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방법 논문

초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

9.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55894

⸱

2018년 11월 2일

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

이 논문에서

요약

여기를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (HR-SD-10 월) subretinal 공간으로 유전자 치료 대리인의 납품을 지원, 그 영역 범위를 평가 하 고 포토 리셉터 활력을 특성화 새로운 접근 방식을 설명 합니다.

초록

HR-SD-10 월은 라이브 마우스 모델에서 포토 리셉터 변성의 진행을 모니터링, 평가 subretinal 공간으로 치료제의 배달 독성과 효능에서 vivo에서평가 하 고 활용. HR-SD-10 월 적외선 (800-880 nm) 근처를 사용 하 고 광학 특히 하위 2 미크론 축 해상도 마우스 눈의 독특한 광학에 대 한 설계 되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델 외부 망막 (포토 리셉터) 변성 및 컨트롤의 질병의 진행을 평가 하기 위해 몇 군데 있었다. 가져온된 유리 바늘 제공 adeno 관련 바이러스 (AAV) 또는 나노 (NP) 를 통해 하위 망막 주사 트랜스 scleral 트랜스 안 접근 하 사용 되었다. Subretinal 공간으로 바늘의 위치 주의 하위 망막 공간으로 액체를 제공 하는 보정된 압력 주입 전에 필요 했다. 실시간으로 subretinal 수술 이미징 시스템 (RIS) 우리의 망막에 실시 됐다. HR-SD-10 월 시연 한 독성 돌연변이 인간 돌연변이 rhodopsin (P347S)의 표현으로 인해 진보적인 유니폼 망막 변성 (P347S) transgene 쥐에서. HR-SD-10 월 모든 망막 층의 엄격한 정량화를 허용 한다. 외부 핵 층 (ONL) 두께 및 포토 리셉터 외부 세그먼트 길이 (OSL) 측정 포토 리셉터 활력, 변성, 또는 구조와 연관. RIS 배달 시스템 수 있습니다 subretinal 주사의 실시간 시각화 신생아 (~ P10-14) 또는 성인 쥐, 및 10 월 HR-SD 즉시 배달의 성공을 결정 하 고 지도 영역 범위. 10 월 인사-SD 대뇌 비보의 활력 측정 또한 쥐, subretinal 수술의 성공을 평가할 수 있는 강력한 도구입니다. HR-SD-10 월 망막 변성, 독성, 그리고 전 임상 유전자 치료 연구에서 치료 구조의 정도 평가 하기 위해 균일 한 동물 동료를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

서론

인간의 질병1,2,,34 에 대 한 치료로 번역 하는 새로운 치료의 희망으로 망막과 망막 퇴행 성 질병의 다양 한 유전자 요법을 개발 하는 연구원 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. 시간 영역 또는 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 외부 망막 변성 질환12,13,14의 특정 마우스 모델의 측면을 조사 하는 데 사용 되었습니다 . 그러나 HR-SD-10 월, 되지 않았습니다 광범위 하 게 속도 망막 변성의 공간적 균일성을 결정 하기 위해 최적화 마우스 모델의 평가의 맥락에서 사용 또는 유전자의 전 임상 평가의 맥락에서 기반 치료제, 예를 구조, 독성, 또는 벡터 배달8,,1516의 공간 범위를 평가 합니다. 일단 마우스 모델 특징 완전히 HR-SD-10 월 데이터 구조 또는 망막 변성17의 마우스 모델에서 독성을 발휘 하는 치료제의 영향을 측정 하는 유익 하 고 신뢰할 수 있는 리소스로 사용할 수 있습니다. 많은 그룹은 대뇌와 망막 안료 상피 (RPE) 셀 시험에 그것의 효율성 때문에 벡터 배달의 방법으로 subretinal 주입을 사용 하 여. 그러나, 그것은 일반적으로 각 막 표면에서 직접 수술에 의해 수행 하 고 백 내장, 출혈, 그리고 뒷부분의 조작 하면 발생 하는 의도 하지 않은 망막 분리에 따른 자주 다 마스터, 어려운 방법 남아 유리. 많은 그룹은 여전히 맹목적으로 subretinal 주사를 시도 하 고 비교적 큰 직경 스테인리스 바늘 (34g)8,,1718,19와 수동 주사를 사용 하 여 바이러스를 전달 ,20,,2122, 그리고 몇 사용 광학 일관성 단층 촬영 (10 월) 망막8,17, 에 벡터의 적절 한 배달 확인을 이미징 20 , 22. 몇 가지 개선 방법에는 최근 설명 눈금 바늘 micromanipulator22에 의해 주도 사용 하 여.

우리는 바늘의 위치에서 에이즈는 통합 된 접근 방식을 제시 하 고 주사 사용자 지정 지시 스테레오 ophthalmoscope 마우스17, 의 작은 눈 내 머릿속에 맞게 실험실에서 설계에 의해 촉진 된다 23. stereotaxic micromanipulator와 함께에서 가져온된 유리 마이크로 바늘의 사용 이전에 바늘 배치 필요 (즉, conjunctivae 및 결합 조직 통해) 아래로 수술 커트의 더 나은 제어를 제공 사출입니다. 압력의 사용 규제 마이크로 인젝터 도움이 제공 일관 된 주입 볼륨, 그리고 주사 훨씬 더 중대 한 안정성, 정밀, 그리고 휴대용 주사기, 감소에 의해 수행 하는 수동 주사 보다 훨씬 더 느리게 할 수 있는 눈에 거품 주입 발생 작은 바늘 경로가 자체 봉인 때문에 바늘 철수에 따라 누설을 방지할 수 있습니다. 사출/배달의 정도 평가 하기 위해 많은 조사 그룹 찾기 및 실험 끝에 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식 (식 구조는 벡터에 의해 전달) 망막에서의 면적 범위를 평가에 의존 (안락사) 성공적인 주사11,19,,2024확인 가리킵니다. 이 접근 (10 월을 활용 하지) 수술 성공 이후 수술 (알 수 없음된) 오류와 함께 모든 동물 필요가 유지 될 때까지 반복 측정을 가진 뒤 수술 절차 시간에 동물, 엄청난 양의 자원 낭비 확인 안락사와 눈 추수 (때 EGFP 측정 된다). 주사 (즉 subretinal 공간) 망막의 정확한 레이어 사이 보여주는 시간-SD-10 월을 사용 하 여 망막에 주입의 위치 확인을 개선할 수 있습니다. 10 월 인사-SD 즉시 접근 향상을 실제 수술 시간 관련 변수를 식별 하기 위해 (수술 실패) 시도 실패 윤곽을 그리 다 사용할 수 있습니다. 우리는 HR-SD-10 월 이점을 제공 합니다 수많은 임상 유전자에서 치료 연구 외부 망막 변성의 급속 한 양적 평가 함으로써 식별/실험 기준 ( 에 부합 하지 않는 연구 동물의 도태 수 발견 예를 들어, 잘못 된 subretinal 주입), 직접 어디 벡터 (여기서 전 임상 효과 가장 가능성이) 배달 되었다 눈의 지역에 따라 영상으로 벡터 배달 되지 않았습니다 영역을 제어 하 고. 개발 이후 SD OCT를 사용 하 여 허용 하 고 안과 연구자에 의해 사용을 계속 하고있다 그리고 이제 마우스 또는 설치류 모델13,25에서 망막 과학적 연구에서 망막 이미징의 표준으로 간주 됩니다. 10 월 인사-SD 및 그것의 소프트웨어 기능을 동물 모델 선택, 선택에 변성의 특성을 포함 하 여 프로세스의 모든 단계에서 마우스 모델에서 성공적인 정량 유전자 치료의 목표를 추가로 독특한 통합 방식에서 이용 하였다 질병 모델, 치료 배달, 벡터를 전달 하며, 독성/효능 평가의 매핑. HR-SD-OCT를 사용 하 여 프로세스의 모든 수준에서 더 효율적인 약물 발견에 대 한 수 있습니다. 여기 우리의 RNA 약물 발견 프로그램에 사용 되는 이러한 접근 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

동물 프로토콜 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용의 버지니아 WNY HCS와 버팔로 SUNY에서 대학 위원회에 의해 승인 했다. 동물 협회의 규정에 따라 연구 비전 및 안과 (ARVO)와 헬싱키의 선언에 사용 했습니다.

1. 마우스 모델

  1. 마우스 컨트롤을 포함 하 여 평가 모델을 식별 합니다.
    참고: 이미지는 C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT에 대 한 수행/mWT, 부분적으로 인간 답게 마우스 망막 변성 모델 homozygous 인간의 돌연변이 P347S hC1 대립 야생-타입 (WT)에 대 한 마우스 로+ + 유전자 형26 , 27, hC1 BL/6(J), 돌연변이 인간 로P347S hC1 대립 유전자의 WT 마우스 로단일 복사본을 사용 하 여 부분적으로 인간 답게 모델 x+ + 유전자 (hC1 /-/ / mWT/mWT) (hC1/hC1 / / mWT로 얻은/C57BL/6 (mWT J) 쥐)입니다. 상 염색체 지배적인 망막 화 (adRP) 위의 모델은 C57BL/6(J) 배경. 마우스 모델 homozygous 마우스 로 녹아웃 배경 인간의 WT 유전자의 두 복사본을 또한 사용된28,29이었다. 이 줄은 129Sv 배경. 이 선 129Sv 배경에서 마우스로 녹아웃으로 교차 했다 때 인간 노 의 단 하나의 복용량 마우스로 배경에서 발생 합니다.
  2. 동물 실험 설계에 관련 된 조건에 따라 유지.
    참고: 동물에는 수의 의료 단위 (VMU) 버지니아 WNY HCS에 유지 되었다. 마우스는 표준 연구소 차 우와 성장된 12 h:12 h 빛 루 했다: 소프트 형광 오버 헤드가 어두운 사이클 백색 약 72 ˚F에서 케이지 수준에서 약 300 럭 스와 조명.

2. 마우스 아이 젤

  1. 망막 이미징30 및 수술 절차에 사용 되는 광학 젤을 준비 합니다.
  2. 2 mg/mL w/v 높은 분자량 (살 균 1 인산 Buffered 식 염 수 (PBS) x 4 x 106 g/mol carbomer 결합.
  3. 실 온에서 혼합 점성 광학 투명 한 젤을 형성 하는 젤까지.
  4. 젤 작은 불 임 병에 전송 하 고 덫을 놓은 기포 제거를 350 x g에서 스윙 양동이 탁상 원심 분리기에 원심.
  5. 젤 마우스 각 막과 프리미엄 커버 유리 (18 x 18 mm) 사이의 인터페이스를 만들려면 각 막에 직접 적용 됩니다.

3. HR SD 10 월 영상

  1. HR-SD-10 월 장치 (그림 1)을 참조 하십시오.
  2. 마 취의 적절 한 복용량을 결정 하기 위해 동물의 무게. 버퍼링 된 2,2,2-tribromoethyl 알콜 (Avertin) 솔루션을 통해 복 주입 (IP)의 2.5% 솔루션의 몸 무게의 25 µ L/g를 사용 하 여 마우스를 anesthetize 그리고 동물 움직일 후 눈동자를 팽창 하는 안 약을 추가 합니다.
  3. 동물 발가락 핀치에 의해 완전히 마 취를 확인 하 고 특정 동물 반응 하지 않습니다.
  4. 수염을 정돈 하 고 10 월 HR-SD 썰매에 마우스를 놓습니다.
  5. 마우스의 눈 바로 투구 렌즈 앞 놓고 각 막 및 홍 채 위치 될 때까지 단계 컨트롤을 조작 합니다. 각 막 인공 눈물을 적용 하 여 수산화 유지.
    참고: 10 월 HR-SD 썰매에 미세 조정 micromanipulators 눈동자 조리개 중심 고 지향 되도록 마우스를 위치 하는 데 사용 됩니다. 광학 투구 망막 표시 됩니다 때까지 동물은 최상의 가능한 이미지를 조정 더 고급 다음입니다.
  6. 첫째, 소프트웨어 프로그램 "마우스"를 열고 "환자/시험"을 클릭 합니다. 둘째, "환자 추가"를 클릭 하 고 새 환자 창에서 동물을 식별 하기 위해 관련 정보를 입력 및 "저장 하 고 종료". 셋째, "추가 시험" 뒤에 "시작 시험" 클릭 합니다. 넷째, "추가 사용자 지정 검사" 클릭 하 고 "직사각형 볼륨"을 선택, 몇 군데 되 고 눈에 대 한 OD 또는 운영 체제를 선택한 다음 "시험 추가"를 클릭. 마지막으로, 악기를 목표로 하 고 관심 영역을 얻기 위해 동물 위치를 시작 합니다. 올바른 영역을 찾는 더 이미지 품질을 향상 시키기 위해 이미지 수집 직전에 주걱을 밀고 메 마른 목화를 사용 하 여 눈 표면에서 어떤 과잉 액체를 제거 "스냅숏 시작", 그리고 좋은 이미지를 얻을 클릭 한 후 "저장 스캔 "입니다.
    참고: 직사각형 HR-SD-10 월 이미지에 대 한 일반 매개 변수는 900 a-스캔/b-스캔 및 90 b-스캔/이미지. 수집 된 이미지는 1.4 m m x 1.4 m m입니다. 몇 군데 망막의 지역 특정 실험에 따라 달라 집니다 하지만 대부분의 이미지는 시 신경 머리 (ONH)으로.

4. 존재, 속도, 및 모델 외부 망막 유년의 균일성 평가

  1. HR-SD-10 월에 의해 외부 망막 변성 모델 평가
    1. 동물을 제어 및 존재, 속도, 그리고 외부 망막 변성의 균일성을 평가 하기 위해 실험 과목에 대 한 연령대의 다양 한 스펙트럼을 얻습니다.
    2. 두 동료 (질병 및 정상)에서 각 나이에 여러 동물에 HR-SD-10 월 이미지를 수행 합니다. 3.1.6에 설명 된 메서드를 사용 하 여 OCT 이미지를.
      참고: 다양 한 기간 (1 년)에 걸친 생일 배포, 한 번에 동물의 대형 코 호트에서 데이터를 수집할 수 있습니다 또는 동물의 작은 코 호트 시간 (1 년) 유사한 결과 얻기 위해 오랜 기간 동안 여러 개의 이미지를 수집 하는 데 사용할 수 있습니다.
    3. 기록 된 시간-SD-10 월 직사각형 볼륨 이미지를 열고 첫 번째 b-스캔 측정 식별 (이상적으로 포함 됩니다는 ONH 또는 다른 식별 랜드마크) 이미지의 앙상블에서. 확대/축소 기능을 사용 하 여 소프트웨어에서 화면을 채우기 위해 이미지를 확대.
    4. B-스캔 이미지를 클릭 하 고 다음 "캘리퍼스" 클릭 하 고 마지막으로 원하는 대로 많은 캘리퍼스를 클릭 하 여 캘리퍼스의 원하는 번호를 엽니다 (그들은 1-10 매겨집니다). 그는 캘리퍼스는 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시를 확인 하십시오. 할당 "캘리퍼스 구성" 기능을 사용 하 여 각 블록 및 망막에 걸쳐 균일 한 배치를 촉진 하기 위하여 마지막으로, 클릭 "표시 캘리퍼스 위치" 설정에서 "수직"으로 모두 적용.
      참고: 1세인트 캘리퍼스 쏟아지는 덱스터 (OD) 오른쪽 눈을 처리할 때 이미지의 왼쪽에 배치 해야 하 고 쏟아지는 불길 한 (OS) 왼쪽된 눈 이미지를 처리할 때 1세인트 캘리퍼스는 이미지의 오른쪽에 배치 되어야 합니다. 이 결과 코에 왼쪽과 오른쪽 눈에 대 한 모든 데이터의 임시 방향 플롯할 때 었 어 요.
    5. B-스캔, 그것은 포함 하는 b-스캔 이미지에 시 신경 머리의 센터에서 한 캘리퍼스를 배치 해야 되 고 걸쳐 각 캘리퍼스 (2.0 m m 간격) 원하는 위치로 이동 컴퓨터 마우스를 사용 하 여 (이 캘리퍼스 0으로 설정). 다음 마우스를 사용 하 여 클릭 하 여 관심 영역을 스팬 길이 캘리퍼스를 끕니다. 임의로 캘리퍼스는 b-최대 길이 검사의 측정 영역을 오버레이 및 데이터 분석 중에 무시 하지 않는 설정.
    6. 외부 제한 막 (느릅나무)와 외부 plexiform 레이어 (OPL)의 하단에 스크류의 하단에는 캘리퍼스의 상단 배치 하 여 캘리퍼스 도구를 사용 하 여 ONL 두께 측정 합니다. 0.2 m m 씩 증가에서 망막에 걸쳐이 각 캘리퍼스에 대 한 반복 합니다. 측정을 저장 합니다.
    7. 후 모든 캘리퍼스 배치 되었고 크기 조정, 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 한 "캘리퍼스 데이터 저장"을 클릭 합니다.
    8. 이후 b-스캔 (각 10회 잘 작품 검색) 같은 직사각형 볼륨 열 등 우수한 지역에서 전체 망막에 걸친 10 월 이미지에서에서 측정을 반복 합니다. 캘리퍼스는 개방적이 고 x 축에 동일한 위치에 유지 됩니다. X-방향으로 그들을 이동 하지 않고는 캘리퍼스의 길이 조정 합니다.
    9. 데이터 처리 b-스캔 옆 작은 파일 아이콘을 클릭 하 여 이미지 파일과 "데이터 이동"을 클릭 합니다 저장을 엽니다. 클릭 "파일을 저장, 시간에 따라 순서 대로 정렬 하 여 각 b-스캔 측정에 대 한 모든 파일을 열고 수정한 날짜.
    10. 프레임 번호를 기준으로 가장 낮은 순서에서 단일 파일로 각 b-스캔에서 원시 데이터를 컴파일하십시오. "캘리퍼스 이름", "길이", 및 "센터 X" 포함 하는 데이터의 열을 선택 합니다.
    11. 센터 X 모든 b-스캔 각 직사각형 볼륨 10 월 이미지 처리에 대 한 측정도 마찬가지 인지 확인 합니다. 측정, 기록 하는 데 사용 되지 않은 캘리퍼스에서 모든 데이터를 삭제 하 고 캘리퍼스 0 시 신경 머리의 가운데에 위치를 설정 합니다.
    12. 여러 Y 데이터 세트는 ONL의 전체 두께를 3 차원 플롯 기능을 대 X에 대 한 데이터 또는 다른 망막 층을 측정 합니다.
    13. ONL 측정 제어와 속도 어떤 잠재적인 망막 변성의 균일성을 확인 하기 위해 해당 연령대와 실험 동물 사이 비교.
    14. OSL 측정 같은 b-스캔 이미지를 사용 하 여 프로세스를 반복 합니다. ONL 느릅나무와 Bruch의 막 (BM) 사이 캘리퍼스 배치를 제외 하 고 측정 하는 데 사용 하는 동일한 방법론을 따릅니다.
      참고: 캘리퍼스를 배치 하는 방법의 예는 대표적인 결과 섹션 (그림 3B)에 표시 됩니다. 이 오류를 줄이는 것에 확대 된 이미지에 행해져야 한다.
    15. 각 실험 모두 생일 및 제어 동료에 대 한 여러 동물에 대 한 데이터 분석을 반복 합니다.
  2. 종합 측정 및 3D 매핑 소프트웨어 캘리퍼스 도구를 사용 하 여 ONL 또는 OSL 두께의
    1. 포스트 주입 10 월 이미지를 검토 하 고 어떤 식별할 수 있는, ONH 또는 혈관 망막에서의 기록. 다음 후속 SD 10 월 같은 지역에서 취득 하 고 같은 식별 랜드마크를 포함 해야 합니다. 마우스를를 놓습니다.
      참고: 몇 군데와 망막에는 망막의 지역 포스트 주입 SD 10 월 이미지에서 식별 됩니다 확인 하십시오. 직사각형 볼륨 SD 10 월 이미지를 기록 하 고 그것을 저장 합니다.
    2. 위의 단계에서 설명한 대로 기록 된 이미지를 처리 4.1.3. 를 4.1.14. 캘리퍼스 데이터 및 위에서 설명한 대로 도면을 저장 합니다.
      참고: ONL 측정의 결과 배열 ONL 두께 묘사한 3D 플롯을 만드는 데 사용 됩니다. X 축 따라 캘리퍼스의 위치 하나 replot 시 신경 축의 원점 (0)에 배치 하는 그래프를 허용 합니다. Y b-스캔 수를 사용 하 여 플롯은 시 신경은 다음 제대로 시 신경에 y 축 원점에 위치 한 시작 지점을 정의 하는 데 사용 됩니다. 각 데이터 세트에서 시 신경 식별 후속 이미지를를 안정적으로 정렬 될 수 있습니다.
  3. 저 이미지에 사출 사이트의 범위를 매핑
    1. 포스트 주입 직사각형 볼륨 10 월 주사의 성공을 확인을 수행 합니다. 설명 하는 방법을 따라 3.6.
    2. 소프트웨어에서 캘리퍼스 기능을 사용 하 여 b-스캔 전체 10 월 이미지에 걸친 수에서 분리 된 망막의 경계에서 굴절 지점을 식별. 메서드를 사용 하 여 열에 설명 된 캘리퍼스 4.1.4.
    3. 저 이미지 10 월 b-스캔 및 해당 위치 하는 저 이미지에 해당 캘리퍼스 위치 매핑된 위치를 기록 합니다.
    4. 합성 이미지, 캘리퍼스 위치를 포함 하 여 저 이미지 (예를 들어 그림 5A대표 결과 섹션에)에 사출 사이트의 정확한 지도에 결과에 모든 저 이미지를 컴파일하십시오.

5. 안 구내 주사

참고: RIS의 사용에 세부 사항 더 최근 연구23에 정교.

  1. 유리 주사 바늘 준비
    1. 오토 클레이 브는 모 세관 튜브 건조 사이클을 사용 하 여 작은 배치에서 필 라 멘 트와 함께 합니다.
    2. 사용 하 여 피 펫 끌어당기는 사람 및 설정 프로그램을 날카로운 각도와 2-5 µ m의 범위에서 직경 유리 팁을 생산할 예정 이다.
      참고: 우리의 피 펫 끌어당기는 사람에 효과적인 바늘 제작 샘플 5 단계 프로그램은 표 1에 표시 됩니다.
    3. 실 온에서 피 펫 멸 균 바늘 항아리에서 가져온된 유리 바늘을 저장 합니다.
  2. 주입 바늘 주입에 대 한 원하는 솔루션 작성
    1. 바늘 홀더, 떠나 약 5/8"튀어나온 소유자의 끝에 바늘을 탑재 합니다.
      참고: A 거리 5/8"만들 것입니다 그것은 어려운 도달 하는 것 보다는 바늘을 채우기 위해 주입 솔루션 바늘 홀더 0.2 mL 튜브의 오프닝으로 쉽게 적합 하지 않습니다 때문에. 또한, 5/8"상당히 큰 발진 또는 선행 팁, 실시간 이미징 어려운 이후 만들기 팁 찔린 눈을 동안 초점 비행기 또는 시야 (FOV), 잎의 결과 보다 더 내 다 니 데.
    2. 살 균 0.2 mL 튜브에 주입 솔루션을 준비 합니다. 추가 1시 10분 희석 fluorescein 1 mg/mL에서의 최종 농도를 주입 솔루션에 살 균 fluorescein 황산 (1 x PBS에 10 mg/mL)의.
      참고: 정확한 염료 사용 사용자에만 적용 되 고 비 독성 및 RPE의 subretinal 공간 수준에서 바늘 팁의 정확한 배치를 용이 하 게 도와 흰 빛 조명 아래 육안으로 표시 하는 것을 수 있습니다.
    3. 스테레오 현미경을 통해 바늘을 작성 하는 데 사용할 주입 솔루션을 포함 하는 관의 센터에 부합 되도록 바늘을 위치를 3 축 micromanipulator의 컨트롤 노브를 사용 하는 동안 바늘을 시각화.
    4. 바늘의 팁은 액체에 빠져들 때까지 조심 스럽게 0.2 mL 튜브에 바늘 팁 드라이브. 필요한 단일 주사 바늘으로 주입 액체 (예: 1 µ L)의 원하는 볼륨을 그립니다. 얼음에 튜브에서 나머지 솔루션을 유지 관리 합니다.
  3. 동물 주사에 대 한 준비
    참고:     RIS 현미경, 깨끗 하 게 유지 되 고 비 접촉 시스템. 바늘은 이전에 끌려가고 압력가 및 난방 접시 깨끗 한 adsorbent 패드로 덮여 있다. 후 그들은 자체 살 균가 열된 금속 스트립에 의해, 그들은 닫힌된 멸 균된 챔버 가져온된 유리 바늘을 개최 하도록 설계 되었습니다에 보관 됩니다. 바늘만 gloved 손을 사용 하 여 처리 그리고 배려 보유자에 장착 하는 동안 바늘의 팁을 감동 방지 하기 위해 사용 됩니다. 주입된 솔루션 무 균 기술을 사용 하 여 준비 하 고 파운드 한 천 배지 위에 바이러스 준비의 샘플을 줄이 고 37 ˚C에서 밤에 그들을 배양 하 여 오염에 대 한 테스트.
    1. 무게 (g) 동물 마 취 진통의 적절 한 복용량을 결정.
    2. 복 마 취 (버퍼 2,2,2-tribromoethyl 알콜 (Avertin)의 2.5% 솔루션)을 통해 주입 (IP)를 관리 합니다.
    3. 즉시 두 눈은 눈동자를 팽창을 anticholinergic 약물 (예: cyclopentylate) 적용 됩니다.
    4. 동물의 수염을 정돈 하 고 동물 귀 펀치 또는 다른 메서드를 사용 하 여 번호.
    5. 씻고 눈과 희석된 betadine와 주변 지역.
      참고: 하지 마십시오 어떤 솔루션, 코 주위를 지 고이 실수로 익사에서 발생할 수 있습니다.
    6. 에 바늘으로 주입을 눈으로 미리 성형된 모델러 클레이 마우스 홀더 39 ˚C 유지 열 패드에 마우스를 놓습니다.
    7. 마우스 뒷 다리의 핀치 테스트를 사용 하 여 응답 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
  4. Subretinal 주입 수행
    1. 살 균 무딘 아이리스 집게의 쌍을 사용 하 여 부드럽게 동시에 오픈 하 고 하향 7와 10 시 위치를 밀어 눈 뚜껑에 집게의 끝을 배치 하 여 세계의 proptosis 유도.
    2. 집게를 사용 하 여 소켓 주입 과정에서 그것을 지키려고 눈 세계 아래 눈 꺼 풀을 동축 케이블.
      참고: 동물 10 ~ 14 일 자주 개최 한다 눈 소켓에서 오래 된 동물 보다는 더 쉽게.
    3. 각 막 limbus 가장자리 아래 약 1-1.5 m m 바늘의 팁을 직접 하 고 신중 하 게 바늘 sclera, 조직으로 침투 하 고 눈의 조작 수 scleral 우울증 생성 될 때까지 결 막 통한 눈으로 드라이브.
    4. RIS 스테레오 현미경으로 넓혀 진된 눈동자를 통해 scleral 우울증을 시각화 micromanipulator 아래쪽으로 눈을 돌립니다.
    5. 메 마른 눈 젤 또는 PBS 솔루션 및 살 균 coverslip 커버 x 1의 방울을 적용 합니다.
    6. 바늘 주사 사이트에서 망막 형태의 날카로운 피크까지 앞으로 바늘 (2-5 µ m)과 드라이브의 끝에 의해 만들어진 scleral 우울증에 초점.
    7. 팁은 sclera 통해 한 거죠 고 바늘에 fluorescein RPE 세포 단층의 바로 근처에서 망막 아래 표시 될 때까지 소유자를 사용 하 여 바늘을 회전 합니다.
    8. 그래서 그것은 세계에 접선 바늘의 끝을 드라이브 하 고 발 페달 스위치와 함께 주입 펌프를 활성화.
    9. 원하는 볼륨을 전달한 후 (0.5-1 µ L) subretinal 공간 바늘을 철회 하 고는 bleb 안정적 이며 성공적인 주입의 첫 번째 기준은 사출 사이트에서 그 유체 누설 하지 않는 경우를 확인 하십시오.
      참고: 적절 한 팁 직경을 유지 (2-5 µ m 직경)이 주사 사이트에서 누설을 피하기 위해 중요 합니다.
    10. 10 월 악기의 이미징 플랫폼에 동물을 놓습니다. HR-SD 10 월 직사각형 볼륨 이미지를 기록 하기 위해 이미징에 대 한 지침을 따릅니다.
    11. bleb의 범위를 결정 하기 위한 이미지 저장 subretinal 공간에 주입 된 액체 위치 되는지 확인 합니다.
    12. 소유자에서 동물을 제거 하 고 항생제 연 고의 충분 한 양이 주입된 눈에 적용.
    13. 그것은 완전히 복구 하 고, 그 어디에서 온 원래 케이지에 다시 배치 될 때까지 난방 패드에 동물을 놓습니다.
      참고: 우리의 동물 이유 전에 일반적으로 주사 된다, 따라서 동물 필요 어머니와 감 금 소에 반환.
  5. 정도 subretinal bleb 10 월 악기 소프트웨어 도구를 사용 하 여 매핑.
    1. bleb의 앞에서 설명한 방법을 사용 하 여 사각형 볼륨 10 월 이미지를 인식할 수 있는 랜드마크는 ONH 같은 눈 내를 포함 하도록 위치.
      참고: 90 b-스캔 녹음 작품은 bleb을 매핑하기 위한 잘 하지만 원하는 해상도에 따라 사용할 수 있습니다.
    2. 단일 캘리퍼스는 그림을 추가 하 고 망막 RPE 및 맥락 막에서 분리 하는 굴절 지점에 놓습니다.
      참고: 소프트웨어 해당 포인트를 캘리퍼스 및 평가 되 고 b-스캔을 나타내는 저 이미지에 라인에 자동으로 매핑합니다.
    3. 캘리퍼스의 배치에 따라 화면 캡처하고 이미지 정확 하 게 주사 부 지도 저 이미지에 주입 bleb의 테두리를 효과적으로 지도를 컴파일하십시오. 컴파일된 이미지 후속 영상 중 관심 영역을 찾기에 대 한 참조를 저장 합니다.
      참고: 또한, 캘리퍼스 데이터 저장 될 수 있다, 준수, 및 ONL 두께의 3 차원 그리기 데이터 집합에 대 한 비슷한 메서드를 사용 하 여 플롯.
  6. Intravitreal 주입
    1. 제외 하 고는 바늘 동위 플 막 limbus 뒤에 및 유리 체에 약 0.25 m m에서 완전히 sclera를 통해 구동 됩니다 비슷한 수술 접근법을 사용 하 여 하위 망막 주입으로 바늘의 끝을 놓습니다.
    2. 바늘 배치에 따라 분사 펄스 발 페달으로 적용 됩니다.
      참고: 형광으로 넓혀 진된 눈동자 조리개를 채워는 아이피의 유리 체에 걸쳐 fluorescein 염료의 급속 한 확산은 관찰 된다.

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결과

존재, 속도 모델 외부 망막 변성의 균일성 평가
측정은 ONL의 느릅나무, ONL 악기 소프트웨어에서 제공 하는 캘리퍼스 도구를 사용 하 여의 한계를 정의 하는 OPL에서 기록 되었다. 목표는 부분적으로 인간 답게 adRP 마우스 모델에서 외부 망막 변성의 진행을 지도 했다. 제어 C57BL/6(J) 마우스를 hC1/hC1 / / mWT 비교 이미지/mWT 마우스 모델, 돌연변이 인간 막대 opsin (로P347S) 유전자의 두 복사본을 표현 제어 망막 연구 결과 그의 심각한 전시를 표시 했다 고 급속 하 게 진보적인 망막 퇴행 성 조건입니다. 3 주 된 adRP (BL/6(J)) 동물, 돌연변이 인간 로P347S 유전자의 단일 복사본만 있고 마우스 WT로 유전자의 두 복사본 x hC1 정상적인 ONL 두께 근처 했다. 그러나, 후속 인사-SD-O...

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토론

10 월 인사-SD 잠재적인 치료제 테스트에서 그들의 유용성을 결정 하는 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성에 대 한 간단한 방법을 제공 한다. 신속 하 고 안정적으로 인간 질병의 잠재적인 동물 모델의 특성 수는 (예를 들어, 교체 유전자 치료, ribozyme 또는 shRNA 최저의 유전자 치료, 결합 된 유전자 치료) 치료 약물 발견의 과정에 중요 합니다. HR-SD-10 월 특성화 및 거의 모든 마우스 모델에서 망막 변성의 진행을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 망막 건강을 평가 하기 위한 간단한, 빠른, 및 비-침략 적 방법을 제공 한다. OCT 이미지 퇴보에 시간이 지남에 따라 외부 망막 (포토 리셉터) 변성의 상세한 평가 또는 치료 구조 시도의 영향을 제공할 수 있습니다. 망막의 다른 층의 일부 또는 전부의 측정을 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 범위 또는 운동 타임 라인입니다. 10 월 인사-SD 전달된 벡터 또는 재료의 독성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 포토 리셉터 망막 변성 연구 ...

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공개 사항

상업적인 관계: MCB: 없음; JMS: 없음. 이미징 시스템 (RIS)23 이 연구에 사용 된 망막은 쥐, 설치류, 또는 작은 동물에서 유전자 치료 배달 연구 하고자 하는 어떤 그룹에 실질적인 사용의 소설 장치. 저자가이 시간에이 장치에 관하여 선언 하 고 충돌이 동안, SUNY 버팔로-재향 군인의 관리에서 대학 지적 재산에 권한이 고이 악기를 미래에 상용화를 추구 수 있습니다.

감사의 글

이 자료는 학과의 재향 군인 담당 (버지니아), 재향 군인의 건강 관리, 사무실의 연구와 개발 (생물 의학 실험실 연구 및 개발)에 의해, 부분적으로, 지원 작업 기반 (VA 공로 그랜트 1I01BX000669). JMS는 고용, 부분적으로로 직원 의사-과학자, 안과, 버지니아 WNY; MCB VA WNY에 의해, 부분적으로, 채택 된다. 연구, 실시 하 고, 참전 용사 관리 서양 뉴욕 의료 시스템 (버팔로, 뉴욕)에 의해 부분적으로 지원 했다. 내용 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다. 도 지원, 주요 부분에서 네이 NIH R01 부여 함으로써 EY013433 (PI: JMS), NIH/네이 R24 부여 EY016662 (UB 비전 인프라 센터, 파이: M 학살, 감독-Biophotonics 모듈: JMS), 무제한 부여 하는 학과의 안과/대학에서 실명 방지 (뉴욕), 연구에서 버팔로 그리고 Oishei 재단 (버팔로, 뉴욕)에서 부여. 우리 인정 hC1 유전자 변형 로P347S 선 및 exon 1 마우스의 선물 (Tufts 뉴잉글랜드 의료 센터, 보스톤, MA), 박사 제 니스 렘에서 로 녹아웃 heterozygous 상태에 NHR E transgene 모델의 선물에는 마우스 exon 2로 녹아웃 배경 박사 G. 제인 파라와 피터 험프리 (삼위일체 대학, 더블린, 분노).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/A/A
Envisu R-2200 안구 일관성 토모촬영 기기 (OCT)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
망막 이미징 시스템 (RIS)내부N/A
Stemi 2000C 현미경Zeiss000000-1106-133
P-97 Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러Sutter Instrument Cop-97
MMN-33 마이크로 매니퓰레이터 Narishige USAMMN-33
PLI-100  마이크로 인젝터Harvard Apparatus64-1736
마이크로피펫 홀더 (회전)사내N/A
마이크로피펫 보관 용기World Precision Instruments Inc.E210
  보로실리케이트 유리 모세관 1.5-1.8 X 100mm, Harvard Apparatus30-0053
2,2,2-TribromoethanolSIGMA AldrichT48402-25G
Tert-amyl AlcoholSIGMA Aldrich240486-100ML
아트로핀 황산염 점안액, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
사이클로펜톨레이트 하이드로클로라이드 안과 용액, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
겐타마이신 설페이트 연고 USP, 0.1%페리고NDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
테트라카인 하이드로 클로바우쉬 및 롬NDC 24208-920-64
안과 용액, USP 0.5 %바우쉬 및 롬NDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
바이러스 제제ViGene / UNCN / A
골드 나노 막대NANOPARTzD12M-850-1.75
플루오레세인 설페이트 AK-FLUOR 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
커버슬립피셔 사이언티픽12-548-A
펜치밀턴18-825
바늘 30 게이지벡턴 디킨슨   W11604
주사기Beckton Dickenson   
Bioptigen 소프트웨어 패키지BioptigenN/A
프로파라카인 염산염 안과 솔루션, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
스케일Mettler
가위세계 정밀 기기
귀 펀치Nat' l 밴드
CL 100 광원Welch AllynCL100
질소 가스잭슨 용접 공급N/A
온수 수조NeslabRTE-140
가열판In HouseN/A
난방 매트Cincinnatti Sub Zero273
클레이 마우스 홀더Plast.i.clay 아메리칸 아트 클레이 (주)N/A
베타딘메드라인 NDC53329-938-06
코튼 팁 애플리케이터American Health ServiceCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
장갑 니트릴VWR89038-272
Diagnosys ERG 컬러 돔 기기Diagnosys Inc.D125
콘택트렌즈사내N/A
Diagnosys 소프트웨어Diagnosys Inc.N/A
오리진 6.1 소프트웨어OriginLab Corp.N/A
기준 전극OcuscienceF-Thread Electrode (DTL) 24"
N라이드 309659

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