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방법 논문

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55904

⸱

2017년 5월 26일

 ,  , 
1College of Pharmacy, University of Minnesota

이 논문에서

요약

이 연구는 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 쉽고 동시에 격리 할 수있는 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

각질 세포는 여러 기관 또는 심지어 같은 조직 내에서 이질성을 나타내는 혈관 주변의 다 분화능 세포입니다. 골격근에는 여러 분자 마커를 표현하고 뚜렷한 분화능을 갖는 적어도 2 개의 일주 체형 하위 집단 (유형 I 및 유형 II라고 함)이 있습니다. NG2-DsRed 및 Nestin-GFP 이중 - 형질 전환 마우스를 사용하여, 유형 I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) 및 유형 II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) 혈관 주위 세포가 성공적으로 분리되었다. 그러나 이러한 double-transgenic mice의 유용성은이 정제 방법의 광범위한 사용을 방해합니다. 이 연구는 골격근으로부터 I 형 및 II 형 세포를 쉽고 동시에 분리 할 수있는 대체 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용하고 Nestin-GFP 신호와 함께 NG2보다는 PDGFRβ를 표적으로 삼습니다. 격리 후 I 및 ty를 입력하십시오.pe II 혈관 주위 세포는 별개의 형태를 나타낸다. 또한 이중 형질 전환 마우스에서 분리 된 것과 같은이 새로운 방법으로 분리 된 1 형 및 2 형 혈관 주위 세포는 각각 지방 형성 및 근육 형성이다. 이 결과는이 프로토콜이 골격근과 아마도 다른 조직으로부터 일주 전 세포 모집단을 분리하는데 사용될 수 있음을 시사한다.

서론

근이영양증은 지금까지 효과적인 치료법이없는 근육 퇴행성 장애입니다. 조직 재생을 촉진시키는 치료제 개발은 언제나 큰 관심사였습니다. 조직 재생 및 손상 후의 수리는 상주하는 줄기 세포 / 전구 세포에 달려 있습니다 1 . 위성 세포는 근육 재생 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7에 기여하는 근원 전구 세포입니다. 그러나 그들의 임상 적 사용은 주사 후 제한된 이동 및 낮은 생존율뿐만 아니라 시험관 내 증폭 8 , 9 , 10 , 11 후에 감소 된 분화능에 의해 방해 받는다. satelli 외에도te 세포에서 골격근은 또한 혈소판 유래 성장 인자 수용체 - 베타 (PDGFRβ) - 양성 간질 세포와 같은 근육 형성 잠재력이 12 , 13 , 14 , 15 , 16 인 많은 다른 세포 집단을 포함한다. 근육에서 파생 된 PDGFRβ + 세포가 근원 세포로 분화되어 근육 병리학 및 기능을 향상시킬 수 있다는 증거가있다 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ는 우세하게 혈관 주위 세포 인 다 혈관 주위 세포 21 을 나타냅니다. 22 , 23 . PDGFRβ 외에도 Neuron-Glial 2 (NG2) 및 CD146을 비롯한 많은 다른 마커가 i혈관 주위 세포를 확인하십시오 21 . 그러나 이들 마커 중 어느 것도 둘 다 pericyte-specific 21 이 아님을주의해야합니다. 최근 연구에 의하면 유형 I과 유형 II라고 불리는 근육 주변 세포의 두 가지 유형이 밝혀 졌는데, 이는 서로 다른 분자 표지를 나타내며 별개의 기능을 수행합니다 19 , 24 , 25 . 생화학 적으로, 유형 I 주변 세포는 NG2 + Nestin - 이고, 유형 II 주변 세포는 NG2 + Nestin + 19 , 24 이다. 기능적으로 유형 I의 세포주는 지방 축적 및 / 또는 섬유화에 기여하는 지방 형성 분화를 겪을 수 있지만 유형 II의 혈관 주위 세포는 근원적 인 경로를 따라 분화되어 근육 재생에 기여할 수있다 19 , 24 , 25 . 이러한 결과는 다음을 입증합니다 : (1) 유형 I 혈소판은 b지방 퇴행성 장애 / 섬유증의 치료를 목표로하는, 및 (2) II 형 혈관 주위 세포는 근이영양증에 대한 치료 가능성이 크다. 이러한 개체군에 대한 추가 조사와 특성 규명을 위해서는 높은 수준의 순도에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포의 분리를 가능하게하는 격리 프로토콜이 필요합니다.

현재, pericyte subpopulations의 고립은 NG2 - DsRed 및 Nestin - GFP 이중 transgenic 마우스 19 , 24 에 의존합니다. NG2-DsRed 생쥐의 유용성과 대부분의 NG2 항체의 품질은이 방법의 광범위한 사용을 제한합니다. 모든 NG2 + 혈관 주위 세포가 골격근 19 , 20 , 24 에서 PDGFRβ도 발현한다는 것을 감안할 때 우리는 혈관 주위 세포와 그 모집단의 분리를 위해 NG2가 PDGFRβ로 대체 될 수 있다고 가정한다. 이 작업은 FACS 기반 프로토콜을 설명합니다.PDGFRβ 염색 및 Nestin-GFP 신호를 사용합니다. 이 방법은 (1) NG2-DsRed 배경을 필요로하지 않으며 (2) 잘 특성화 된 상업적으로 이용 가능한 PDGFRβ 항체를 사용하기 때문에 조사자에게는 덜 까다로운 방법입니다. 또한 I 형과 II 형 혈관 주위 세포를 고순도로 동시에 분리 할 수있어 이러한 혈관 주위 세포 집단의 생물학적 특성과 치료 가능성을 연구 할 수 있습니다. 정화 후, 이들 세포는 배양 물에서 배양 될 수 있고, 그 형태는 시각화 될 수있다. 이 연구는 또한 이중 형질 전환 마우스에서 정제 된 것과 같은이 방법을 사용하여 분리 된 I 형 및 II 형 세포 주변 세포가 각각 지방 형성 및 근육 형성이라는 것을 보여줍니다.

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프로토콜

Wildtype과 Nestin-GFP 트랜스 제닉 마우스를 미네소타 대학의 동물 시설에 넣었다. 모든 실험 절차는 미네소타 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 근육 해부 및 단세포 격리

  1. 트 리브로 모에 타놀 (250 mg / kg, ip)으로 성인 생쥐 (남성과 여성 모두 6-10 주)를 안락사시키고 70 % 에탄올로 복부 피부를 살균하십시오.
    참고 : ketamine이 NMDA 수용체와 상호 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에 마비 / 안락사를 위해 트라이 브로 모에탄올을 케타민 대신 여기에 사용했습니다. 이는 잠재적으로 연구에 영향을 미칠 수 있습니다.
  2. 쥐를 앙와위에 놓고 메스를 사용하여 복부 피부에 수평 절개를하십시오. 뒷다리 근육을 드러내려면 반대 방향으로 당겨 피부를 손으로 떼어냅니다.
  3. 콜렉포셉과 가위를 사용하여 두 개의 뒷다리에서 근육. 얼음에 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 보충 한 무균 인산 완충 식염수 (PBS)에 보관하십시오.
  4. 1 % P / S 2 회 보충 된 얼음처럼 차가운 PBS에서 해부 된 뒷다리 근육을 씻고 멸균 10cm 플레이트로 옮깁니다.
  5. 조심스럽게 2X 배율로 해부 현미경하에 포셉과 가위를 사용하여 근육, 혈관 및 결합 조직을 절개하십시오.
  6. 가늘게 썰어 근육을 작은 조각 (1 ~ 2mm 3 )으로 멸균 가위와 칼을 사용하여 깎습니다. 필요한 경우, 근육이 건조되지 않도록하기 위해 DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium)을 소량 첨가하십시오.
  7. 기계적으로 10 ML 혈청 피펫을 통해 10 배 위아래로 pipetting하여 조직을 분해.
  8. 혼합물에 새로 만든 소화 용액 (0.2 % 타입 2 collagenase가 보충 된 DMEM)을 첨가하십시오. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.35 회전 / 분에서 교반.
  9. 혼합물을 균질화하기 위해 18 G 바늘을 사용하여 분쇄하십시오. 그런 다음 500 xg에서 5 분간 원심 분리합니다. 뜨는을 버리고 0.25 % 트립신 / EDTA에 펠렛을 resuspend. 37에서 품어 ° C 10 분. 원심 분리 단계를 두 번 더 반복합니다.
  10. 20 % 태아 소 혈청 (FBS)을 보충 한 DMEM 10 mL를 넣고 500 xg에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액을 버리고 적혈구 용해 완충액 (155 MM NH 4 Cl, 10 MM KHCO 3 , 0.1 MM EDTA)에 펠렛을 resuspend.
  11. 5 분 500 XG에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 정렬 버퍼 (20 MM HEPES, 산도 7.0, 1 MM EDTA, 그리고 칼슘 / Mg 2 + 무료 PBS, 산도 7.0에서 1 % BSA)에 펠렛을 resuspend. 혼합물을 40 μm 셀 여과기로 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
  12. 5 분 500 XG에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 정렬 버퍼 1 ML에 펠렛을 resuspend.
  13. 카운트hemocytometer로 세포 수를 계산하고 정렬 버퍼에서 5 x 10 6 / mL로 단일 세포 현탁액을 희석.

2. 세포 염색 및 정렬

  1. 표 1 에 설명 된대로 컨트롤과 샘플을 준비합니다. 표 1 에 설명 된대로 30 분 동안 얼음에 각 항체와 단일 세포 현탁액을 얼룩.
  2. 5 분 500 XG에서 원심 분리기와 정렬 버퍼와 두 번 펠렛을 씻으십시오.
  3. 표 1에 표시된대로 단일 세포 솔루션에 DAPI를 추가합니다. PDGFRβ-PE-FMO 컨트롤 및 샘플에 대해 DAPI 단색 컨트롤에는 5 μg / mL DAPI (최종 농도)를 사용하고 DAPI 단일 색상 컨트롤에는 1 μg / mL DAPI를 사용합니다. 실험을하는 동안 모든 튜브를 얼음에 붙이십시오.
  4. 분류기와 소프트웨어를 켜십시오. 메시지가 나타나면 100 μm 정렬 칩을 스캔하고 삽입하십시오.
  5. 자동 설정 ( 예 : 칩 정렬, 물방울 교정, 사이드 스트림 교정 및 정렬 지연 교정자동 설치 구슬을 넣으십시오.
  6. 자동 설정이 완료되면 '실험'탭으로 이동하여 '새로 만들기'를 클릭하고 '공개 템플릿'에서 '빈 템플릿'을 선택하십시오.
  7. "Measurement Settings"에서 "FL1"에 대해서는 "DAPI"를, "FL2"에 대해서는 "Nestin-GFP"를, "FL3"에 대해서는 "PDGFRβ"를 입력하십시오. "FL4"- "FL6"의 확인란을 선택 취소하십시오.
  8. 확인란을 선택하여 405, 488 및 561 레이저를 활성화하고 "새 실험 만들기"를 클릭하십시오.
  9. "보상 마법사 시작"옵션을 선택하고 "보상 마법사"소프트웨어 프롬프트에 따라 보상을 설정하십시오.
    1. 염색되지 않은 컨트롤을로드하고 "시작"을 클릭하십시오. "감지기 및 임계 값 설정"을 클릭하고 FSC 및 BSC 감지기의 센서 이득을 조정하여 인구를 저울에 배치하십시오.
    2. 광고히스토그램의 왼쪽에 음의 모집단을 배치하는 FL1-FL3 형광 채널의 게인 레벨. "기록"버튼을 클릭하여 데이터를 기록하십시오.
    3. 메시지가 표시되면 단일 색상 컨트롤을 하나씩로드하십시오. "시작 및 기록"을 클릭하여 데이터를 기록하십시오. 히스토그램에서 양성 집단에 대한 게이트를 조정하십시오. "다음"을 클릭하십시오.
    4. "보상"탭에서 "매트릭스 계산"으로 이동 한 다음 "보상 설정 계산"패널에서 "계산"을 클릭하여 보상을 수행하십시오. "마침"을 클릭하여 "보상 마법사"를 종료하십시오.
  10. PDGFRβ-PE-FMO 컨트롤을로드하고 "시작"을 클릭하십시오. "모든 이벤트"플롯 아래 관심있는 세포 주위에 다각형 게이트 (게이트 A)를 그립니다.
  11. Gate A 내부를 두 번 클릭하여 하위 플롯을 만듭니다. Y 축을 DAPI로 변경하고 라이브 (DAPI 낮음 ) 셀 주위에 다각형 게이트 (게이트 B)를 그립니다. i를 두 번 클릭하십시오.자식 플롯을 만들려면 게이트 B 옆에 있습니다. X 축을 FSC-H로 변경하고 Y 축을 FSC-W로 변경하고 이중 선을 제거하기 위해 단일 선 둘레에 다각형 게이트 (게이트 C)를 그립니다.
  12. Gate C 내부를 두 번 클릭하여 하위 플롯을 만듭니다. X 축을 Nestin-GFP로, Y 축을 PDGFRβ-PE로 변경하십시오. "기록"버튼을 클릭하여 데이터를 기록하십시오.
  13. 샘플을로드하고 2.11-2.12 단계를 반복하십시오. 녹음 후 "일시 중지"를 클릭하여 샘플을 보존하십시오.
  14. PDGFRβ-PE-FMO 컨트롤을 기반으로 PDGFRβ + 및 Nestin-GFP + 세포에 대한 게이팅 경계를 정의하십시오. PDGFRβ + Nestin-GFP 및 PDGFRβ + Nestin-GFP + 개체군을위한 게이트를 그립니다.
  15. "Sorting Method"에서 "Two-way Tubes"를 선택하고 "PDGFRβ + Nestin-GFP - "및 "PDGFRβ + Nestin-GFP + "세포를 왼쪽 및 오른쪽 수집 튜브에 할당하십시오.광적으로. 수집 버퍼에 채워진 15 mL 수집 튜브를 수집 스테이지에 놓고 "Load Collection"버튼을 클릭하십시오.
  16. 샘플을 계속 실행하려면 "재시작"버튼을 클릭하십시오. PDGFRβ + Nestin - GFP - (유형 I pericytes)와 PDGFRβ + Nestin - GFP + (유형 II pericytes) 세포를 수집하려면 "정렬 시작"을 클릭하십시오.

3. 포스트 정렬 분석

  1. 5 분 500 XG에 정렬 된 세포를 원심 분리기, pericyte 매체 ( 물질 표 참조) 1 ML에 펠렛을 resuspend, hemocytometer를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다.
  2. ~ 1 x 104 세포 / cm2에서 poly-D-lysine (PDL) 코팅 된 coverslips에 종자 타입 I과 타입 II pericytes. 3 % pericyte medium에서 37 ℃, 5 % CO2로 성장시킨다.
  3. 3 일째, perisste 형태 (위상차 하에서)와 내인성 Nestin-GFP 발현을 형광 마이크로범위 (여기 레이저 : 488 nm, 여기 필터 : 470/40 nm, 방출 필터 : 515/30 nm). 20X 대물 렌즈 (0.45 NA)로 이미지를 촬영하십시오.
  4. 지방 세포를 지방 세포 (마우스 MSC 기초 매체 + 지방 생성 자극 보조제) 및 근육 형성 (DMEM + 2 % 말 혈청) 매체로 대체하여 이전에 설명한 바와 같이 지방 형성 및 근원 분화를 각각 개시한다. 매 2-3 일마다 매체를 교체하십시오.
  5. 상온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 17 일 (지방 형성 / 근원 분화 후 14 일)에 세포를 고정시켰다.
    참고 :주의 사항 : PFA는 발암 물질입니다.
  6. 이전의 발행물 19 , 20 에 설명 된대로 perilipin (지방 세포 마커) 및 S - myosin (성숙한 myotube / myofiber 마커)에 대한 면역 세포 화학 검사를 수행합니다.
    1. 상온에서 10 분 동안 고정 된 세포를 PBS로 3 번 씻으십시오.
    2. 블로킹 완충액 (PBS5 % 당나귀 혈청, 3 % BSA 및 0.3 % Triton X-100으로 보충)를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다.
    3. 안티 perilipin (2 μg / ML) 및 / 또는 안티 S - myosin (2 μg / ML) 항체 4 ° C 하룻밤 세포를 품어.
    4. 실온에서 10 분 동안 PBS로 세포를 3 번 ​​씻으십시오.
    5. 1 시간 동안 실온에서 알렉사 555 당나귀 안티 토끼 (4 μg / ML) 및 / 또는 Alexa555 당나귀 안티 마우스 (4 μg / ML) 항체와 세포를 품어.
    6. 실온에서 10 분 동안 PBS로 세포를 3 번 ​​씻으십시오.
    7. DAPI를 포함하는 장착 매체로 면역 염색 세포를 장착하십시오 (물질 표 참조). 형광 현미경 (여기 레이저 : 543 nm, 540 / 45 nm excitation과 600/50 nm emission)을 사용하여 perilipin과 S-myosin 발현을 검사하고 40X 대물 렌즈 (0.60 NA)에서 이미지를 촬영하십시오.

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결과

레이저 강도 및 채널 보정을 포함한 FACS 매개 변수는 염색되지 않은 컨트롤 및 단색 컨트롤의 결과를 기반으로 보정됩니다. PDGFRβ-PE-FMO 대조군은 PDGFRβ-PE + 집단 ( 그림 1A )에 대한 게이팅을 설정하는 데 사용됩니다. PDGFRβ-PE 세포 중 Nestin-GFP + 와 Nestin-GFP - 세포를 나타내는 두 집단이 명확하게 분리되어있다 ( 그림 1A ). PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP의 게이팅 경계는 PDGFRβ-PE + 및 Nestin-GFP + ( 그림 1A )에...

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토론

각질 세포는 모세 혈관 21 , 26 의 반 관절 표면에 위치한 다 능성 혈관 주위 세포 22 , 23 입니다. 골격근에서, 혈관 주위 세포는 지방 형성 및 / 또는 근원 형성 경로 19 , 20 , 24를 따라 분화 할 수 있습니다. 최근의 연구에 따르면 마커 발현이 두 가지이고 19 , 24 , 25의 독특한 분화 잠재력을 가진 두 가지 혈관 주위 세포가 발견되었습니다. Type I (...

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공개 사항

모든 저자는 공개 할 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 근력 근이영양증 재단 (MDF-FF-2014-0013)의 기금 지원과 미국 심장 협회 (16SDG29320001)의 과학자 개발 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
셀 분류기SonySH800
자동 설정 비즈SonyLE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin SigmaT48402
Pericyte Growth MediumScienCell1201
MSC 기초 배지(마우스)Stemcell Technologies5501
지방생성 자극 보충제(마우스)Stemcell Technologies5503
Fetal Bovine SerumGibco16000
Horse SerumSigmaH1270
콜라겐 분해 효소 유형 2WorthingtonLS004176
0.25 % 트립신 / EDTA Gibco25200
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140
PDLSigmaP6407
PDGFRβ-PE 항체eBioscience12-1402
페리핀 항체SigmaP1998
S-Myosin 항체DSHBMF-20
Alexa 555-항토끼 항체& 주의;ThermoFisher ScientificA-31572
Alexa 555-anti-mouse 항체ThermoFisher ScientificA-31570
Vector LaboratoriesH-1200가 있는 마운팅 배지
ThermoFisher ScientificD1306
HEPESGibco15630
EDTAFisherBP120
BSASigmaA2058
NH4ClFisher ScientificA661
KHCO3Fisher ScientificP184
PBSGibco14190
18 G 바늘BD305196
10 mL 혈청 피펫BD357551
OneComp eBeadseBioscience01-1111
DAPI DAPI

참고문헌

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