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방법 논문

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

29.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55898

⸱

2017년 9월 7일

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

이 논문에서

요약

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

초록

인플루엔자 바이러스 500000 이상의 죽음 전세계1 원인과 관련 된 직접 의료 및 입원 비용 및 직장 결근2를 고려 하 고 혼자 미국에서 십억 12-14 달러의 연간 비용. 동물 모델은 바이러스 성 병 인, 호스트 병원 체 상호 작용, 면역 반응, 평가에 독감 바이러스 (IAV) 연구에 중요 한 그리고 현재 및 새로운 백신의 효능 antivirals 뿐만 아니라 접근. 마우스 유리 작은 동물 모델 때문에 그들의 면역 시스템은 진화론 인간에서 발견 비슷합니다, 그들은 유전으로 동일한 과목으로 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다, 그리고 평가에 악용 될 수 있는 여러 변종이 있다 감염, 유전으로 그리고 그들은 상대적으로 저렴 하 고 조작 하기 쉬운. 기도 통해 인간 IAV 감염 정리를 마우스는 먼저 적절 한 biosafety 제약 아래 감염 IAVs와 intranasal 접종 전에 마 취. 감염 후 IAVs의 병 인 (몸 무게 손실) 병 적 상태와 사망률 (생존) 매일 모니터링 하 여 결정 됩니다. 또한, 바이러스 성 병 인도 위 (비 강 점 막) 또는 감염 된 쥐의 낮은 (폐) 호흡기 바이러스 복제를 평가 하 여 평가할 수 있습니다. IAV 감염 시 체액 응답 비-침략 적 출혈 및 이차 항 체 검출에 의해 급속 하 게 평가 될 수 분석 실험 목적 총의 존재를 검출 하거나 항 체를 중화. 여기, 우리는 일반적인 방법을 설명 intranasally 생쥐를 감염 하는 데 사용 (도)와 IAV pathogenesis, 체액 성 면역 반응 및 보호 효능 평가.

서론

IAVs 엔벌로프된 바이러스 Orthomyxoviridae 가족3으로 분류 되는. 그들은 부정적인 극성3와 8 개의 단일 가닥 RNA 분자를 포함. 인간에서는, IAVs 소설은 바이러스가 인간의 인구4에 소개 될 때 계절 전염병과 중요 한 결과의 가끔 전염병 발생할. 또한, 계절 IAVs 매우 고 빠르게 전송 됩니다 모든 년2,5는 높은 경제 손실 전세계 생산 인간 사이. IAV 증상은 기침, 코 막힘, 발열, 불쾌, 두통, 거식 증과 근육 통, 하지만 바이러스 또한 immunocompromised 환자6에서 더 심각한 질병을 일으킬 수 있다. 사실, 세계 보건 기구 (WHO)는 계절 독감 바이러스 원인 300000-500, 000 명 전세계 모든 년1계산 합니다. 현재 인플루엔자 예방 및 인 간에 있는 치료에 대 한 식품의 약 청 (FDA)에 의해 승인 된 약물의 두 종류가 있다: 응집 (나) 저 해제 (예를 들어, oseltamivir) 및 차단제 (예, M2 이온 채널의 소나); 그러나, 약물 내성 바이러스 변종의 출현은 증가 한 관심사 이다. 예방 접종, 따라서 IAVs 감염 으로부터 인간을 보호 하기 위해 최상의 의료 옵션을 남아 있다. 날짜 하려면, 세 가지 유형의 독감 백신 인간의 사용을 위한 FDA에 의해 허가 사용할 수 있습니다: 재조합 형 바이러스 성 조류 (HA) 단백질 백신을 inactivated 인플루엔자 백신 (IIV), 그리고 라이브-감쇠 인플루엔자 백신 (LAIV)5, 7. 3 백신 바이러스 HA 단백질, IAVs에 대하여 항 체를 중화의 주요 대상에 대 한 적합 한 면역 반응을 유도 하도록 설계 되었습니다.

IAV 감염에서 vivo에서 공부 하는 검증 된 마우스 모델

동물 모델 공부 하 고, 다른 사람, 사이 IAV pathogenesis8,,910,11, 바이러스 성 요인 질병12 또는 바이러스 성 전송13에 기여 하는 데 사용 되었습니다. ,14,9,,1015마약 새로운 백신 또는 항 바이러스 효능을 테스트 하 고. 마우스 (생쥐)는 여러 가지 이유로 IAV 연구를 위한 가장 광범위 하 게 사용 된 동물 모델: 1) 면역 체계가 비슷합니다 진화론 인간;에 존재 하는 2) 저렴 한 비용, 등 동물 구입, 주택 및 재생산; 쉽게 조작 하 고 저장; 3) 작은 크기 균질 응답 및 결과; 4) 최소한의 호스트 가변성 5) 마우스 생물학, 게놈 시퀀스;를 포함 하 여 큰 지식 6) 많은 사용 가능한 분자 생물학 및 면역학 시 약; 7) 사용할 수 노크 바이러스 성 감염;에 주어진된 호스트 단백질의 기여 공부 하 (KO) 마우스 그리고, 8) 감염의 유전 기초를 평가 하기 위해 악용 될 수 있는 여러 마우스 긴장.

여러 마우스 긴장 IAV에서 vivo에서현재 사용할 수 있습니다. 나이, 면역 상태, 섹스, 유전 배경 및 마우스 긴장으로 감염, 복용량 및 바이러스 성 긴장의 쥐에서 IAV 감염의 결과 영향. IAV 연구에 사용 되는 가장 일반적인 마우스 긴장은 BALB/C 그리고, 최근에, DBA.2 마우스 C57BL/6, 그들은 두 전 긴장16,,1718, 보다 IAV 질병에 더 취약 19 , 20. 중요 한 것은, 면역 반응 또한 다를 수 있습니다 마우스 스트레인18,,1920에 따라. 따라서, 매우 IAV 스트레인 실시 하는 실험에 대 한 최상의 옵션을 선택 하 고 마우스에 대 한 사용 가능한 모든 정보를 복구 하는 것이 중요 하다.

마우스 IAV vivo에서 공부에 대 한 감염의 좋은 동물 모델 이지만, 그들은 실험적인 디자인에서 고려해 야 할 몇 가지 제한이 있다. 예를 들어, vivo에서 학문에 대 한 마우스를 사용 하 여의 주요 한계는 IAVs 쥐 중 전송 하지 않습니다. 따라서, 전송에 대 한 연구, 더 허용 동물 모델 (예를 들면, 흰 족제비 또는 기니 피그)는 사용된16,,1721. 또한, 쥐에서 IAV의 발현과 인간 간의 몇 가지 차이점이 있다. 인간과 달리 쥐 IAV 감염; 시 발열 개발 하지 않습니다. 반대로 그들은 저체온증16,17제시. 쥐, IAV 복제 위 항공 보다 더 낮은 호흡 기관 (폐)에 집중. 따라서, 생쥐에서 IAV의 독성은 인간에서 본을 항상 상관 하지. 전부, 장점 보다는 제한 된 단점 큽니다, 때문에 마우스 인플루엔자 바이러스 성 병 인, immunogenicity 백신과 항 바이러스 연구에 보호 효능을 평가 하는 데 사용 하는 첫 번째 동물 모델을 나타냅니다. 또한, 그것은 윤리적으로 IAV IAV 감염의 작은 동물 모델에서 이전 증거 없이 큰 동물 모델을 사용 하 여 함께 연구를 수행 허용 되지 않을 것 이다. 이 원고에서 intranasally 생쥐를 감염 하는 방법 설명 (i.n.) IAV, 심각도 및 바이러스 성 감염의 진행 상황을 모니터링 하는 방법 및 체액 성 면역 반응 및 보호 효능을 평가 하는 데 필요한 실험을 수행 하는 방법.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)와 로체스터의과 및 치과 대학에서 기관 Biosafety 위원회 (IBC)에 의해 승인 및 준수 와 관리 및 국가 연구 위원회 22의 실험실 동물의 사용을 위해 가이드에 있는 권장 사항. 시설 및 물고기 및 사단의 실험실 동물 약의의 대학 및 치과의 프로그램 AAALAC 국제 공인 하 고 주법, 연방 법령 및 국립 보건원 (NIH) 정책을 준수 합니다. 비슷한 요구 사항이이 원고에 설명 된 동물 프로토콜을 준수 하는 각 기관에 적용 한다.

1. 작은 척 추가 있는 동물 사용의

참고: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)는 마우스 작업에 필요한. 최소 요구 사항을 포함 머리 모자, 마스크와 장갑, 신발 커버, 일회용 작업복.

  1. IACUC 프로토콜에 따라 케이지 당 5 마우스의 최대 배치. 죽은 동물을 안락사 (두 번째는 물리적 방법 이어야 함)의 두 가지 방법으로 마우스를 안락사 IACUC 프로토콜 다음.
    참고: IAV는 병 적 상태와 사망률 평가 실험에서 초기 체중의 20%를 잃은 마우스 실험 끝점에 도달 했습니다 간주 됐다 그리고 CO 2, 그리고 자 궁 경부 전위로 안락사 했다는 실제 보조 방법입니다. 몸 무게의이 비율은 다른 기관에서 달라질 수 있습니다. 쥐 폐와 비 강 점 막 IAV 감염 후 수집 됩니다 절차에서 마우스 2,2,2-tribromoethanol (TBE)의 치명적인 복용량으로 안락사 그리고 물리적 보조 방법으로 정 맥은 키 모 잘라서. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스 구입 하 고 특정 병원 체 자유로운 조건에서 로체스터의과 및 치과 대학에서 동물 보호 시설에서 유지 했다.

2. Biosafety

참고:이 보고서에서 IAVs 생쥐를 감염 하는 데 사용 되는 A/Puerto 토 리코/8/34 H1N1 인플루엔자 (PR8 WT) 22 , 23의 일반적인 마우스 적응 실험실 긴장 고 온도 민감한 LAIV 변형, PR8 LAIV 8. IAV 감염 (생체 외에서 또는 vivo에서), 세포 배양 및 생물 안전 캐비닛 biosafety 수준 (BSL)-2 아래에서 생물 학적 샘플을 포함 하는 모든 절차를 수행 조건. 높은 악성 IAV 긴장 사용 하는 경우 다른 BSL 정장 또는 제약 조건 활용.

  • 클린 biosafety 염소 이산화 살 균 제 전과이 원고에 설명 된 모든 실험 절차를 수행한 후 캐비닛
      . 적절 한 IBC 권장 사용 전후 모든 해 부 자료 (가 위, 메스 및 해 부 겸)과 Dounce 균질 화기를 소독. 적절 한 IBC와 IACUC 지침에 따라 절차 동안 생산 하는 모든 자료 삭제.

    3. Intranasal 감염

    특정 병원 체 자유로운 조건에서
    1. 장소 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 쥐. 구성 하 고 레이블을 마우스 바이러스와 복용량 사용 감 금 소. 쥐 귀 펀치 코드를 사용 하 여 각 장에 또는 꼬리의 그림 같은 다른 승인 된 방법으로 식별 합니다. 케이지 당 최대 5 마우스를 놓습니다.
    2. 준비 IAV의 희석 (형광 형성 단위 (: FFU) / 마우스) 30 µ L/살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x에서 마우스의 전체 볼륨에 무 균 조건 하에서. 얼음에 바이러스 inoculum을 유지 합니다. 수식으로 바이러스 성 희석에서 추가할 IAV의 양을 계산: ((X: FFU 마우스 당/30 µ L) 마지막 볼륨 x) / 주가 바이러스 titer.
    3. 규모와 마우스 무게 고 각 마우스 (0 일)의 무게를 기록 합니다. 검지 손가락과 엄지손가락 사이의 목의 아저씨에 의해 그것을 선택 하 여 등 쪽 위치에 마우스를 잡아. 핑 키 손가락으로 손을 대 한 꼬리를 잡고.
    4. Anesthetize 마우스 intraperitoneally (i.p.) 240-250 mg/kg의 복 부의 오른쪽 꼬리 2/3에 바늘을 삽입 하 여 TBE와. 바늘을 철수 하기 전에 잠시 일시 중지 합니다. 마우스 케이지를 반환 하 고 5 분을 기다려
    5. 는 마우스 마 취 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 불 임 안과 연 고를 적용 합니다. 마우스 (즉, 발가락 핀치) 페달 철수 반사의 부족에 의해 anesthetized 경우 확인 하십시오. 마우스는 완전히 취 하지 하는 경우에, 그들은 바이러스 기침 것.
    6. 마우스 완전히 마 취 때 등 recumbency에 마우스를 놓습니다. 피펫으로 팁 바이러스 inoculum는 콧구멍에 천천히의 30 µ L를 포함 하지만 지속적으로 솔루션을 추출. 마우스는 사라지고 드롭 inoculum을 관찰 하 여 준비를 흡입는 다는 것을 반드시.
    7. 는 TBE 온도 호흡 속도 눌러 수 마우스는 호흡을 확인 합니다. 케이지 등 recumbency에 배치 하는 동물을 반환 합니다. 호흡 곤란의 어떤 표시 든 지에 대 한 마우스를 모니터 하 고, 관찰 하는 경우 도움이 마우스를 수직으로 들고 동물에 의해 호흡 및 호흡 24 구동 영향을 유발. 그것은 의식 (30-45 분 그것은 마 취 후)을 차릴 때까지 마우스를 모니터.

    4. 바이러스 성 병 인 ( 그림 1)의 특성화

    1. 병 적 상태와 사망률 ( 그림 1 및 그림 2)의 평가
      1. 감염 i.n. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 3-4 그룹 (그룹, n 당 적어도 5 쥐 = 5) 사진 복용과 함께 (10, 10 2, 10 3, 10 4: FFU/마우스) PR8 WT 섹션 3에에서 설명 된 대로의.
      2. 모니터 약 음식 섭취에 따른 체중 변화를 최소화 하기 위해 동시에 앞으로 14 일 동안 규모와 마우스의 무게. 섹션 1에에서 설명 된 대로 그들의 초기 체중의 20%를 잃고 쥐를 안락사.
      3. 14 일 후 제 1에에서 설명 된 대로 바이러스 성 감염을 살아 나는 마우스를 안락사.
      4. 바이러스 50% 마우스 치 사 량 (MLD 50) 리드와 Muench 25의 메서드를 사용 하 여 얻은 생존 데이터에 따라 계산 합니다. 첫째, 계산 비율 거리 (PD):
        figure-protocol-1
        1. 다음, 다음 수식을 MLD 50 계산:
          figure-protocol-2
    2. 폐와 비 강 점 막 바이러스 titers의 평가 ( 그림 1 및 그림 2. )
      1. 폐와 비 강 점 막
          복구
        1. i.n. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 쥐 감염 (n = 6) 10-10 4: FFU PR8 WT 섹션 3에에서 설명 된 대로 테스트 바이러스 성 복용량.
        2. 수집 마우스 폐와 비 강 점 막 일 2 (n = 3) 4 (n = 3).
          1. TBE (500mg/kg)의 치명적인 복용량 (i.p.) 마우스를 안락사. 등 쪽 recumbency에서 동물을 놓고 70% 에탄올과 흉부를 통해 모피를 소독 합니다. 복 부의 기지에 흉 골에서 메스와 함께 피부를 잘라. 가 위 쥐의 측면 부분에 절 개의 기지에서 1 cm 삭감 만들기.
          2. 보조 안락사 방법으로 마우스 피가 위로 간 정 맥을 잘라. 복 부 위치에 동물을 배치 하 고 밖으로 배출 하는 혈액을 있도록 2 분 기다립니다. 이 단계는 폐에 혈액을 줄이기 위해 중요 하다.
          3. 는 마우스 등 머리의 전체 상단 부분에서 첫 번째 절 개 집게와가 위를 해 부의 도움으로 만든 되었다 복 부의 피부를 제거 합니다. 머리는가 위로 잘라내어 건조 멸 균 페 트리 접시에.
          4. 는 maxilla는 mandible 사이 접합은가 위로 잘라 고는 mandible 삭제. 가 위, zygomatic 호 끝에 두 컷 확인 하 고 그들을 제거 합니다. 해 겸의 도움으로 눈 제거.
          5. 해 집게와는 두개골을 보유 하 고 메스와 화살 봉합을 따라 두개골을 잘라. 비 강 점 막 보고 뇌와 두개골의 두 반쪽을 들어올립니다. 비 강 mucosas 코, maxilla, 팔 라틴, zygomatic, 두개골의 앞쪽 뼈와 사 골 뼈에 의해 포위 된다.
          6. 메스를 사용 하 여 뇌와 두개골의 부분 잘라내어 버리고. 장소는 무 균 튜브에 비 강 점 막과 두개골의 다른 부분. 샘플 처리 같은 날, 또는 경우 그들을 신속 하 게 동결 드라이 아이스에는 샘플 것입니다 나중에 처리할 경우 얼음 (4 ° C)에 튜브를 저장.
          7. 샘플의 오염을 피하기 위해, 청소 하 고 소독 해 도구 각 조직 복구, 염소 이산화 살 균 제와 함께 각 동물 해 부.
          8. 폐 수집 등 recumbency에서 동물 놓고 늑은가 위로 잘라. 흉 골의 양쪽에서 1 cm에서 갈비뼈를 절단 하 여 흉 곽을 엽니다. 할 우수한 부분에 흉 곽의 기지에서 상처는가 위.
          9. 흉 곽의 우수한 부분에 두 개의 절 사이 위 크로스 섹션을 만들고 가슴 판 제거. 폐는 집게와 함께, (바로 전에 폐) 기관지의 끝에는 위로 잘라 누른 폐 무 균 튜브에 넣어. 샘플 처리 같은 날, 또는 경우 그들을 신속 하 게 동결 드라이 아이스에는 샘플 것입니다 나중에 처리할 경우 얼음 (4 ° C)에 튜브를 저장.
            참고: 그들은 수집 하 고, 같은 날에 조직 샘플을 균질 하 고 바이러스 titers을 나중에 분석 하기-80 ° C에 저장 합니다. 그 샘플 안 받아야 반복된 동결-해 동 주기 전에 바이러스 titers 결정이 중요 하다. 그들은 처리 될 때까지 또는-80 ° C에서 조직 샘플을 저장.
      2. 폐와 비 강 점 막의 균질
        1. 폐 또는 비 강 점 막 살 균 Dounce 균질 화기에 놓고 감기 감염 미디어의 1 mL을 추가. 폐는 완전히 중단 될 때까지 실 온 (RT)에서 약 1 분 동안은 유 봉을 아래로 이동 하 여 샘플을 균질. 4 무 균 튜브에 게 무 균된 샘플을 넣어 ° C. 사용 각 샘플에 대 한 새로운 Dounce 균질 화기.
        2. 원심 실시간 수집 새로운 무 균 튜브에 상쾌한에 5-10 분에 대 한 300 x g에서 샘플. 바이러스 성 적정 같은 날에 수행 되는 경우 4 ° C에서 상쾌한을 저장 하 고 삭제는 펠 릿. 또는, 바이러스 titers을 나중에 평가를 (-80 ° C)는 무 균의 상쾌한 샘플을 동결.
      3. 간접 면역 형광 검사 하 여 바이러스 적정
        1. 적정, 전날 씨앗 96 잘 접시 Madin-다 비 개 신장 (MDCK) 상피 세포 (4 x 10 4 셀/잘) 조직 문화 미디어 합류 점 ~ 80-90%에 도달. 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 세포를 놓습니다. 바이러스 성 적정 하루 확인 바이러스 성 감염을 시작 하기 전에 단층을 확인 하려면 현미경 셀.
        2. 준비 1시 10분 희석 96 잘 접시에 감염 미디어에서 무 균된 샘플 (폐 또는 비 강 점 막)의 상쾌한의. Triplicates 바이러스 titers을 정확 하 게 확인 하 여 바이러스 성 적정을 수행 합니다.
        3. 96 잘 접시에 우물의 각 감염 미디어의 추가 90 µ L
            . 웰 스 3 중에 각 샘플의 바이러스 titer를 평가 하는 A1, A2, a 3에 무 균된 샘플의 상쾌한 중의 10 µ L를 추가 합니다. A4, A5 및 A6 웰 스에 무 균된 샘플의 또 다른 상쾌한의 10 µ L를 추가 합니다. 샘플의 나머지 부분으로 연속적으로 동일한 희석 수행.
          1. 추가한 후에 표면에 뜨는 샘플 행 A,를 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 10 µ L에서에서 전송 행 A 행 B. 변경 팁 희석 사이 섞어 잘. 마지막 행 (H)를 도달할 때까지이 반복 합니다.
        4. 조직 문화 매체 (단계 4.2.3.1) 제거 96 잘 접시와 100 µ L/1 x PBS의 우물으로 두 번 세척에서 MDCK 셀에서 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여.
        5. 전송 50 µ L/잘 MDCK와 96 잘 접시에 무 균된 샘플의 순차적으로 희석된 상쾌한의 셀. 더 높은 희석 (행 H) 낮은 희석 (A 행) 전송 시작. 이 경우에, 그것은 다른 행 사이의 팁을 변경 필요가 없습니다.
        6. 바이러스 흡착 수 있도록 RT에 1 시간을 위한 락 플랫폼에 96 잘 접시를 넣어. 바이러스 흡착 후 inoculum 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 제거 하 고 감염 된 후 미디어의 100 µ L/잘 추가 합니다. 8 h 5% CO 2와 33 ° C 또는 37 ° C 배양 기에 감염 된 세포를 품 어. 4.2.3.6 단계에서 설명한 대로 수정, 얼룩, 이미징, 및 바이러스 titer 계산 진행 – 4.2.3.12.
        7. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 96 잘 접시에서 조직 문화 매체를 제거 합니다. 수정 하 고 실시간에 20 분에 대 한 고정/permeabilization 솔루션의 100 µ L/잘 세포를 permeabilize
          주의:를 사용 하 여 고정/permeabilization 솔루션 증기 두건에서 포름알데히드 노출 방지.
        8. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 고정/permeabilization 솔루션을 제거, 1 x PBS로 세척 및 차단 솔루션 실시간 점에서 1 시간에 대 한 차단 솔루션 4 ° C에서에 셀 고정된 셀을 품 어 또는 다음 단계를 수행 하십시오.
        9. 차단 솔루션을 제거합니다. 추가 1 µ g/mL 단일 클론 항 체 (mAb) 안티-NP HB의 50 µ L/잘-65 항 체 희석 용액에 희석. 1 h 37 ° C. 다른 mAb 또는 polyclon에서 품 어알 항 체 (pAb) 안티-p r 8을 사용할 수 있습니다.
        10. 한편, 희석 1: 200 fluorescein isothiocyanate (FITC)-항 체 희석 솔루션에서 활용된 보조 반대로 마우스 항 체. 실시간에서 5-10 분 동안 1700 x g에서 솔루션을 원심 다른 fluorophores 함께 활용 된 다른 이차 항 체 사용 될 수 있다.
        11. 1 차적인 항 체를 제거 하 고 3 번 1 x PBS의 100 µ L/잘 씻어. 이차 항 체 희석의 50 µ L/잘 추가 하 고 37 ° C. 제거 이차 항 체 및 세척 3 번 100 µ L/1 x PBS의 우물에서 30-45 분 동안 품 어. 마지막 세척 접시에 두고.
        12. 긍정적인 스테인드 (녹색) 셀의 수를 결정 하기 위해 형광 현미경으로 세포를 관찰 합니다. 바이러스 titer: FFU/mL를 계산 하 여 계산 합니다. 표현: FFU/mL 희석에서 30-50 긍정적인 스테인드 셀 수식을 사용 하 여 바이러스 titer 계산: ((n1 + n2 + n3) / 3) x 20 x 1/희석.

    5. 체액 성 면역 반응 ( 그림 3)의 평가

    1. 감염 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 i.n. 3 그룹 (n = 5) 다른 복용량과 (10 2, 10 3, 그리고 10 4: FFU / 마우스) PR8 LAIV의 모의 감염 한 그룹 (n = 5) 부정적인 제어로 살 균 PBS x 1. 도 마우스 감염 섹션 3에에서 설명 된 대로 수행.
      1. 마우스 submandibular 펑크
        1. 14 일에 의해 예방 접종, 후 출혈 쥐 혈액 submandibular 출혈 사용 하 여 수집을 4mm 랜 싯 26 또는 다른 IACUC를 사용 하 여 승인 방법.
        2. 잡고 검지와 엄지 사이 목의 아저씨에 의해 그것을 선택 하 여 마우스
            . 핑 키 손가락 마우스 무력화와 손을 대 한 꼬리를 잡고.
          1. 뺨을 볼 수 있는 측면 위치에 마우스를 넣어. 경 정 맥으로 복고풍 궤도 submandibular 혈관의 시점에는 펑크를 확인 합니다. 바소 (4 m m)를 침 몰 하 고 무 균 튜브에 혈액을 복구 (약 0.2-0.4 mL/마우스 복구). 몇 초 동안 메 마른 냅킨으로 빵 꾸에 압력을 적용 합니다. 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.
        3. 37 ° C에서 1-2 h에 대 한 튜브를 넣은 다음 혈액에서 혈 청을 분리 하는 RT에 30 분 동안 700 x g에서 원심. 새로운 무 균 튜브에 피펫으로와 혈 청의 구성 된 상위 계층을 전송 합니다. 적혈구 (Rbc)의 펠 릿을 삭제 합니다. -20에서 혈 청을 저장 ° c.
    2. 바이러스 성 단백질에 대 한 총 항 체의 분석
      1. 감염 MDCK 셀 추출 물 준비
        1. 감염, 전날 씨앗 10 6 MDCK 셀 (~ 80-90에 도달 x 4-5와 함께 한 100 mm 접시 % 합류 다음날) 조직 문화 매체에서. 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 세포를 놓습니다. 바이러스 성 감염의 바이러스 성 감염을 시작 하기 전에 단층을 확인 하려면 현미경 세포 확인.
        2. 4 mL 총 최종 볼륨에서 감염 미디어에서 PR8 WT의 감염 (MOI)의 낮은 (0.001) 다양성을 가진 바이러스 성 희석을 준비합니다. 수식으로 PR8 WT의 양을 계산 ((n ° 셀 x 나 X) 최종 볼륨 x) / 주가 바이러스 titer.
        3. 는 MDCK 셀 접시에서 조직 문화 매체를 발음 하 고 1x PBS의 4 mL로 두 번 씻어. 바이러스 성 inoculum (4 mL)을 추가 하 고 바이러스 흡착 수 있도록 RT에 1 시간을 위한 락 플랫폼에 접시를 넣어. 진공 바이러스 inoculum을 제거 하 고 TPCK 취급 trypsin의 1 µ g/mL를 포함 하는 감염 된 후 미디어의 8-10 mL을 추가. 5% CO 2와 33 ° C 또는 37 ° C 배양 기에서 48-72 h에 대 한 감염 된 세포를 품 어.
        4. 셀 스 크레이 퍼의 도움으로 세포를 분리 하 고 세포와 조직 문화 매체와 15 mL 튜브에 피펫으로 수집. 실시간 Aspirate는 상쾌한에 5-10 분에 대 한 400 x g에서 튜브 원심 RIPA 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 믹스 1.5 mL 무 균 튜브에 넣어. 20-30 분에 대 한 얼음에 품 어
        5. 원심 분리기 1300 x g에서 튜브 4에서 20-30 분에 대 한 ° C. 신중 하 게, 복구는 상쾌한. 게 셀-20에서 100 µ L aliquots에서 추출 ° c.
        6. 적정 셀 추출 물 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 항 체 9 , , 10 11의 존재에 대 한 그들을 평가 하기 전에 설명 된 대로 , 27. 포함 셀 부정적인 제어로 모의 감염 MDCK 셀 (위에 표시 된 대로 준비)에서 추출.
      2. ELISA ( 그림 4)
        1. 96 잘 접시 감염 MDCK 세포의 적절 한 희석 (1: 200-1:1, 000) 사이 보통 1 x PBS에서 추출 하는 폴리스 티 렌 코트. 부정적인 통제로 모의 감염 MDCK 셀 추출의 동일한 희석와 또 다른 접시를 코트. 품 어 오버 나이트 (O/N) 4 ° c.
        2. 는 상쾌한 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 제거 하 고 멀티 채널 피펫으로와 1 x PBS의 100 µ L/잘 한 번 세척. 비 특정 바인딩 추가 100 µ L/잘 실시간에서 1 시간에 대 한 솔루션을 차단 하 여 차단
        3. 한편, 96 잘 접시에 항 체 희석 솔루션에서 단계 5.1에서에서 감염 각 마우스에서는 세라의 2-fold 직렬 희석 (희석 1시 50분 시작)을 확인.
        4. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 폴리스 티 렌 96 잘 접시에서 차단 솔루션을 제거 합니다. 적절 한 잘 각 마우스 혈 청 희석의 50 µ L을 추가 하 고 37에서 1 시간을 품 어 ° c.
        5. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터와 마우스 세라를 제거합니다. 증류수 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 우물 3 번 씻어. 반대로 마우스 2 차 항 체 항 체 희석 솔루션에 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 희석 1:2,000와 활용의 50 µ L/잘 추가 합니다. 37 ° c.에 1 시간을 품 어
        6. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터와 이차 항 체를 제거합니다. 증류수 사용 하 여 멀티 채널 피펫으로 우물 3 번 씻어. 1:1 솔루션 A와 B. 추가 100 µ L/기판의 잘 혼합 하 여 tetramethylbenzidine (TMB) 기판 솔루션을 준비 하 고 어둠 속에서 RT에서 5-10 분 동안 품 어.
        7. 그래서 100 µ L/잘 0.2 N H 2를 추가 하 여 반응을 중지 4. 450에 번호판을 읽기는 ELISA 플레이트 리더에 nm.
        8. 각 희석 MDCK 모의 감염 96 잘 접시의 MDCK 감염 96 잘 접시에서 얻은 값에서에서 얻은 값을 뺍니다. 다른 세라와 각 희석에 대 한 평균 값을 계산 하 고 표준 편차 (SD)를 보여주는 그래프에서 그들을 대표.
    3. 중화 항 체의 분석
      1. Hemagglutination 억제 (하이) 분석 결과 ( 그림 5)
        1. 하이 분석 결과 수행 하기 전에 치료 수용 체와 마우스 세라 파괴 효소 (RDE) 혈 청에 존재 하는 모든 일반적인 억제제를 제거 하. 4 양의 RDE 작업 희석에 마우스 혈 청의 1 볼륨을 추가 (혈 청 희석이 지금 1:5). O/N (12-품 어 18 h) 37 ° C 물 목욕에서.
        2. 는 RDE 비활성화를 30 분 동안 56 ° C에서 혈 청 샘플 열.
        3. 미리 표준 하 분석 결과 28 여 PR8 WT의 hemagglutination 활동 (HAU)을 결정합니다. 바이러스 HAU 결정 되 면 1 x PBS에서 50 µ L 당 8 HAU에 바이러스 성 재고 희석.
        4. 2-fold 직렬 희석 (12 희석) 96-잘 V-하단 플레이트에 세라 RDE 치료의 준비. (예를 들어, A12로 A1) 각 혈 청 샘플에 대 한 한 행을 사용 합니다. A 1에서
          1. 1 x의 추가 25 µ L PBS A12 웰 스 한 행에 각 혈 청 샘플을 테스트 합니다. 열 (A1)의 첫 번째 잘 1 x PBS의 25 µ L를 RDE 취급 세라 (1:5)의 25 µ L를 추가 합니다. 첫 번째 혈 청 희석은 1시 10분.
          2. 일단 모든 RDE 취급 세라 첫 번째 열에 추가 됩니다 (예를 들어, A1, B1, C1), 멀티 채널 피펫으로 아래로 pipetting으로 세라와 1 x PBS를 혼합을 사용 하 여. 첫 번째 열에서 두 번째 열 (예를 들어, A2에 A1에서) 희석된 세라의 25 µ L를 전송. 희석 사이의 팁을 변경 하 고 혼합.
          3. 반복 단계 5.3.1.4.2. 마지막 열 (예를 들어, A12, B12, C12)에 도달할 때까지. 모든 우물 (25 µ L) 볼륨 일관성을 유지 하는 마지막 열에서 25 µ L를 삭제 합니다. 네거티브 제어로 어떤 세라 없이 1 x PBS의만 25 µ L을 포함 하는 우물의 1 행 포함.
        5. 는 IAV의 추가 25 µ L 96 잘 V-바닥판에 세라와 우물의 각 8 우/50 µ L 희석; 각 최종 볼륨 잘 50 µ L, 바이러스의 4 우를 포함 하는. 반복 pipetting으로 내용을 혼합. 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어
        6. 우물의 각 0.5% 터키 RBCs의 추가 50 µ L. 반복 pipetting으로 내용을 혼합. 얼음에 30-45 분 동안 접시를 품 어. 제어 웰 스 (1 x PBS)에서 Rbc 형성 우물의 바닥에 붉은 침전 (즉, 펠 릿) 때 하이 분석 결과 시각적으로 읽기.
          참고: Rbc와 같은 다른 종에서 닭고기, 기니 돼지 또는 말 또한 사용 될 수 있다.
        7. 잘는 Rbc 빨간색 펠 릿을 형성 하 고 hemagglutination에서 발생 하지 않습니다 마지막을 식별 하 여 하이 titers 계산.
          참고:이 희석의 상호 가치 하이 titer입니다. 상호 가치 1시 20분에 대 한 해결 하기 위해 20의 요인에 의해 증식의 첫 번째 행에서 혈 청 희석.
      2. 바이러스 microneutralization 분석 결과 (VNA) ( 그림 6)
        1. VNA, 전날 준비 대로 5.2.1.1 단계에 설명 된 다음 날 80-90% 합류에 도달 하는 96 잘 접시에서 MDCK 셀. 200: FFU/25 µ L를 감염 미디어에서 PR8 WT의 희석을 준비.
        2. 비활성화 1 h. 56 ° C에서 마우스 세라 triplicate 96 잘 접시를 사용 하 여 마우스 세라 당 2-fold 직렬 희석 (12 희석)를 확인 합니다. (예를 들어, A1) 첫 번째 행의 첫 번째 잘에서 감염 미디어의 µ L
          1. 추가 40 µ L 160 혈 청의 (혈 청 희석 1:5). Pipetting으로 혼합. 다른 우물을 감염 미디어의 100 µ L를 추가 (H12 A2).
          2. 1:2 희석 (예를 들어, A2에 A1에서)을 두 번째 행에 첫 번째 행에서 전송 100 µ L. 희석과 혼합 사이 팁 pipetting으로 변경 합니다. 마지막 행 (예를 들어, A12)까지이 반복 합니다. 모든 우물 (100 µ L) 볼륨 일관성을 유지 하는 마지막 행에서 100 µ L를 폐기.
        3. 모든 우물을 IAV 희석의 추가 100 µ L. 실시간에서 1 시간을 품 어 한편, 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 96 잘 접시의 MDCK 세포에서 조직 문화 매체를 제거 하 고 두 번 1 x PBS의 100 µ L/잘 씻어.
        4. MDCK 셀의 96 잘 접시 각 컨트롤에 대 한 두 개의 행을 두고. 한 행 (바이러스와 세라 없이 셀), 부정적인 컨트롤 이며 다른 행 감염 (바이러스 세라 나 모의 감염 마우스에서 세라에에서 셀)의 긍정적인 통제.
        5. 전송 50 µ L/음 바이러스 항 체 접시에서 MDCK 셀의 96 잘 접시를. 바이러스 흡착 수 있도록 RT에 1 시간을 위한 락 플랫폼에 접시를 넣어.
        6. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 바이러스 항 체 inoculum을 제거 하 고 TPCK 취급 trypsin의 1 µ g/mL를 포함 하는 감염 된 후 미디어의 100 µ L/잘 추가.
        7. Cytopathic 효과 (CPE)는 긍정적인 제어 (또는 제어 혈 세라의 부재에 감염 된 세포)에서 관찰 될 때까지 5% CO 2와 33 ° C 또는 37 ° C 배양 기에서 3-4 일에 대 한 셀을 품 어.
        8. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 조직 문화 매체를 제거 하 고 추가 0.1% 크리스탈 바이올렛의 100 µ L/잘. 진공 흡 인기 멀티 채널 어댑터를 사용 하 여 크리스탈 바이올렛 솔루션 실시간 제거에 1 시간에 품 어. 씻고 증류수로 3 번 웰 스. 실시간에서 접시 건조
        9. MDCK 셀의 confluent 셀 단층 유지 높은 희석을 식별 하 여 VNA titers 계산.
          참고:이 해당 희석의 상호 가치는 중화 항 체 titer. 상호 가치 1시 10분을 해결 하기 위해 10의 요인에 의해 증식에 행의 첫 번째 잘 세라의 희석.

    6. 보호 효능 백신 ( 그림 3)의 평가

    1. 예방 접종 i.n. 여성 6 하-8-1 주일-오래 된 C57BL/6 마우스의 그룹 (n = 11) PR8 LAIV 복용량 (: FFU/마우스) 테스트와 모의 접종 생쥐의 또 다른 그룹 (n = 11) 1 살 균 PBS x와 함께. 섹션 3에서에서 앞에서 설명한 마우스 i.n. 예방접종 수행.
    2. 14 일 사후 예방 접종, 쥐 피 고 섹션 3에에서 설명 된 대로 세라를 수집 합니다. 5.1.1 절에서 설명 하는 대로 PR8 WT에 대 한 항 체를 중화 하 고 총의 존재를 분석.
    3. 15 일 사후 예방 접종, 측정 하 고 마우스 몸 무게 (0 일)를 기록 합니다. 섹션 3에서에서 앞에서 설명한 PR8 WT (동종 도전)의 치명적인 복용량을 가진 쥐 i.n. 도전.
    4. 측정 체중과 생존 (n = 5 / 그룹) 도전 병 적 상태와 사망률 PR8 WT 도전 예방 접종된 생쥐 (4.1 단원)에 의해 제작 평가 후 14 일 동안.
    5. 마우스 폐와 비 강 점 막 (n = 3/일) 하루 2에서 4 PR8 WT. 균질과 도전 후 폐 분석 및 비 강 점 막에 섹션 4.2에에서 설명 된 대로 평가 예방 접종 생쥐에서 PR8 WT의 바이러스 성 복제.

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    결과

    바이러스 성 병 인 쥐에서의 특성

    IAV의 병 인은 병 적 상태와 사망률의 감염에 의해 발생 관련이 있습니다. 이러한 두 매개 변수 마우스에서 쉽게 계산 될 수 있습니다: IAV 병 적 이며 감염 된 쥐에 있는 몸 무게 손실과 관련 된 생존의 비율 (그림 1) 사망률을 나타낼 것 이다. 몸 무게와 IAV 감염 된 쥐에 있는 생존은 일반적으로 모니터링 매일 감염8,9,,1029후 적어도 2 주 동안. 가져온 생존 데이터 MLD50 리드와 Muench

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    토론

    IAV의 마우스 모델 IAV pathogenesis, immunogenicity 및 보호 효능의 학문 vivo에서 널리 사용 됩니다. 쥐의 작은 크기 쉽게 그들을 조작 하 고 흰 족제비 또는 기니 돼지 등 다른 동물 모델에 비해 저장. 또한, 동물 비용 측면에서 용이성, 주택 및 재생 그들의 사용에에서 허용 전 임상 예방 접종 시험 동물의 다 수 필요 하다. 특히, 마우스에서 사용 된 이후 여러 연구 분야, 몇몇 분자 되며 면역학 murine 시 약 사용할 수 IAV 연구에 대 한 그들의 사용을 촉진 하기 위하여. 최소 호스트 변화와 진화론 비슷한 면역 시스템의 존재에 존재 하는 또한, 인 간에 게 그들 IAV 연구에 대 한 강력한 작은 동물 모델. 마지막으로, 호스트 바이러스 성 단백질 상호 작용의 연구 및 바이러스 성 병 인에 그들의 기여는 현재 코 쥐에 접근에 의해 가능. 그러나, IAV 연구에 대 한 마우스를 사용 하 여 여러 가지 이점을 옆에 그들은 유용 하지 않습니다 IAV 전송 연구. 그러므로, 흰 ...

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    공개 사항

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    LM-S 실험실에서 인플루엔자 바이러스에 대 한 연구는 부분적으로 뉴욕 인플루엔자의 우수 센터 (NYICE), 인플루엔자 연구 및 감시 (CEIRS)의 NIAID 센터의 회원에 의해 자금. 원고 수정에 그녀의 지원에 감사 웬디 베이츠 하 고.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    Madin-Darby 송곳니 신장 (MDCK) 상피 세포ATCCCCL-34
    6-8 주 된 암컷 C57BL / 6 마우스국립 암 연구소 (NCI)01XBE
    터키 붉은 blod 세포Biolink IncStore at 4 ° C
    둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStore at 4 ° C
    Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-050-20 °에 보관; C
    페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 (PSG) 100xCorning30-009-CI-20 °에 저장; C
    페니실린/스트렙토마이신 (PS) 100xCorning30-00-CI-20 °에 저장; C
    Bovin 알부민 용액 (BA)Sigma-AldrichA74094 °에 저장; C
    Bovin 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA96474 °에 저장; C
    Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) 처리 트립신Sigma-AldrichT8802-20 °에 저장; C
    중립 완충 포르말린 10%EMD65346-85RT
    Triton X-100J.T.BakerX198-07RT
    단클론 항체 항-NP 인플루엔자 A 바이러스 HB-65ATTCH16-L10-4R5-20 °에 저장; C
    Polyclonal 토끼 항 마우스 면역 글로불린 / FITCDakoF02614 °에 저장; C
    ECL 안티 마우스 IgG, 양 고추 냉이 과산화 효소 연결 전체 항체GE HealthcareLNA931V / AGStore at 4 ° C
    TMB 기판 세트BioLegend4211014 °에서 저장; C
    Vmax 운동 플레이트 리더분자 장치
    Dounce 조직 분쇄Thomas Scientific7722-7
    수용체 파괴 효소, RDE (II)Denka Seiken Co.370013-20 °에서 보관하십시오. C
    Crystal VioletFisher ScienctificC581-100RT
    96-well 세포 배양 플레이트Greiner Bio-one655-180
    세포 배양 접시 100mmGreiner Bio-one664-160
    Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Fisher Scienctific269620
    Nunc 96-Well 폴리스티렌 원추형 바닥 MicroWell 플레이트Thermo Fisher Scienctific249570
    Puralub Vet 연고Dechra9N-76855
    형광 현미경OlympusOlympus IX81
    기 에 보관

    참고문헌

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