방법 논문

초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

DOI:

10.3791/55894

⸱

2018년 11월 2일

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

이 논문에서

요약

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여기를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (HR-SD-10 월) subretinal 공간으로 유전자 치료 대리인의 납품을 지원, 그 영역 범위를 평가 하 고 포토 리셉터 활력을 특성화 새로운 접근 방식을 설명 합니다.

초록

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HR-SD-10 월은 라이브 마우스 모델에서 포토 리셉터 변성의 진행을 모니터링, 평가 subretinal 공간으로 치료제의 배달 독성과 효능에서 vivo에서평가 하 고 활용. HR-SD-10 월 적외선 (800-880 nm) 근처를 사용 하 고 광학 특히 하위 2 미크론 축 해상도 마우스 눈의 독특한 광학에 대 한 설계 되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델 외부 망막 (포토 리셉터) 변성 및 컨트롤의 질병의 진행을 평가 하기 위해 몇 군데 있었다. 가져온된 유리 바늘 제공 adeno 관련 바이러스 (AAV) 또는 나노 (NP) 를 통해 하위 망막 주사 트랜스 scleral 트랜스 안 접근 하 사용 되었다. Subretinal 공간으로 바늘의 위치 주의 하위 망막 공간으로 액체를 제공 하는 보정된 압력 주입 전에 필요 했다. 실시간으로 subretinal 수술 이미징 시스템 (RIS) 우리의 망막에 실시 됐다. HR-SD-10 월 시연 한 독성 돌연변이 인간 돌연변이 rhodopsin (P347S)의 표현으로 인해 진보적인 유니폼 망막 변성 (P347S) transgene 쥐에서. HR-SD-10 월 모든 망막 층의 엄격한 정량화를 허용 한다. 외부 핵 층 (ONL) 두께 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 길이 (OSL) 측정 포토 리셉터 활력, 변성, 또는 구조와 연관. RIS 배달 시스템 수 있습니다 subretinal 주사의 실시간 시각화 신생아 (~ P10-14) 또는 성인 쥐, 및 10 월 HR-SD 즉시 배달의 성공을 결정 하 고 지도 영역 범위. 10 월 인사-SD 대뇌 비보의 활력 측정 또한 쥐, subretinal 수술의 성공을 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. HR-SD-10 월 망막 변성, 독성, 그리고 전 임상 유전자 치료 연구에서 치료 구조의 정도 평가 하기 위해 균일 한 동물 동료를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서론

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인간의 질병1,2,,34 에 대 한 치료로 번역 하는 새로운 치료의 희망으로 망막과 망막 퇴행 성 질병의 다양 한 유전자 요법을 개발 하는 연구원 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. 시간 영역 또는 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 외부 망막 변성 질환12,13,14의 특정 마우스 모델의 측면을 조사 하는 데 사용 되었습니다 .....

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프로토콜

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동물 프로토콜 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용의 버지니아 WNY HCS와 버팔로 SUNY에서 대학 위원회에 의해 승인 했다. 동물 협회의 규정에 따라 연구 비전 및 안과 (ARVO)와 헬싱키의 선언에 사용 했습니다.

1. 마우스 모델

  1. 마우스 컨트롤을 포함 하 여 평가 모델을 식별 합니다.
    참고: 이미지는 C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT에 대 한 수행/mWT, 부분적으로 인간 답게 마우스 망막 변성 모델 homozygous 인간의 돌연변이 P347S hC1 대립 야생-타입 (WT)에 대 한 마우스 로+ + 유전자 형26 , 27, hC1 BL/6(J), 돌연변이 인간 로P347S hC1 대립 유전자의 WT 마우스 로단일 복사본을 사용 하 여 부분적으로 인간 답게 모델 x+ + 유전자 (hC1 /-/ / mWT/mWT) (hC1/hC1 / / mWT로 얻은/C57BL/6 (mWT J) 쥐)입니다. 상 염색체 지배적인 망막 화 ....

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결과

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존재, 속도 모델 외부 망막 변성의 균일성 평가
측정은 ONL의 느릅나무, ONL 악기 소프트웨어에서 제공 하는 캘리퍼스 도구를 사용 하 여의 한계를 정의 하는 OPL에서 기록 되었다. 목표는 부분적으로 인간 답게 adRP 마우스 모델에서 외부 망막 변성의 진행을 지도 했다. 제어 C57BL/6(J) 마우스를 hC1/hC1 / / mWT 비교 이미지/mWT 마우스 모델, 돌연변이 인간 막대 opsin (로P347S) 유전자의 두 복사본을 표현 제어 망막 연구 결과 그의 심각한 전시를 표시 했다 고 급속 하 게 진보적인 망막 퇴행 성 조건입니다. 3 주 된 adRP (BL/6(J)) 동물, 돌연변이 인간 로P347S 유전자의 단일 복사본만 있고 마우스 WT로 유전자의 두 복사본 x hC1 정상적인 ONL 두께 근처 했다. 그러나, 후속 인사-SD-O.......

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토론

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10 월 인사-SD 잠재적인 치료제 테스트에서 그들의 유용성을 결정 하는 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성에 대 한 간단한 방법을 제공 한다. 신속 하 고 안정적으로 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성 수는 (예를 들어, 교체 유전자 치료, ribozyme 또는 shRNA 최저의 유전자 치료, 결합 된 유전자 치료) 치료 약물 발견의 과정에 중요 합니다. HR-SD-10 월 특성화 및 거의 모든 마우스 모델에서 망막 변성의 진행을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 망막 건강을 평가 하기 위한 간단한, 빠른, 및 비-침략 적 방법을 제공 한다. OCT 이미지 퇴보에 시간이 지남에 따라 외부 망막 (포토 리셉터) 변성의 상세한 평가 또는 치료 구조 시도의 영향을 제공할 수 있습니다. 망막의 다른 층의 일부 또는 전부의 측정을 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 범위 또는 운동 타임 라인입니다. 10 월 인사-SD 전달된 벡터 또는 재료의 독성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 포토 리셉터 망막 변성 연구 .......

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공개 사항

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상업적인 관계: MCB: 없음; JMS: 없음. 이미징 시스템 (RIS)23 이 연구에 사용 된 망막은 쥐, 설치류, 또는 작은 동물에서 유전자 치료 배달 연구 하고자 하는 어떤 그룹에 실질적인 사용의 소설 장치. 저자가이 시간에이 장치에 관하여 선언 하 고 충돌이 동안, SUNY 버팔로-재향 군인의 관리에서 대학 지적 재산에 권한이 고이 악기를 미래에 상용화를 추구 수 있습니다.

감사의 글

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이 자료는 학과의 재향 군인 담당 (버지니아), 재향 군인의 건강 관리, 사무실의 연구와 개발 (생물 의학 실험실 연구 및 개발)에 의해, 부분적으로, 지원 작업 기반 (VA 공로 그랜트 1I01BX000669). JMS는 고용, 부분적으로로 직원 의사-과학자, 안과, 버지니아 WNY; MCB VA WNY에 의해, 부분적으로, 채택 된다. 연구, 실시 하 고, 참전 용사 관리 서양 뉴욕 의료 시스템 (버팔로, 뉴욕)에 의해 부분적으로 지원 했다. 내용 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다. 도 지원, 주요 부분에서 네이 NIH R01 부여 함으로써 EY013433 (PI: JMS), NIH/네이 R24 부여 EY016662 (UB 비전 인프라 센터, 파이: M 학살, 감독-Biophotonics 모듈: JMS), 무제한 부여 하는 학과의 안과/대학에서 실명 방지 (뉴욕), 연구에서 버팔로 그리고 Oishei 재단 (버팔로, 뉴욕)에서 부여. 우리 인정 hC1 유전자 변형 로P347S 선 및 exon 1 마우스의 선물 (Tufts 뉴잉글랜드 의료 센터, 보스톤, MA), 박사 제 니스 렘에서 로 녹아웃 heterozygous 상태에 NHR E transgene 모델의 선물에는 마우스 exon 2로 ....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/A/A
Envisu R-2200 안구 일관성 토모촬영 기기 (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
망막 이미징 시스템 (RIS)내부N/A
Stemi 2000C 현미경Zeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러Sutter Instrument Cop-97
MMN-33 마이크로 매니퓰레이터 Narishige USAMMN-33
PLI-100  마이크로 인젝터Harvard Apparatus64-1736
마이크로피펫 홀더 (회전)사내N/A
마이크로피펫 보관 용기World Precision Instruments Inc.E210
  보로실리케이트 유리 모세관 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
아트로핀 황산염 점안액, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
사이클로펜톨레이트 하이드로클로라이드 안과 용액, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
겐타마이신 설페이트 연고 USP, 0.1%페리고NDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
테트라카인 하이드로 클로바우쉬 및 롬NDC 24208-920-64
안과 용액, USP 0.5 %바우쉬 및 롬NDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
바이러스 제제ViGene / UNCN / A
골드 나노 막대NANOPARTzD12M-850-1.75
플루오레세인 설페이트 AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
커버슬립피셔 사이언티픽12-548-A
펜치밀턴18-825
바늘 30 게이지벡턴 디킨슨   W11604
주사기Beckton Dickenson   
Bioptigen 소프트웨어 패키지BioptigenN/A
프로파라카인 염산염 안과 솔루션, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
스케일Mettler
가위세계 정밀 기기
귀 펀치Nat' l 밴드
CL 100 광원Welch AllynCL100
질소 가스잭슨 용접 공급N/A
온수 수조NeslabRTE-140
가열판In HouseN/A
난방 매트Cincinnatti Sub Zero273
클레이 마우스 홀더Plast.i.clay 아메리칸 아트 클레이 (주)N/A
베타딘메드라인 NDC53329-938-06
코튼 팁 애플리케이터American Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
장갑 니트릴VWR89038-272
Diagnosys ERG 컬러 돔 기기Diagnosys Inc.D125
콘택트렌즈사내N/A
Diagnosys 소프트웨어Diagnosys Inc.N/A
오리진 6.1 소프트웨어OriginLab Corp.N/A
기준 전극OcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24"
N라이드 309659

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W.

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