Drosophila imaginal disc epithelia의 모자이크 클론 분석은 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 여기에서는 GAL4-UAS 시스템을 사용하여 Drosophila wing imaginal discs에서 종양을 유도하는 프로토콜을 설명하고 종양 표현형을 분류하는 진단 방법을 소개합니다.
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이 논문에서
요약
초록
암의 초기 단계에서, 형질 전환 된 돌연변이 세포는 세포 학적 이상을 보이고 통제되지 않은 과증식을 시작하며 점차적으로 조직 구성을 붕괴시킵니다. Drosophila melanogaster 는 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 암 생물학에서 대중적인 실험 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히 Drosophila imaginal disc (애벌레의 상피 형성)를위한 유전 도구는 인간 상피 세포의 초기 단계와 유사한 상황 인 정상 상피 조직 내에서 형질 전환 된 종양 세포의 생성을 가능하게합니다. 그러나 Drosophila wing imaginal disc의 종양 발생에 관한 최근의 연구에 따르면, 종양 발생은 조직 고유의 세포 구조와 국소 미세 환경에 달려있어 상상적으로 종양 표현형을 평가할 때 종양 형성 자극에 대한 영역 특이성 감수성을 고려하는 것이 중요하다는 것을 알 수있다 디스크. 종양 진행의 표현형 분석을 용이하게하기 위해GAL4-UAS 시스템을 이용하여 날개 상상 디스크에서 종 양성 종양을 유도하는 유전자 실험 프로토콜을 설명합니다. 우리는 상피 성 상피에서 유도 된 클론 병변의 표현형을 분류하기위한 진단 방법을 소개한다. 종양 진행의 다양한 단계 (과형성, 이형성증, 신 생물 등)를 구분하기위한 분명한 분류 방법은 이전에 기술되지 않았다. 이러한 방법은 Drosophila의 여러 기관에서 종양 phenotypes의 클론 분석에 널리 적용 할 수 있습니다.
서론
상피 조직은 발달 및 세포 회전율을 통해 조직을 유지할 수있는 현저한 항상성을 지닌 고도로 조직화 된 시스템입니다. 그러나이 강력한자가 조직 시스템은 종양 발달 중에 점차적으로 혼란을 겪습니다. 종양 발달 초기에, 종양 유전자 활성화 또는 종양 억제 유전자 불 활성화로 인해 발생하는 개개의 돌연변이 세포가 상피층 내에서 출현한다. 이 형질 전환 된 "종양 세포"가 억제 환경을 피하고, 상피 조직을 파괴하고, 제어되지 않은 증식을 시작할 때, 종양 형성이 발생합니다 1 . 지난 수십 년 동안 유전학 및 분자 생물학 분야의 탁월한 기술 발전은 암 연구에서 눈부신 발전을 이루었습니다. 특히, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase 표적) 유사 분열 재조합과 같은 Drosophila melanogaster 에서 유 전적으로 모자이크 분석 도구를 사용한 최근의 연구2 및 플립 - GAL4 - UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 시스템 3 , 종양의 형성과 전이에 관련된 유전자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여했습니다 4 ,
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프로토콜
1. 십자가 비행 및 유도 유도
- 처녀 파리를 수집하기 전에 유리 병에서 모든 파리를 12 시간 안에 제거하십시오.
- CO 2 가스를 주입하고 파리를 CO 2 플라이 패드 위에 놓아 바이알의 파리를 마취시킵니다.
- CO 2 플라이 패드의 10 - 20 명의 처녀 암컷과 10 명의 수컷을 신선한 유리 병으로 옮기고 25 ° C에서 1 일 동안 품어 라.
- 이들 파리를 신선한 유리 병에 옮기고 25 ° C에서 12 시간 동안 품어 낸다.
참고 : 처녀 암컷은 첫날에 충분한 알을 낳지 않으므로 첫 번째 약병을 폐기하십시오. - 인핸서 GAL4 라인 들어, 성인 파리를 제거하고 25 분 해부 때까지 바이알을 품어.
- 플립 아웃 GAL4에 의해 모자이크 클론의 유도에 대한 성인 파리를 제거하고 25에서 2 ~ 4 일 동안 유리 병을 품어 ° C. 열 충격 이전의 배양 시간은 실험 목적에 달려있다. 난자 채취 2 일 후 열충격 (AED)은 미성숙 한 두 번째 날에 모자이크 클론을 생성한다상상 상피를 형성한다. 3 또는 4 일 후 열 충격은 분화 된 조기 - 중반 - 셋째 inst 상상 세포에서 모자이크 클론을 생성합니다.
....
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결과
Drosophila wing imaginal disc에서 RNAi 매개 된 nTSG-knockdown에 의해 실험적으로 유도 된 종 양성 종양을 확인하기 위해 3 가지 다른 GAL4 드라이버를 사용하여 lgl 또는 scrib에 대한 UAS-RNAi 를 발현 시켰다 : (1) sd-GAL4 . 힌지 영역 ( 그림 2 및 그림 3A )에서 날개 파우치 및 마일드 표현. (2) 등 지느러미 내측 배의 두 영역에서 강력한 발현, 하나의 앞쪽 - 외측 영역에서의 약한 발현 및 복부 - 뒤쪽 도메인에서의 약한 발현을 포함하여 힌지의 하위 도메인을 유도하는 upd-GAL4 ( 도 2
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토론
GAL4-UAS 시스템은 초파리 (26) 내의 표적 유전자의 발현을위한 가장 강력한 유전 적 도구이다 크게 생체 4 종양 세포 유도 분석을 용이하게한다. 이 시스템은 변형 된 종양 세포가 정상 상피 세포로 둘러싸인 인간 암의 초기 단계와 매우 유사한 상황 인 야생형 상피 조직 내 종양 억제 유전자의 knockdown 또는 종양 유전자의 과발현을 나타내는 클론의 생성을 가능하게한다. GAL4 인핸서 - 트랩 라인 또는 Janelia GAL4 라인 27 과 같은 인핸서 서열에 의해 조절되는 GAL4 드라이버 라인은 고유하고, 시공간적으로 제한된 발현 패턴을 갖는다. 따라서, 이러한 enhancer-GAL4 계통은 제한된 상피 원판에서 종양을 지속적으로 유도하는데 유용합니다. 본 연구에 제시된 sd-GAL4 및 upd-GAL4 이외에<.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 원고를 비판적으로 읽었던 J. Vaughen에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가신 교부금 번호 26891025, 15H01500 및 YT에 대한 다케다 과학 재단 연구 보조금의 교부금으로 지원되었습니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>시약 | |||
| 인산염 완충식염수(PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| 포름알데히드 | Wako | 064-00406 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma | A7906 | |
| 일반 염소 혈청 | Sigma | G6767 | |
| 장착 매체, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | PBTG에 희석, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 혼합 1:1:1 및 PBTG에 희석, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental 연구 Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | PBTG에 희석, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | PBS에 희석, 1:40 |
| 염소 항-마우스 IgG 항체, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | PBTG에 희석, 1:400 |
| Name< | strong>Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| em<>upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | 와 재결합블루밍턴 초파리 재고 센터 | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | 블루밍턴 초파리 재고 센터 | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila 재고 센터 | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (플립아웃 GAL4) | 블루밍턴 초파리 스톡 센터 | #4780 | UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | 세 번째 염색 |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | 두 번째 염색체 |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | 세 번째 염색체 |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
참고문헌
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
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재인쇄 및 허가
