시된 방법을 사용하면 해마는 설치류의 뇌에서 신속하게 추출 할 수 있으며 빠르게 흐르는 aCSF 환경에서 몇 시간.......
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공개 사항
저자는 상업적 또는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다 보건 연구소 (Canadian Institute of Health Research and Natural Sciences)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>시약 | |||
| 염화나트륨 | 시그마 알드리치 | S9625 | |
| 설탕 | 시그마 알드리치 | S9378 | |
| 중탄산나트륨 | 시그마 알드리치 | S5761 | |
| NaH2PO4 - 인산나트륨 일염기 | 시그마 알드리치 | S8282 | |
| 황산 마그네슘 | 시그마 Aldrich | M7506 | |
| 염화칼 | 시그마 Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-포도 | 시그마 Aldrich | G7528 | |
| 염화칼슘 이수화물 | 시그마 Aldrich | C5080 | |
| 아스코르브산 나트륨 | 시그마 Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Equipment | |||
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참고문헌
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
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