식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

요약

선물이 RIP-태그;를 활용 하 여 소설 체세포 유전자 전달 시스템을 설명 하는 프로토콜 RIP-tva 마우스 모델 전이에서 유전자의 기능 연구. 조류 레트로 바이러스 intracardiacally 성인 쥐에서 췌 장 β 세포의 사전 악성, 비 침 투 적인 병 변으로 유전자 전송을 보장 하기 위해 전달 됩니다.

초록

전이성 암은 단단한 종양을 가진 환자에 있는 죽음의 90%를 차지 한다. 암 전이의 드라이버를 더 잘 이해 하 고 소설 치료 목표를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다. 조사를 진행 주 암에서 전이를 분자 이벤트, 우리 bitransgenic 마우스 모델, RIP-태그; 개발 RIP-tva. 이 마우스 모델 쥐 인슐린 발기인 (RIP) 췌 장 β 세포에 SV40 T 항 원 (태그)와 하위 조류 leukosis 바이러스 (tva)에 대 한 수용 체의 식 드라이브. 쥐 증식, 혈관 신생, adenoma, 침략 암 등 단계와 비슷한 인간의 tumorigenesis는 잘 정의 된 단계를 통해 100 %penetrance 췌 장 신경 내 분 비 종양을 개발 합니다. 때문에 RIP-태그; RIP-tva 마우스 전이성 질병을 개발 하지 않습니다, 전이 촉진 유전자 변경 쉽게 확인 될 수 있다. 체세포 유전자 tva 표현으로 전송, 췌 장 β 확산 premalignant 병 변 원하는 유전 변경 은닉 조류 레트로 바이러스의 intracardiac 주사를 통해 달성 된다. titer > ml 당 1 x 10⁸ 감염 단위 vivo에서 감염에 대 한 적절 한 것으로 간주 됩니다. 또한, 조류 레트로 바이러스 RIP-태그; 종양에서 파생 된 셀 라인을 감염 시킬 수 있습니다. RIP-tva 고효율 쥐. 셀 라인 또한 전이성 요인 특성을 사용할 수 있습니다. 여기이 마우스 모델을 이용 하 여 세포 선 종양 전이에 후보 유전자의 기능을 평가 하는 방법을 보여 줍니다.

서론

대부분의 암은 체세포 돌연변이 ¹에서 발생 한다. 기존의 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM)는 특정 유전 변경 tumorigenesis ²에 기여에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 그러나, 그들은 몇 가지 제한이 있다. 이러한 모델의 주요 단점은 인간, 조직 내의 일부 셀만 유전 변경을 획득에 종양 형성의 산발적 인 특성을 복제 하지 않습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 쥐에 있는 돌연변이 생식 개발에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 또한, 이러한 마우스 모델 생성 이며 비싼 시간이 걸리는.

전이 암 분야에서 중요 한 문제입니다. 전이 모델링은 GEMM에서 어렵게 되었습니다. 자연 스러운 전이 마우스에서 희소 하다. Penetrance 변수 이며 대기 시간 전이 ³의 GEMM에 오래입니다. 그래서 전이성 캐스케이드의 초기 단계는 제거 실험 전이 모델 마우스의 순환으로 세포의 직접 주사를 사용 합니다.

마우스 모델에서 전이성 요인 공부에 상기 제한 중 일부를 해결 하려면 bitransgenic 마우스 모델, RIP-태그; 개발 했습니다. RIP-tva⁴. 전략은 하위 그룹 A 조류 leukosis 바이러스, tva ^6,7에 대 한 높은 동기화 종양 진행 마우스 모델, RIP 태그 ⁵, 그리고 수용 체의 사용을 결합에 기반. 이 RIP-태그; RIP-tva마우스 모델 유전자 somatically 단일 bitransgenic 마우스 스트레인에 소개 될 수 있습니다. Rb, p53 종양 진압 기능 억제 SV40 T 항 원을 가진 쥐 증식, 혈관 신생, adenoma, 침략 암 등 단계와 비슷한 방식으로 인간의 tumorigenesis, 췌 장 신경 내 분 비 종양을 개발 합니다. RIP-태그 모델이 암, 췌 장 신경 내 분 비 종양에 국한 되지 않음의의 우리의 이해를 위해 매우 유익 했습니다. 그것은 또한 전 임상 실험 ⁸에서 사용 되었습니다.

선물이 RIP-태그;에 조류 레트로 바이러스 intracardiacally의 주입을 통해 체세포 유전자 전송 위한 프로토콜 RIP-tva 쥐. RCASBP 파생 조류 레트로 바이러스와 성공적인 감염 대상 셀을 적극적으로 확산이 필요합니다. 따라서, 우리 선택 RIP-태그; RIP-tva 증식 췌 장 독도의 약 50%에서 발전 하는 때 나이의 7 주에 마우스. 왼쪽된 심 실 intracardiac 주입 높은 titer 바이러스의 감염 10-20 ⁴의 효율성을 달성 하기 위해 필요 합니다. 이 전달 방법 바이러스 췌 장 독도 도달 하기 전에 순환 내에서 바이러스 입자의 중요 한 희석을 감소 시킨다.

이 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 Bcl xL 안티 apoptotic 함수 ^4,9의 독립적인 암 전이 촉진 증명 하고있다. Bcl-xL RIP-태그; tumorigenic 가깝다고 걸쳐 모든 췌 장 β 세포에서 transgene를 통해 표현 했다이 안티 apoptotic 독립적인 전이성 기능 관찰 하지 RIP-Bcl-xL 모델 ¹⁰마우스. 따라서, 우리의 마우스 모델 식별 tumorigenesis의 나중 단계에서 표현 하는 때 유전자의 기능을 특성화 하는 독특한 기회를 제공 합니다. 독도의 2-4% RIP-태그; 종양으로 발전 하기 때문에 RIP-tva bitransgenic 쥐 바이러스 성 감염 및 모든 premalignant 병 변 없이 RCASBP에서 파생 된 조류 레트로 바이러스 감염만 tumorigenesis의 자연적인 과정을 통해 선택적 우위를 부여 하는 요소를 확인할 수 있습니다. 특히, 전이성 요인 가장 쉽게 인식 됩니다이 방법으로 췌 장의 림프절 이나 다른 장기에 전이 RIP-태그;에서 일반적으로 발생 하지 않습니다 때문에 RIP-tva 쥐.

프로토콜

윤리 성명: 실험 동물에 지침 및 규정 명시 된 동물 관리 및 사용 위원회의 Weill 코넬 의학 연구소에 의해 수행 되었다.

1. 선택의 조류 Retroviral 벡터 (RCASBP A 기반 또는 RCANBP(A)-based)

• 벡터 라우 스 육 종 바이러스 ¹¹에서 파생 되었다. 조류 retroviral 벡터 cDNAs를 제공할 수 있습니다 (≤ 2.5 kb), 짧은 헤어핀 RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs), 그리고 다른 noncoding RNAs. 상용 벡터 자료에 나열 되 고 다른 사람을 저자에서 직접 요청할 필요.
• 관심의 유전자 overexpress를, 다음 벡터 중 하나를 사용 하 여 RCASBP(A) ¹² ( 그림 1A), RCAS-X ( 그림 1B), RCAS Y ¹³ ( 그림 1C), RCASBP-Y DV ¹⁴ 또는 다른 ALV A 벡터 (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
• ShRNA로 관심의 유전자를 노크, 다음 벡터 중 하나를 사용: RCAN X DV ¹⁵ 또는 RCAS RNAi ¹⁶.
• MiRNAs overexpress에, ¹⁷에 설명 된 대로 RCAS 미르 벡터 생성.
• 대장균 DNA 요구 사항으로 변환.
• 는 직접 반복 및 retroviral 시퀀스를 안정화 하기 위해 독특한 유전자는 Stbl2 또는 Stbl3 유능한 세포 DNA를 선호 변환. 순수, 얻을 것 이다 하는 메서드를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 transfection 학년 DNA. DNA의 5 µ g 0.1 µ g / µ l의 최소 농도 필요한.

2. 치킨 구와 DF1 셀 라인에서 바이러스 전파

1. 필터링 된 피 펫 팁의 사용 교차 오염 바이러스를 방지 하기 위해 세포 배양 필요 주식 ¹⁸.
2. 유지 DF1 세포 성장 6 cm 접시에 매체 (DMEM 높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 6 mM (최종 농도)와 L-글루타민, 10 단위/ml 페니실린, 10 µ g/ml 스) 37 ^o C에 5% CO ₂. DF1 셀은 갓 동 냉동된 주식에서 하는 경우 transfection 전에 적어도 3 일 동안 문화.
3. Transfection, 전에 1 일 transfection 시 30-50% 합칠 것입니다 그들은 그렇게 6 cm 조직 문화 접시에 DF1 셀 패스.
4. 조직 문화 후드 내부의 microcentrifuge 튜브에서 150 µ l의 총 볼륨 (혈 청, 페니실린 또는 스) 없이 DMEM과 순수한 바이러스 성 DNA의 희석 5 µ g.
5. 희석된 DNA 튜브에 직접 Superfect의 추가 30 µ L, 소용돌이 10이 혼합물 s; 두고 조직 문화에서 5-10 분 동안 실내 온도에 혼합물 transfection 복잡 한 형성 수 있도록 후드.
6. 복잡 한 형성 동안 부드럽게 DF1 세포 배양 접시에서 성장 매체를 발음 하 고 신중 하 게 씻어 4 ml PBS ^-/- 셀.
7. 피펫으로 5 ml의 성장 매체 (혈 청 및 항생제 포함); 다음 단계; 팔 콘 튜브를 4 ml를 저장 하 고 transfection 복합물에 성장 매체의 1 ml의 나머지 부분을 추가. 두 번, 아래로 pipetting으로 혼합 하 고 즉시 전체 transfection 단지 DF1 셀에 전송. 소용돌이 셀 계층 덮여; 되도록 2-3 시간 동안 37 ^o c.에 품 어
8. Transfection 혼합물 발음, 4 ml PBS ^-/- 세포를 씻어, 신선한 성장 매체 (혈 청 및 항생제 포함)의 4 개 ml를 추가, 37 ^o C 인큐베이터에 셀 반환.
9. 셀 confluency에 도달, 통로 (과도 식 수 수 분석 48 ~ 72 h transfection 후) 셀.
10. 계속 모든 셀은 아마도 감염 때까지 약 7 일 동안 세포 전달; PCR에 의해 바이러스 성 DNA 통합 테스트 및 서 부 럽;에 의해 단백질 식을 결정 하 고 10 %DMSO 20% 태아 둔감 한 혈 청으로 DMEM 매체에 세포 동결.

3. Vivo에서 태그-RIP;의 감염 RIP-tva 마우스

1. 바이러스 수집 및 농도
   사용 갓 vivo에서 감염에 대 한 바이러스를 집중. 1 주일 이내 4 ^o C에에서 보관 하는 바이러스 titer 크게 감소 되지 않는다. 그러나, 바이러스 성 주식의 냉동된 aliquots 녹고 시 10 감소 titer를 표시합니다.
2. 필요한 바이러스의 양에 따라 15 cm 요리에 확장 바이러스 제작자 DF1 셀
   . 에 대 한 vivo에서 마우스, 마우스 당 한 접시의 평균 준비.
   1. 전 진정 회전자 (예, SW28), 스윙 양동이 4 ^o c.에 ultracentrifuge 기계
   2. 수집 상쾌한 confluent 15 cm 요리에서. 1650 x g 4 ^o c.에서 10 분 동안에 저속 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거
   3. 전송 바이러스 상쾌한 ultracentrifuge 튜브 (Polyallomer 원심 분리기 튜브). ultracentrifuge에서 95,400 x g 4 ^o c.에서 1.5 시간 동안 회전 베크만 XL-100 ultracentrifuge 기계 사용 Accel: 1; Decel: 1 설정.
   4. Ultracentrifuge에서 제거 상쾌한 튜브 가능 한 한 많이. 칼슘과 마그네슘 (PBS ^-/-) 없이 한 15cm 접시에서 최종 100 µ l 바이러스 성 정지 수 있도록 ultracentrifuge 튜브 PBS를 추가 합니다. Parafilm 튜브 커버. Vortexing는 ultracentrifuge 튜브 중간 속도에서 2 분으로 보이지 않는 바이러스 성 펠 릿 resuspend.
   5. 바위 4 ^o C 하룻밤에 한 시간 동안에 ultracentrifuge 튜브.
   6. 는 Microcentrifuge 튜브로 바이러스 성 현 탁 액을 전송합니다. 쥐에 주입 하기 전에 실내 온도에 바이러스 성 정지 워밍업.
3. 바이러스 Titer 결정.
   모든 새로운 바이러스 성 구조에 대 한 바이러스 titer vivo에서 감염 전에 결정 될 필요가 있다.
   1. 12 음 조직 문화 접시의 모든 우물에 씨앗 DF1 셀 (제안: 2 × 10 ⁴ 셀/글쎄, 1 ml/음), 그들은 감염 시 30% 합칠 수 있도록. 1 12-잘 접시 한 바이러스 titer 결정 필요.
   2. 다음과 같이 성장 매체에서의 바이러스 상쾌한 10 희석의 시리즈를 만들기: 10 ² 희석 microcentrifuge 튜브에 대 한
      1. 495와 믹스 5 µ l 바이러스 성 상쾌한 µ l 성장 매체. 잠시 몇 초간 소용돌이.
      10 ³ 희석에 대 한 microcentrifuge 관에서 360 µ l 성장 매체로
      2. 걸릴 40 µ l 10에서 ² 희석 잠시 몇 초간 소용돌이.
      3. 따라 단계 3.2.2.2 10 ⁴ 및 10 ⁵ 희석.
      4. 세트 5 6 ml 폴리스 티 렌의 튜브. Aliquot 2.25 ml 성장 매체, 튜브 및 라벨 그들 10 ⁶, 10 ⁷, 10 ⁸ 10 ⁹, 10 ¹⁰, 각각.
      5. 6 ml 10 ⁶ 희석에 대 한 폴리스 티 렌 튜브에에서 2.25 ml 성장 매체와 10 ⁵ 희석에서 0.25 ml를 혼합. 잠시 몇 초간 소용돌이.
      6. 따라 단계 3.2.2.5 10 ⁷, 10 ⁸, 10, ⁹ 및 10 ¹⁰ 희석.
      7. 12-잘 접시에 DF1 셀에서 원래 문화 매체를 제거합니다. 넣어 잘 각에 중복 1 ml 희석 바이러스 (감염 되지 않은, 10 10 ^{10 6} IU/ml).
   3. 셀 (trypsinzation 필요한 경우 수행) 적어도 7 일 동안 성장 하는 것을 허용. 세포 DNA 및 PCR에 의해 바이러스 성 DNA의 존재에 대 한 확인에 설명 된 대로 분리 수집 " 6. PCR 프로토콜 ". 만약이 바이러스 titer (IU/ml) 당 10 ⁸ 전염 성 단위, RCASBP의 긍정적인 398 bp PCR 제품 10 세포에서 DNA를 사용 하 여 관찰 될 것 이다 ⁸ 10 ⁶ IU/ml 바이러스에만 감염 되지 않은 셀 또는 셀 10에서 10 ^{10 9} IU/ml 바이러스입니다. titer > vivo에서 감염에 대 한 1 x 10 ⁸ ml 당 감염 단위를 사용 해야 합니다.
4. Intracardiac 주입
   Hemizygous RIP 태그 쥐, 하지 homozygous 쥐,이 연구에 사용 됩니다. Hemizygous RIP 태그 마우스 개발 췌 장 신경 내 분 비 종양 약 10 ~ 12 주 나이, homozygous 쥐 짧은 종양 대기 시간 동안. 세포 증식 호스트에 바이러스 성 cDNA의 설립에 대 한 필요 하기 때문에 게놈, 7 주 된 RIP-태그; RIP-tva hyperplasic 췌 장 β 세포와 쥐 사용 됩니다. 가장 일반적인 β 세포 성인 쥐에 확산 하지는 note 하시기 바랍니다.
   1. 사용 7 주 된 RIP-태그; RIP-tva는 실험에 대 한 순수한 C57BL/C 배경에서 마우스.
   2. Anesthetize 마우스 (150mg/kg, 15 mg/kg) 케 타 민/xylazine 조합을 사용 하 여. 열 지원을 사용 하 여 마 취의 전체 기간에 걸쳐 마우스 체온 유지.
   3. 양쪽 눈 각 막 건조 방지 하기 위해 눈 윤 활 유 적용.
   4. 면도 머리 RIP-태그;의 가슴 구멍에서 RIP-tva 쥐. 향하도록 가슴을 가진 그것의 뒤에 마우스를 위치 합니다. 발가락-핀치 전체 마 취 효과 확인 하려면 응답 속도 대 한 동물을 관찰 하기 위해 수행 됩니다.
   5. 앞 다리를 확장 하 고 테이프와 그들을 보호. 마크 마우스 ' 주입에 대 한 s 가슴. Sternal 노치와 xyphoid 프로세스의 상단 사이의 위치 중간 고 약간 왼쪽 흉 골 ( 그림 2)의 (해 부).
   6. 스크럽 povidone-요오드 스크럽 또는 액체 스크럽 앞쪽 가슴 벽 뒤에 70% 이소프로필 알코올 또는 70% 에탄올 젖은 거 즈 스폰지.
   7. 메 마른 28 g ½ 인슐린으로 공기의 그릴 50 µ l 주사기 플런저와 500 µ L 주사기의 초승달 모양 사이 공간을 창조 하 고 바이러스의 100 µ l를 그립니다. 공기 공간 벽에 어떤 액체 없이 심장 펄스를 보고 결정적 이다.
   8. 계속 바늘 직 마우스의 피부 긴장 한 손으로 누른 표시 된 위치에 바늘을 삽입 합니다. 혈액의 밝은 빨간 펄스 주사기에 나타나면, 바늘을 전진 중지 하 고 한 손으로 마우스에 바늘의 깊이 수정.
   9. 다른 손을 신중 하 게 사용 하 고 천천히 ~ 60 초 동안 바이러스 성 현 탁 액 (~ 100 µ l 볼륨)를 제공 하는 플런저를 밀어. 주사기에 표시 혈액의 밝은 빨간 펄스를 볼 때마다 10-20 µ l를 제공 합니다. 투명 한 바늘 허브에 빨간 산소 혈액의 지속적인 입구 왼쪽된 심 실에 바늘의 적절 한 위치를 나타냅니다.
   10. 바이러스 성 현 탁 액을 제공 하 고 보고 하기 전에 혈액의 다음 빨간 펄스, 신속 하 게 가슴 구멍으로 바늘을 철회 하는 플런저의 마지막 강요 후.
   11. 적어도 1 분에 대 한 출혈을 줄이기 위해 주사 사이트에 부드러운 압력을 적용
   12. 신중 하 게가 열 패드 또는 완전히 식을 때까지 열 램프 아래에서 마우스를 이동 합니다. 그들은 자극에서 벗어날 수 있도록 마 취 기운이 떨어지기 때까지 마우스를 지켜보고 있을 것입니다 일반적으로 약 1 시간 지속 기간. 마우스도 그대로 코트와 행동의 변화에 대 한 매일 모니터링할 것입니다.

4. 종양의 histopathological 분석

주입 후

1. 9 주 16 주 된 안락사 RIP-태그; RIP-tva 쥐. 크기와 기본 췌 장 종양 및 어떤 심한 전이의 숫자를 기록.
2. 수정 췌 장, 간, 또는 다른 기관의 10%에 버퍼링 말린 하룻밤 락 플랫폼에 실 온에서.
3. 는 다음날에 70% 에탄올에 고정된 조직 전송. 파라핀 끼워 넣어진 섹션으로 조직 처리.
4. 수행 immunohistochemical synaptophysin (neuroendocrine 마커) 또는 인슐린 (β 세포 특정 마커) 제조 업체에 따라 얼룩 ' s 지침 췌 장 β 세포 췌 림프절에의 전이 확인 하 또는 간입니다. 그러나, 드 차별화 된 종양 세포 또는 가난 하 게 분화 된 종양 세포 인슐린의 식을 잃을 수 고만 synaptophysin immunostaining에 의해 검출 될 수 있다.

5. 생체 외에서 Tva 표현 세포의 감염

집중된 바이러스를 사용 하 여 체 외에서 감염에 대 한 필요는 없습니다. 아래에 설명 된 프로토콜 감염의 2 라운드입니다. 감염의 추가 라운드는 다음 프로토콜을 반복 하 여 수행할 수 있습니다.

1. 수집 confluent DF1 세포에서 바이러스 성 상쾌한. 4 ^o C 1 주일 이내 감염에 바이러스 성 상쾌한을 유지. 감염, 전에 통과 바이러스 상쾌한 셀 무료 바이러스를 0.45 μ m 필터.
2. 간단히 씻어 tva 표현 대상 셀 (즉, N134 췌 장 β 세포 종양 셀에서에서 라인 RIP-태그; RIP-tva 마우스) PBS ^-/- 혈 청의 모든 흔적을 제거 하려면, 트립 신 억제제를 포함 하는. 짧게 트립 신-EDTA (0.25% Trypsin 2.21 mM EDTA) 등 솔루션 tva 표현 대상 셀 린스. 트립 신-EDTA 솔루션을 추가 하 고 2 분 동안 품 어. 부드럽게 접시를 누릅니다. 거꾸로 현미경 세포를 관찰 합니다. 셀은 일반적으로 분리 2 ~ 3 분에 씨 대상 셀 6 cm 격판덮개로. 사용 3 ~ 4 ml 필터링 성장 매체로 바이러스 상쾌한.
   참고: 바이러스 상쾌한에 영양 DF1 세포에 의해 소모 됩니다, 그래서 변경 매체 다음 날.
3. 다음 날, 충분 한 양의 바이러스 상쾌한 실내 온도를 따뜻하게. 대상 셀에서 매체를 제거 하 고 3-4 ml 바이러스 상쾌한 바꿉니다.
4. 세번째 날에 필요에 따라 셀을 통과. 셀 충분히 조밀한 passaged 수 있다면, 일반 성장 매체의 ~ 4 ml를 따뜻하게 (DMEM 높은 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청, 6 mM (최종 농도)와 L-글루타민, 10 단위/mL 페니실린, 10 µ g/mL 스) 대체 바이러스 상쾌한 하.
5. 확장 세포를 감염 하 고 서양 ¹⁹ blotting에 의해 후보 단백질 표정 검토. Transwell 분석 실험에서 마이그레이션 침공에 대 한 후보 유전자의 효과 분석할 수 있습니다. 이러한 셀 라인 또한 간 전이 대 한 꼬리 정 맥 시험에 그들의 전이성 잠재력에 대 한 테스트할 수 있습니다.

6. PCR 프로토콜

솔루션 얼음에 최대한 신속 하 게 조립 해야 한다. 서식 파일 없이 mastermix PCR 튜브에 aliquoted 및 샘플의 많은 수를 위해 만들 수 있습니다. 각 시 약 샘플 수에 필요한 금액을 곱하면 됩니다. 터치 사전으로 시 약을 혼합 하 고 일부는 mastermix에 추가 하기 전에 피펫으로 팁 소용돌이. 도움말 안에 모든 오차를 제공 하는 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 mastermix 튜브를 각 시 약을 추가한 후.

1. 감염 또는 transfected 세포 RCASBP의 존재를 감지 하.
   다음 프로토콜은 mastermix의 11.5 µ L 각 샘플에 대 한 게놈 DNA의 1 µ L에 대 한 호출합니다. 각 시 약을 추가 하기 전에 소용돌이를 있는지 확인 하십시오.
   1. 7.68 µ L nuclease 무료 물, 0.75 µ L DMSO, 1.25 µ l 10 x 버퍼 II AmpliTaq DNA 중 합 효소에 대 한, 25 mm MgCl ₂, 1.375 µ l 25 mM dNTP의 0.125 µ l의 mastermix 준비.
   2. 100 µ M 앞으로 뇌관 RCAS5626F의 0.125 µ L를 추가: (5 '-ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA-3 ')와 반전 뇌관 RCAS6023R 100 µ M의 0.125 µ L: (5 '-CCGCAACACCCACTGGCATTACC-3 ')는 mastermix 하.
   3. 0.075 µ L를 추가 AmpliTaq DNA 중 합 효소는 mastermix 하.
   4. 는 손가락으로 튜브를 터치 하 여는 mastermix 믹스. 원심 분리기 기계 briefl에서 matermix 아래로 회전y 3 ~ 5 초.
   5. 각 개인에 게는 mastermix에서 aliquot 11.5 µ L PCR 튜브합니다. 새로운 튜브에 aliquoting 하기 전에 때마다 소용돌이.
   6. 소용돌이 각 PCR 튜브에 1 µ L genomic DNA 템플렛을 추가 하 고. 게놈 DNA 준비: 0.05 M NaOH의 200 µ l에서
      1. Lyse 세포 펠 릿. 펠 릿을 해산 하기 위해 위쪽 및 아래쪽 피펫으로.
      2. 25 식 후 세포 lysate PCR 기계에 20 분에 98 ° C에가 열 ° c.
      3. 추가 20 µ L 1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) 튜브 및 상점 4에서 DNA 샘플을 ° c.
   7. 짧게 3-5 초에 대 한 샘플 flicking 및 원심 분리기에 의해 혼합. PCR 기계에 튜브를 넣어.
   8. 는 PCR 조건 뒤에 30의 40 주기 초기 변성 92 ° C에서 2 분 동안 설정 되어 변성, 30 대 94 ° C에서 s s 67 어 닐 링, 30 ° C에서 확장, 72 ° C와 최종 연장 위한 72 ° C에서 10 m s.
   9. PCR를 마치면 각 샘플을 DNA 로드 염료 x 6의 3 µ L를 추가 합니다. 터치와 3 대 짧게 분리기 믹스 ~ 5 초.
   10. PCR 제품에서 1 x TAE 버퍼에는 2% (w/v) agarose 젤 전기 이동 법으로 검사 합니다. PCR 제품의 크기는 398 bp.
2. 태그 유전형.
   다음 프로토콜은 mastermix의 10.5 µ L 각 샘플에 대 한 게놈 DNA의 2 µ L에 대 한 호출합니다. 각 시 약을 추가 하기 전에 소용돌이를 있는지 확인 하십시오.
   1. 4.5 µ L nuclease 무료 물, MyTaq 반응 버퍼 x 4.00 µ L 5의 mastermix MyTaq DNA 중 합 효소에 대 한 준비.
   2. 0.4 µ L 100 µ M 앞으로 뇌관 TagF2의 추가: (5 '-GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3 ') 및 0.4 µ L 100 µ M의 뇌관 TagR2 역: (5 '-CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG-3 ') 마스터 믹스.
   3. 내부 제어를 위한 10 µ M 베타-2-microglobulin 전조 (B2m) 뇌관 믹스의 0.8 µ L를 추가합니다. PCR 뇌관 B2m에 대 한 내부 통제, 베타-2-microglobulin 전조 (B2m), b 2 F는 (5 '-CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA-3 ')와 B2 R (5 '-TCCACACAGATGGAGCGTCCAG-3 ').
   4. 0.4 µ L를 추가 MyTaq DNA 중 합 효소는 mastermix 하.
   5. 는 손가락으로 튜브를 터치 하 여는 mastermix 믹스. 3 원심 분리기 기계에서 mastermix 아래로 회전 ~ 5 미
   6. 각 개인에 게는 mastermix에서 aliquot 10.5 µ L PCR 튜브합니다. 새로운 튜브에 aliquoting 하기 전에 때마다 소용돌이.
   7. 소용돌이 각 PCR 튜브를 2 µ L genomic DNA 템플렛을 추가 하 고. 위에서 설명한 대로 genomic DNA 준비.
   8. 믹스 솔루션 flicking 및 원심 분리기에 의해 짧게 3-5 초에 대 한. PCR 기계에 넣고 튜브.
   9. 는 PCR 조건 초기 변성, 15의 35 주기 다음에 대 한 95 ° C에서 3 분 설정 됩니다 s 변성, 15에 대 한 95 ° C에 어 닐 링, 30를 위한 65 ° C에서 s s 확장, 72 ° C와 최종 연장 위한 72 ° C에서 10 분.
   10. PCR를 마치면 각 샘플 염료 로드 x 6의 3 µ L를 추가 합니다. 터치와 3 대 짧게 분리기 믹스 ~ 5 초.
   11. PCR 제품에서 1 x TAE 버퍼에 2% (w/v) agarose 젤 전기 이동 법으로 검사 합니다. 태그와 B2m PCR 제품의 크기는 450 ~ 혈압과 300 bp, 각각.
3. tva 유전형.
   다음 프로토콜은 각 샘플에 대 한 시 약 믹스의 10.5 µ L에 대 한 호출합니다. 각 시 약을 추가 하기 전에 소용돌이를 있는지 확인 하십시오.
   1. 5.6 µ L nuclease 무료 물, 0.5 µ L DMSO, 1.25 µ L 10 버퍼 II에 대 한 AmpliTaq DNA 중 합 효소, 배 및 25 mm MgCl ₂, 1.375 µ L 및 25 mM dNTP의 0.125 µ L의 mastermix 준비.
   2. 100 µ M tva-3의 0.125 µ L 추가 (5 '-GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC-3 ')와 100 µ M tva-5의 0.125 µ L (5 '-CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG-3 ')는 mastermix 하.
   3. 10 µ M B2m 뇌관 믹스는 mastermix 내부 컨트롤의 추가 1.275 µ L.
   4. 0.125 µ L를 추가 AmpliTaq DNA 중 합 효소는 mastermix 하.
   5. 는 손가락으로 튜브를 터치 하 여는 mastermix 믹스. 3-5 초 동안 짧게 원심 분리기 기계에서 mastermix 아래로 회전.
   6. 각 개인에 게는 mastermix에서 aliquot 10.5 µ L PCR 튜브합니다. 새로운 튜브에 aliquoting 하기 전에 때마다 소용돌이.
   7. 소용돌이 각 PCR 튜브에 2µL genomic DNA 템플렛을 추가 하 고. 위에서 설명한 대로 genomic DNA 준비.
   8. 터치 하 여 솔루션을 믹스와 원심 분리기 짧게 3-5 미에 대 한 튜브에 넣어 PCR 기계.
   9. 는 PCR 조건 초기 변성, 30의 35 주기 다음에 대 한 92 ° C에서 2 분 설정 됩니다 s 변성, 30 대 94 ° C에서 어 닐 링, 확장, 72 ° C에서 30 초 및 최종 연장 위한 72 ° C에서 10 분 동안 60 ° C에서 s.
   10. PCR를 마치면 각 샘플 염료 로드 x 6의 3 µ L를 추가 합니다. 터치 하 고 잠시 3-5 미에 대 한 원심 분리기에 의해 혼합
   11. PCR 제품에서 1 x TAE 버퍼에는 2% (w/v) agarose 젤 전기 이동 법으로 검사 합니다. Tva와 B2m PCR 제품의 크기는 500 bp와 300 bp, 각각.

결과

Vivo에서 그리고 생체 외에서 감염 속도 RIP-태그; RIP-tva RCASBP 기반 바이러스에 의해 종양 세포는 ²⁰~ 20%와 ~ 80% 각각. RIP 태그; RIP-tva 마우스 모델, 각 마우스에 400 췌 장 독도의 약 4% 종양 ²⁰;에 개발 자연스럽 게 따라서 바이러스에 의해 전달 되는 유전자의 잠재적인 효과의 조직학 및 phenotypic 분석에 대 한 각 마우스에서 종양 세포의 충분 한 금액이입니다. 이 시스템을 사용 하 여, 전이에서 Bcl xL의 새로운 핵 기능 확인 된 ⁹이었다. RIP-태그; RIP-tva RCASBP-Bcl xL 감염 쥐 전시 높은 발생률 침략 carcinomas의 제어 바이러스에 감염 된 생쥐 보다 RC...

토론

이 연구에서 설명 하는 강력한 마우스 모델, RIP-태그; RIP-tva, 식별 및 전이성 요인의 특성에 대 한 조류 레트로 바이러스를 통해 체세포 유전자 납품을 달성 하기 위해. 비록 RIP-태그; RIP-tva 마우스 췌 장 신경 내 분 비 종양, 전이성 요인이 마우스 모델에서 확인 된 또한 다른 암 종류의 전이 홍보 수 있습니다.

우리의 접근 시간 제어 방식으로, 따라서 더 충실 하 게 흉내 낸 산발적 인 인간 종양 개발에 특히 췌 장 β 세포의 premalignant 병 변으로 체세포 유전자 변화 소개의 이점이 있다. 이 방법은 기존의 유전자 변형 모델 개발 중 관심사의 유전자의 소성 식 때문에 종종 관찰 되는 정상적인 조직 형성의 어떤 잠재적인 섭 동을 방지 합니다. 또한, 그것은 관심을 생성 하는 유전자 변형 쥐 보다 유전자를 운반 하는 조류 retroviral 벡터를 생성 하는 훨씬 더 빨리입니다. RCASBP 파생 조류 retrovi...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RCASBP-Y DV 플라스미드	Addgene	11478
RCAS-RNAi 플라스미드	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
소 태아 혈청	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-글루타민, 100x	Corning	25-005-CI
페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x	Corning	30-002-CI
PBS-/-, 1x	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
폴리알로머 원심분리기 튜브	Beckman Coulter	326823
0.45 mm Nalgene 주사기 필터(PES 멤브레인 포함	Thermo Scientific	194-2545
인슐린 주사기	BD
synaptophysin	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-6101
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II	Life Technologies
MyTaq DNA Polymerase	Bioline BIO-21106