이 연구는 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 쉽고 동시에 격리 할 수있는 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
각질 세포는 여러 기관 또는 심지어 같은 조직 내에서 이질성을 나타내는 혈관 주변의 다 분화능 세포입니다. 골격근에는 여러 분자 마커를 표현하고 뚜렷한 분화능을 갖는 적어도 2 개의 일주 체형 하위 집단 (유형 I 및 유형 II라고 함)이 있습니다. NG2-DsRed 및 Nestin-GFP 이중 - 형질 전환 마우스를 사용하여, 유형 I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) 및 유형 II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) 혈관 주위 세포가 성공적으로 분리되었다. 그러나 이러한 double-transgenic mice의 유용성은이 정제 방법의 광범위한 사용을 방해합니다. 이 연구는 골격근으로부터 I 형 및 II 형 세포를 쉽고 동시에 분리 할 수있는 대체 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용하고 Nestin-GFP 신호와 함께 NG2보다는 PDGFRβ를 표적으로 삼습니다. 격리 후 I 및 ty를 입력하십시오.pe II 혈관 주위 세포는 별개의 형태를 나타낸다. 또한 이중 형질 전환 마우스에서 분리 된 것과 같은이 새로운 방법으로 분리 된 1 형 및 2 형 혈관 주위 세포는 각각 지방 형성 및 근육 형성이다. 이 결과는이 프로토콜이 골격근과 아마도 다른 조직으로부터 일주 전 세포 모집단을 분리하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
서론
근이영양증은 지금까지 효과적인 치료법이없는 근육 퇴행성 장애입니다. 조직 재생을 촉진시키는 치료제 개발은 언제나 큰 관심사였습니다. 조직 재생 및 손상 후의 수리는 상주하는 줄기 세포 / 전구 세포에 달려 있습니다 1 . 위성 세포는 근육 재생 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7에 기여하는 근원 전구 세포입니다. 그러나 그들의 임상 적 사용은 주사 후 제한된 이동 및 낮은 생존율뿐만 아니라 시험관 내 증폭 8 , 9 , 10 , 11 후에 감소 된 분화능에 의해 방해 받는다. satelli 외에도te 세포에서 골격근은 또한 혈소판 유래 성장 인자 수용체....
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프로토콜
Wildtype과 Nestin-GFP 트랜스 제닉 마우스를 미네소타 대학의 동물 시설에 넣었다. 모든 실험 절차는 미네소타 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 근육 해부 및 단세포 격리
- 트 리브로 모에 타놀 (250 mg / kg, ip)으로 성인 생쥐 (남성과 여성 모두 6-10 주)를 안락사시키고 70 % 에탄올로 복부 피부를 살균하십시오.
참고 : ketamine이 NMDA 수용체와 상호 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에 마비 / 안락사를 위해 트라이 브로 모에탄올을 케타민 대신 여기에 사용했습니다. 이는 잠재적으로 연구에 영향을 미칠 수 있습니다. - 쥐를 앙와위에 놓고 메스를 사용하여 복부 피부에 수평 절개를하십시오. 뒷다리 근육을 드러내려면 반대 방향으로 당겨 피부를 손으로 떼어냅니다.
- 콜렉포셉과 가위를 사용하여 두 개의 뒷다리에서 근육. 얼음에 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 보충 한 무균 인산 완충 식염수 (PBS)에 보관하십시오.
- 1 % P /....
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결과
레이저 강도 및 채널 보정을 포함한 FACS 매개 변수는 염색되지 않은 컨트롤 및 단색 컨트롤의 결과를 기반으로 보정됩니다. PDGFRβ-PE-FMO 대조군은 PDGFRβ-PE + 집단 ( 그림 1A )에 대한 게이팅을 설정하는 데 사용됩니다. PDGFRβ-PE 세포 중 Nestin-GFP + 와 Nestin-GFP - 세포를 나타내는 두 집단이 명확하게 분리되어있다 ( 그림 1A ). PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP의 게이팅 경계는 PDGFRβ-PE + 및 Nestin-GFP + ( 그림 1A )에.......
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토론
각질 세포는 모세 혈관 21 , 26 의 반 관절 표면에 위치한 다 능성 혈관 주위 세포 22 , 23 입니다. 골격근에서, 혈관 주위 세포는 지방 형성 및 / 또는 근원 형성 경로 19 , 20 , 24를 따라 분화 할 수 있습니다. 최근의 연구에 따르면 마커 발현이 두 가지이고 19 , 24 , 25의 독특한 분화 잠재력을 가진 두 가지 혈관 주위 세포가 발견되었습니다. Type I (.......
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공개 사항
모든 저자는 공개 할 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
이 연구는 근력 근이영양증 재단 (MDF-FF-2014-0013)의 기금 지원과 미국 심장 협회 (16SDG29320001)의 과학자 개발 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 셀 분류기 | Sony | SH800 | |
| 자동 설정 비즈 | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC 기초 배지(마우스) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| 지방생성 자극 보충제(마우스) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| 콜라겐 분해 효소 유형 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25 % 트립신 / EDTA | Gibco | 25200 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE 항체 | eBioscience | 12-1402 | |
| 페리핀 항체 | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin 항체 | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-항토끼 항체& 주의; | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse 항체 | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Vector Laboratories | H-1200 | 가 있는 마운팅 배지 | |
| ThermoFisher Scientific | D1306 | ||
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G 바늘 | BD | 305196 | |
| 10 mL 혈청 피펫 | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
참고문헌
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispens....
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재인쇄 및 허가
