Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝 체외에서 : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

Hippocampal theta oscillations (4 - 12 Hz)는 포유 동물의 뇌에서 가장 두드러진 리듬 활동 중 하나이며, 시공간 정보의 처리 및 일란성 기억 ^{1 , 2 , 3의} 형성과 같은인지 기능에서 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 공간 탐색 및 병변 연구와 함께 theta-modulated place-cell의 관계를 강조하는 몇 가지 생체 내 연구와 임상 증거는 hippocampal theta oscillations이 기억 형성 ^{4 , 5 , 6에} 관여한다는 견해를 뒷받침한다. 해마 생성의 세타 진동은 아직 완전히 이해되지 않았다. 초기 생체 내 조사는 세타 활성이 외인성 발진기, 특히 리듬 입력에 주로 의존한다고 제안했다중격과 entorhinal 피질 같은 구 심성 뇌 구조에서 ^{7 , 8 , 9 , 10} . 내인성 요인 - 해마 신경 세포의 내부 연결성과 해마 뉴런의 성질 -은 시험관 내 관찰 ^{11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18에} 근거하여 가정되었다. 그러나 몇 가지 획기적인 연구 ^{19 , 20 , 21} 을 제외하고 간단한 체외 조각 준비에서 생리적으로 현실적인 인구 활동을 복제 할 수있는 접근법을 개발하는 데 어려움이 있습니다오랫동안 해마와 그 주변의 본질적인 능력을 세타 진동을 스스로 발생시키는 데 더 상세한 실험적 검사를 지연시켰다.

체외의 얇은 슬라이스 실험 환경 에서 표준의 중요한 단점은 뇌 구조의 3D 세포 및 시냅스 조직이 일반적으로 손상된다는 것입니다. 즉, 공간적으로 분산 된 세포 어셈블리를 기반으로하는 여러 형태의 협동 네트워크 활동이 하나 이상의 뇌 영역 (> 1mm)에 걸쳐있는 국소 그룹 (반경 ≤1mm)에서 뉴런 인구에 이르기까지 지원 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 세타 진동이 해마에서 어떻게 나타나고 관련 피질 및 피질 하부 구조로 전파되는지 연구하는 데는 다른 유형의 접근법이 필요했습니다.

최근 몇 년 동안 양방향 intera를 검사하기위한 "완전한 septo-hippocampal"준비의 초기 개발두 구조물 ⁽²²⁾ 및 「격리 해마 "제제 계속되는 진화 ctions는 고유 진동 세타 리듬 외부 입력 ^{(23)이 결여} 된 해마에서 자발적으로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법의 값은 이들 영역의 전체 기능 구성이 체외 ^{(22)에서의} 세타 리듬 발전기로서 작동하기 위해 유지했다 초기 통찰력에 놓여있다.

모든 절차는 McGill 대학 동물 관리위원회 및 동물 관리에 관한 캐나다위원회에서 승인 한 지침 및 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 급성 해마 in vitro 준비

참고 : 손상되지 않은 해마 준비를 분리하는 것은 (1) 솔루션 및 장비 준비, (2) 해마 해부 및 (3) 본질적인 세타 진동 생성에 필요한 빠른 관류 속도 시스템 설정. 이 프로토콜에서 해부에서 기록에 이르기까지 적시에 수행되는 절차는 격리 된 해마가 밀도가 높지만 섬세한 준비를 이루기 때문에 중요합니다. 즉, 생체 외 구조의 기능적 연결성을 유지하는 데는 많은주의가 필요합니다. 모든 것을 사전에 준비하면 세포 d를 최소화하기 위해 적절한 수준의 재관류를 가능한 한 빨리 사용할 수 있습니다.생리 기능을 상실하고 유지하십시오.

1. 자당 기반의 인공 척수액 (aCSF) 용액
   1. 해부 및 해부 후 부화에 사용되는 1X 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 표 1에 열거 된 모든 성분을 CaCl _2를 제외하고 1L의 탈 이온수에 넣고 4 ℃에서 2 주 동안 보관한다.
2. 표준 aCSF 솔루션
   1. electrophysiological 녹음 동안 격리 해마의 높은 유속 관류에 대한 표준 aCSF를 준비합니다. 농축 (5X) 스톡 aCSF를 만들기 위해서는 탈 이온수 2 L에 CaCl _2를 제외한 표 2에 열거 된 모든 성분을 녹이고 4 ° C에서 보관하십시오.
3. 장비 준비
   1. 해부를 시작하기 전에 얼음으로 채워진 플라스틱 트레이 (30 x 20 x 5cm), 카보 겐 연결 튜브 라인 및 three 유리 페트리 접시 (10 x 2 cm) ( 그림 1 참조).
   2. carbogen (95 % O _2, 5 % CO _2)과 칼슘을 추가 ²⁺ [1.2 mm]가 함께, 500㎖의 비커에 거품을 수크로오스 용액 300 ㎖ (1X 스톡)를 추가한다.
   3. 이 페로쉬 액 60mL를 유리 배양 접시에 옮기고 실온에서 방치한다. 나머지를 4 ° C의 냉동고에 10-15 분 동안 놓습니다.
   4. 해부를 통해 carbogen과 얼음 차가운 자당 솔루션을 버블 링하십시오.
   5. 두 번째 페트리 접시 (차가운 체임 챔버)를 자당 용액 (4 ° C)으로 채우고 얼음에 보관하십시오.
   6. 빙 냉한 자당 용액 30 mL를 50 mL 비커에 넣는다.

2. 전 해마 해부

참고 : 격리 된 해마를 해부하는 방법을 개발하는 것과 본질적으로 동일하며 원래 ²² 만 체육에 대한 자세한 내용 및 변경 설명rfusion 속도 및 녹음 기술.

1. 뇌 절개
   1. 바구니에 추가되는 이소 플루 란 (100 %) 1 ML로 담가 작은 종이 타월로 퓸 후드 아래 마우스 (P20 - 35) 마취.
   2. 마취 된 마우스를 처치하고 얼음으로 찬 자당 용액 (50 mL 비이커, 약 5 초)에서 머리를 빠르게 담그십시오. 종이 타월로 옮깁니다.
   3. 메스를 사용하여 내측 피부 절개를하고 (옆구리에 꼬리 쪽) 피부를 양쪽으로 밀어서 두개골을 노출시킵니다.
   4. 작은 가위로 두개골을 열어 주걱을 사용하여 신속하게 두뇌를 추출하고 얼음 차가운 자당 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 놓습니다. 두뇌가 식을 때까지 1-2 분 정도 기다리십시오.
   5. 두뇌가 회복하는 동안, 얼음에 렌즈 종이 덮여 페트리 (해부) 요리에 2 - 3 ML 자당 솔루션을 추가합니다.
2. 해마 분리
   1. 똑바로 positio에 해부 접시에 두뇌를 놓으십시오엔.
   2. 면도날로 소뇌와 전두엽 피질을 제거하십시오. midsagittal 비행기를 따라 반으로 뇌를 잘라내고 두 격리 반구를 들고 챔버로 반환합니다. 회복을위한 추가 1 ~ 2 분을 허용하십시오.
   3. 단일 hemisected 두뇌를 해부 접시에 똑바로 놓습니다.
   4. midsagittal 구조가 관찰자와 마주 치게 될 때까지 접시를 회전시키고 중격 복합물의 삽입 된 윤곽이 시상선 앞쪽에 얇은 배 모양의 조직으로 보입니다.
   5. hemi - sected 두뇌를 microspatula로 고정하고 polyptetrafluoroethylene (PTFE) 코팅 된 주걱의 작은 끝을 septal 영역 바로 뒤에 (caudal) 놓습니다.
   6. 중격 아래에 코팅 된 주걱을 삽입하고 해부 접시에 도달 할 때까지 팁을 아래로 이동하십시오. septal 영역을 연결하는 섬유를 절단합니다. 중격의 앞쪽 가장자리를 따라 동일한 작업을 반복하고 두뇌의 정면 부분에 연결하는 섬유를 잘라.
   7. 주걱으로 직립 위치에 해마 바로 위의 피질의 안쪽 부분을 가볍게 잡고, 시상 하부, 시상 하부 및 남아있는 뇌간 핵을 조심스럽게 내려 오기 위해 미세 주걱을 사용하십시오. 뽑아 낸 티슈를 잘라내어 제거하려면 주걱을 사용하십시오.
   8. 고립 된 반구를 돌려서 해마의 윤곽을 확인하십시오.
   9. 코팅 된 주걱을 등쪽 해마의 주둥이 끝 부분 아래쪽 측면 심실에 삽입합니다.
   10. 주걱을 hemi - sected 두뇌의 midsagittal 비행기와 수평으로 정렬 잡고 팁이 꼬리로 나타날 때까지 심실 벽의 부드러운 윤곽을 통해 밀어.
   11. 해마 아래의 주걱을 잡고 해마가 위에있는 피질과 결합하는 내부 층을 따라 연결 섬유 위로 가볍게 누르십시오. 이 층의 외부면에 미세 주걱을 바르고 코팅 된 주걱에 대해 슬라이드시켜 연결하는 fi맥주.
   12. 추출을 완료하려면 해부 접시를 회전하고 복부 해마 아래에 코팅 된 주걱을 삽입합니다. 피질 주름의 내부를 주걱으로 가볍게 잡고 미세 주걱에 대한 슬라이싱 동작을 사용하여 엔도르린 연결부를 절단합니다.
       참고 : 전체 septohippocampal 복잡한은 전체 해마 아래에 코팅 된 주걱을 배치하고 아래에서 나머지 뇌 조직을 꺼내 제거 할 수 있습니다.
   13. 일단 고립이 완료되면, 해마를 접시에 휴식을 유지하고 차가운 유지하기 위해 얼음 차가운 자당 솔루션의 방울을 추가합니다. 조심스럽게 남은 피질과 섬유를 잘라내어 면도날을 천천히 가해 중격에서 해마를 분리합니다.
       참고 : 패치 클램프 녹음이 피라미드 세포 (4.6 절 참조)에서 수행되어야하는 경우 격리 된 해마는 CA1의 피라미드 층을 노출시키기 위해 45 ° 각도로 횡 방향으로 절단 될 수 있습니다 ( "angle- 컷 "준비) 해마의 나머지 부분에서 로컬 네트워크 회로를 손상시키지 않습니다.
   14. 제제를 상온의 자당 용액에 옮기고 15 ~ 30 분간 회복시켜 녹음 챔버로 옮긴다.

3. 격리 된 해마 기록을위한 빠른 관류 설정

1. 20 - 25 mL / min에서 산소가 공급 된 aCSF를 연속적으로 고속 유입 할 수 있도록 중력 식 관류 시스템을 설치하십시오.
   1. 미리 aCSF (1X) 플라스크를 준비하고 실험 시작 15 분 전에 예열 욕조 (~ 30 ° C)에 담그십시오. 인라인 용액 히터 시스템을 켜십시오 (30 ° C).
   2. 실험 전반에 걸쳐 aCSF에 산소를 공급하는 카보 겐 탱크에 연결된 수족관 버블 러와 튜빙 라인을 사용하고 재관류 시작 전에 CaCl ₂ [2 mM]를 첨가하십시오.
   3. aCSF 흐름을 중지하고 와이드를 사용하여 기록 챔버에 해마를 전송유리 피펫의 끝입니다. 자당 포화 제제가 침전되어 바닥에 침전되도록하십시오.
   4. CA1과 SUB의 매끄러운 표면을 맨 위에 놓고 녹음 챔버의 중심에 (입구 - 출구 축과 일치하여) 준비물을 놓습니다. septal과 temporal extremes에서 작은 무게로 해마를 안정화시키고 aCSF flow를 다시 시작하십시오.

고립 해마에서의 전기 생리학

1. 생체 외 hippocampal 쎄타 발현의 세포 외 기록
   1. LVD (Local Field Potential) 또는 체외 격리 된 해마로부터의 단일 단위 활동의 ​​세포 외 모니터링을 위해 aCSF로 채워진 유리 마이크로 피펫 (1 - 3 MΩ)을 사용하십시오. 이득 x1000의 패치 클램프 증폭기, 온라인 대역 통과 필터링 0.1 - 500 Hz 및 5-20 kHz의 샘플링 속도로 저잡음 AC 결합 필드 전위 신호를 기록하십시오.
      참고 :이 프로토콜에 사용되는 맞춤형 현미경는 해마의 저배율보기를위한 저배율 (2.5X) 및 고배율 (40X) 대 상뿐만 아니라 단일 셀 인식을위한 적외선 비디오 현미경 및 후광 형광을 갖추고 있습니다. 이 시스템의 구성 요소로는 직립 형광 현미경, 형광 필터 큐브, 이미징 소프트웨어가있는 아날로그 비디오 카메라 및 디지털 프레임 그래버, 단계별 사용자 지정 관류 챔버 ( 그림 2A , 삽입 된 i) 및 연결 기록 용 고정밀 미세 조절기 및 광섬유 배치.
   2. 현미경에 장착 된 카메라를 사용하고 컴퓨터 디스플레이에 연결하여 저배율 (2.5 배)에서 해마 준비를 검사하고 언더컷이 없거나 외부 표면이 손상되지 않았는지 신속하게 확인합니다. CA1의 매끄러운 표면을 따라 대각선 방향으로 배치 된 새우 섬유 배열은 해마 (hippocam)를 통해 투과 된 빛을 비출 때 가시적이어야한다 ( 그림 2A , 삽입 2)고름.
   3. 격리 된 해마와 특정 기록 위치에 LFP 전극을 배치하려면 저배율 와이드 필드 대물 렌즈를 사용하십시오.
      참고 : 서로 다른 녹음 위치에 배치 된 여러 개의 전극이있는 격리 된 해마 준비의 레이아웃이 그림 2A에 나와 있습니다.
   4. CA1 영역의 표면 (alveus)에 닿을 때까지 LFP 전극을 조에 넣으십시오.
      참고 : 이것은 일반적으로 전극이 기록 매체에 닿으면 발생하는 것과 유사한 AC 결합 기록에서 빠른 과도 현상을 일으 킵니다. 오디오 모니터는이 단계 후에 LFP 채널 신호를 청취하는 데 유용 할 수 있습니다.
      참고 : 종종 활동의 초기 징후는 10-15 분 후에 만 ​​나타나므로 준비 단계로 빨리 넘어 가지 않는 것이 중요합니다. 이 기간이 지난 후에도 표면 LFP 전극이 여전히 활동을 포착하지 못하면 지층 oriens를 조금 더 아래로 전진하십시오주요 셀 레이어에 접근하는 동안 어떤 형태의 활동이 발생하는지 주기적으로 확인하십시오. 5 ~ 10 분 후에 아무 것도 감지되지 않으면 조심스럽게 전극을 집어 넣고 같은 지역의 다른 곳에 두십시오.
   5. 피라미드 층을 통해 LFP 전극을 전진시킵니다. 개별 뉴런 (주로 피라미드 및 억제 성 바스켓 세포)으로부터의 단일 단위 방출이 검출됨에 따라 세포 외 스파이크 활동이 초기에 증가하는 것을 관찰하십시오. 전극을 더 낮추고 팁이 방사선에 교차하면서 스파이크가 다시 흐려지기 시작합니다. 시타 - 주파수 범위 (4 - 12 Hz)에서 명확하게 보이는 네트워크 발진이 분명 해지고 방사 위치를 통해 방사 크기가 낮아짐에 따라 최대 진폭 (~ 100 - 300 μV)에 도달한다는 것을 관찰하십시오.
2. 단일 영역의 세타 진동
   1. CA1 영역에서 자발적인 세타 진동의 공간 특성을 시험하기 위해 팁중앙 CA1 부위 (길이 방향의 중격 - 측두 축을 따라 중간에 위치)에서 LFP 전극을 참조하고 이전에 설명한대로 방사체로 내립니다.
   2. 두 번째 LFP 전극을 CA1 사이트 (200 - 800 μm septal 또는 첫 번째 LFP에서 일시적)에 배치하고 CA1 쎄타 진동이 비교적 큰 거리에서 동기화 될 수 있음을 관찰합니다.
3. 레이어를 통한 쎄타 진동
   1. 해마 층의 세타 진동의 특성을 시험하기 위해 CA1 라지 타텀 사이트에 기준 LFP 전극을 남겨 둡니다. 지층 oriens 바로 위에서 시작하여 두 번째 전극을 피라미드 세포층으로 내리고 radiatum을 통과시킵니다. 피라미드 층을 가로 지르는 LFP 신호의 점진적인 반전 (상대 위상 역전)을 관찰하십시오.
      참고 : 이러한 유형의 활동에 대한 대표적인 예는 그림 2B를 참조하십시오. 층류 / 깊이 프로파일 및 전류 소스 밀도 (CSD) 분석기의 예고립 해마에서의 위상 반전 위치가 이전에 ^{23 , 24 , 25} 로 발표되었다.
4. 손상되지 않은 해마에서 감마 진동과 theta-gamma 커플 링
   1. 필드 전극을 CA1 / SUB 경계에 놓고 피라미드 층과 분자 층 사이의 계면에 위치 할 때까지 낮추십시오. 이 레벨에서 로컬 세타 리듬으로 위상 고정되는 진폭 변화로 명확한 감마 진동을 표시하는 필드 전위를 기록 할 수 있습니다 ²⁴ . 쎄타 - 감마 커플 링의 느린 시간 스케일을 관찰하기 위해 스케일링을 조정하십시오. 감마 버스트는 두 개의 다른 주파수 대역에서 발생하며 저속 (25 - 50 Hz) 및 빠른 감마 (150 - 250 Hz) 범위에서 진행중인 LFP 신호를 대역 통과 필터링하여 나타낼 수 있습니다 ( 그림 2C 참조) 흔적).
5. 체외 hippocampal theta oscillations 동안 전체 세포 패치 클램프 녹음
   참고 : 프로토콜의이 부분에서는 PV promoter (tdTomato)의 제어하에 형광 단백질 tdTomato를 발현하는 형질 전환 PV-TOM 마우스로부터 격리 된 해마에서 확인 된 신경 세포로부터 시각적으로 유도 된 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻는 것이 목표입니다 자세한 내용은 참고 자료 및 참조 ²⁶ ).
   1. PV - TOM 마우스 ( 그림 3 )에서 hippocampal 준비 표면 근처에 tdTomato 긍정적 인 interneurons을 시각화하기 위해 낮은 (2.5X) 및 높은 전력 (40X) 확대와 형광 비디오 현미경을 사용하십시오. PV-TOM 뉴런은 알 부스 (최대 100 μm)를 통한 패치를 성공적으로 시각화하고 표적화 할 수 있지만, 해마가 앵글 컷 기술로 준비 될 때 비 형광성 피라미드 세포에 비교적 쉽게 도달 할 수 있음을 유의하십시오 (참조 섹션 2.2.14 주).
   2. 해마의 낮은 배율보기에서 패치 클램프 실험을 준비하면서 세타 진동을 모니터링하기 위해 CA1 / SUB에 LFP 전극을 배치하십시오.
   3. 배율을 40X로 전환하고 대상 영역에 목표물을 담그십시오. 상단 레이어가 보일 때까지 낮추십시오. 반대쪽에서 패치 피펫 접근을위한 충분한 오픈 액세스를 보장하기 위해 현미경의 위치를 ​​조작.
   4. 형광 현미경 검사에서 형광 PV-TOM 세포를 선택하고 표준 세포 내 용액으로 채워진 패치 피펫 (2 - 3 MΩ)으로 접근하십시오.
   5. 마우스 피스를 사용하여 가벼운 양의 압력을 피펫에 가하고 전극이 세포로 내려갈 때 저항을 모니터링합니다. 팁이 표적 세포를 만날 때, 피펫 저항이 증가하고 양성 압력이 막을 밀 때 명확한 딤플이 나타난다. 압력을 해제하고 씰이 형성되기 시작할 때 전류 펄스가 평평 해지는지 확인하십시오. 즉시 clamp에서 과분극 된 전위 (-70 mV)로 전환되고 GΩ 씰이 달성되면 피펫 홀더를 통해 가해지는 소량의 음압으로 세포막이 파열됩니다.
   6. 일단 전체 세포 구성, 자발적인 해마 진동 ( 그림 3B ) 동안 식별 PV 세포의 생리 특성을 검사하십시오.
   7. PV 세포에서 세포 내막 전위 기록은 진행중인 CA1 / SUB 쎄타 리듬과 동기화되는 빠른 전위 행동 및 파열 작용 전위를 특징으로한다는 것을 관찰하십시오.
   8. 전압 클램프로 전환하고 본질의 리듬 활동에 의해 생성 된 흥분성 대 억제 성 시냅스 전류의 비율을 특성화하기 위해 세포를 다른 멤브레인 전위로 유지합니다. 비교를 위해 피라미드 셀로부터의 패치 클램프 기록의 예가 도 3a 에 도시되어있다.
6. 격리 된 해마의 Optogenetic 제어 참고 : hippocampal 네트워크 활동의 optogenetic 제어 들어, 이러한 세포가 고립 된 해마 ²⁵ 의 주요 세포 인구를 동기화에 중요한 역할을 것으로 나타 났습으로 PV 함유 GABAergic 세포의 리듬 활성화와 관련된 세포 유형의 구체적인 전략은 여기에 사용됩니다. PV 세포에서 흥분성 채널 루돕 신 -2 (ChR2)의 선택적 발현은 PV-Cre 마우스 라인을 ChR2 Cre 의존적으로 발현하는 마우스 (Ai32)와 교차시킴으로써 PV-ChY 마우스를 생성함으로써 달성된다. 또는 CA1 / SUB interneurons에서 흥분성 옵신의 발현을 유도하기 위해 PV-Cre 또는 PV-TOM 마우스 (P15-16)의 해마에 바이러스 벡터 구조물 ( 예 : AAVdj-ChETA-eYFP)을 주입 할 수 있습니다 ( 그림 4A ).
   참고 :이 전략은 이전에 설명되었습니다 ²⁵ .
   1. CA1 / SUB 영역에 LFP 전극을 놓고 격리 된 hippoc에 인근 피라미드 셀을 패치하십시오PV 신경 세포에서 청색 빛 민감성 흥분성 옵신 ChR2를 발현하는 마우스의 ampus.
   2. 광섬유 광 가이드 (직경 0.2 - 1mm)를 해마 제제 위에 놓고 기록 된 부위의 중앙에 놓습니다. 세타 주파수 (4 - 12 Hz)에서 전달되는 광 펄스 (트랜지스터 - 트랜지스터 논리 신호에 의해 트리거되는 10 - 20 ms) 또는 사인파 전압 명령으로 구성된 광 발생 자극을위한 LED 소스의 청색 빛 (473 nm)을 사용하십시오.
      참고 : 사용자 정의 LED 기반 광 자극 어셈블리는 다른 곳에서 설명했습니다 ²⁵ .
   3. 전류 클램프로 전환하고 자발적인 세타 진동 동안 피라미드의 활동을 특성화합니다.
   4. 자극 프로토콜을 시작하고 빛의 반응을 기록합니다. 기록 된 신경 세포에서 현장 진동과 시냅스 활동이 광학 유전 자극 동안 점점 더 동기화되고 PV 세포의 리듬 페이싱이 두 주파수( 그림 4 ).

이 섹션 은 체외에서 마우스 격리 hippocampal 준비 에 세타 진동을 공부하여 얻을 수있는 결과의 예를 보여줍니다. 분리 된 해마를 추출하기위한 해부 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 준비를 사용하여 내장 된 세타 진동은 여러 필드 전극을 배치하는 동안 검사 할 수 있으며 전반적인 활동을 기록하고 격리 된 해마의 여러 ​​지역 및 레이어에있는 연결 인구에 대한 시냅스 입력을 동기화 할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 동시 전체 세포 패치 클램프 및 세포 외 녹음의 대표 결과는 자발적인 해마 세타 진동 ( 그림 3 ) 동안뿐만 아니라 리듬 활동의 optogenetic 조작 중에 특정 세포 유형의 발화 및 시냅스 특성을 특성화하기 위해 제공됩니다g "> 그림 4).

그림 1 : 격리 된 손상없는 해마 준비에 대한 해부 절차.
( a ) 절개 설정의 일반 뷰. 오른쪽 위 : carbogenated ice-cold sucrose 용액 플라스크 (1); 왼쪽 하단 : 얼음으로 채워진 플라스틱 트레이 (2) 렌즈 종이 (3)로 덮인 해부 접시를 들고; 상기 저온 유지 챔버는 수 크로스 용액 (4)을 함유한다. 및 수술 도구 세트 (5). 해부 접시에 hemisection하기 전에 마우스 뇌의 ( b )보기. ( c ) 콜드 홀딩 챔버에서 반공 된 두뇌의 회복 및 중격 아래 코팅 된 주걱의 작은 끝을 삽입하기 전에 왼쪽 뇌 반구의 확대 된보기 (삽입). ( d ) 격리 된 해마 아래, CA1 / SUB 영역을 따라 남은 뇌와 함께 놓인 코팅 된 주걱조직이 아래에서 빠져 나옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 침지 된 기록 챔버에서 손상되지 않은 해마 준비 (inact Hippocampal preparation)에서 시험관 쎄타 진동을 기록하기위한 설정 구성.
( a ) 격리 해마는 hippocampal region의 레이아웃과 septotemporally (white 별표로 표시)에 분포 된 4 개의 다른 녹음 사이트에 배치 된 다중 전극으로 보여진다. 상기 (삽입 삽 입)에 나타낸 기록 챔버 플랫폼의 관점에서, 빠른 관류 흐름을위한 입구 및 출구는 번호 (1, 2)로 표시된다. 아래에 표시된 해마의 확대 된 이미지 (인 세트 ii)에서, 하나의 전극이 중반sepetotemporal CA1과 폐포의 섬유는 쉽게 볼 수 있으며 대구쪽으로 비스듬히 달려 있습니다. S : 중격, T : 임시, f / fx : fimbria-fornix. ( b ) 지층 오리엔트 (회색)와 지층 radiatum (흑색)에서 동시에 기록 된 대표 LFP 추적과 CA1 레이어의 조직의 도식 표현. 두 층 사이의 신호의 반전 된 위상에 주목하십시오. Alv : stratum alveus, PR : stratum pyramidale, SR : stratum radiatum. SLM : Stratum Lacunosum Moleculare. ( c ) 필터링되지 않은 신호로부터 CA1 / SUB 영역 (20 초 세그먼트)과 2 초 확장 세그먼트 (아래)에서 기록 된 자발적인 세타 진동을 보여주는 예제 LFP 추적; theta 주파수 (0.5 - 12 Hz)에 대해 대역 통과 필터링 됨. 느린 감마 (25 - 55 Hz); 및 빠른 감마 (125-250 Hz). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4 : 격리 된 해마에서 자발적 및 Optogenetically 구동 쎄타 진동 동안 단일 CA1 / SUB 피라미드 및 PV 뉴런에서 지역 필드 잠재력과 동시 패치 클램프 녹음.
( a b ) 기록 된 세포 (하단)의 전형적인 레귤러 - 스파이 킹 (RS) 성질 (상부) 및 고배율 (40X) 이미지를 나타내는 피라미드 뉴런의 특징. ( c ) LFP 신호 (회색)와 함께 탈분극 막 전위 (흑색)에서 동일한 셀의 샘플 전류 클램프 기록 및 자발 발진 (왼쪽) 및 세타 - 주파수 (6Hz) 광 자극 동안 동기화 된 리듬 IPSP 보여줌 권리). 빛의 자극 패턴 (파란색 음영)이 전압 트레이스의 상단에 그려져 있습니다. ( d ) 6Hz 광 시뮬레이션 (기준선, 자극, 사후) 전후의 LFP 파형의 스펙트로 그램 및 파워 스펙트럼. ( e ) isolat의 저배율 명 시야 및 형광 이미지CA1 / SUB 부위에 국소화 된 eYFP 형광 (녹색)을 나타내는 에드 하 마커 제제. ( f ) 기록 된 PV-TOM 간질 신경 세포 (아래 40X 형광 영상)의 Fast-Spiking (FS) 거동을 보여주는 현재 단계 특성화. ( g ) 3 Hz에서 자발적인 장 진동 (왼쪽)과 광 자극 (오른쪽) 동안 LFP 신호와 동기화 된 기록 된 PV 셀의 큰 EPSP 및 리듬 발사를 보여주는 막 전위 기록. ( h ) CA1 / SUB LFP 신호에 대한 PV 셀 스파이크의 필드 트리거 평균 (FTA). 여러 번의 실험 (LFP 피크를 중심으로)을 통한 PV 셀의 방전은 자연 발진 (기준선) 및 광 자극 (자극) 중에 기록 된 스파이크의 FTA로 변환되었습니다. 중간 그래프와 하단 그래프는 스파이크 및 스파이크 확률 막대 그래프의 래스터 도표를 보여줍니다 (평균 확률은 빨간색으로 표시됨). 최상단의 그래프는 lig 동안 전력이 증가한 평균 LFP 신호의 플롯을 보여줍니다PV 전지의 고도로 동기화 된 발사와 병행하여 자극은 LFP 발진의 피크에 위상 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블.

표 2.

저자는 상업적 또는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.