펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

요약

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

초록

히스톤 단백질에 대한 번역 후 변형 (PTMs)은 염색질 구조 및 유전자 발현 조절에서의 역할에 대해 널리 연구되고있다. 히스톤 PTM에 특이적인 항체의 대량 생산 및 분포는 이러한 표지에 대한 연구를 크게 촉진시켰다. 히스톤 PTM 항체는 많은 염색질 생화학 분야의 주요 시약이기 때문에 항체 특이성의 엄격한 분석이 정확한 데이터 해석과 현장에서의 지속적인 진보에 필요합니다. 이 프로토콜은 히스톤 항체의 특이성을 프로파일 링하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 통합 파이프 라인을 설명합니다. 이 절차의 설계 및 분석 측면은 Microarray 인쇄 형식의 사용자 정의를 간소화하기 위해 최근 개발 한 오픈 소스 및 대화 형 소프트웨어 패키지 인 ArrayNinja를 사용하여 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용되고 널리 사용되고있는 히스톤 PTM 항체이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 Histone Antibody Specificity Database를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다. 히스톤을 넘어, 여기에 기술 된 일반적인 방법론은 PTM 특이 적 항체의 분석에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

서론

게놈 DNA는 히스톤 단백질이있는 진핵 세포 핵 내부에 우아하게 포장되어 염색질을 형성합니다. 염색질의 반복적 인 아 단위는 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3 및 H4 ¹⁾ 의 8 량체 핵 주위에 감싸 진 147 염기쌍의 DNA로 구성된 뉴 소솜 (nucleosome)이다. 크로마 틴은 느슨하게 패킹 된 진균 염색체와 단단히 채워진 헤테로 크로마 틴 도메인으로 광범위하게 구성됩니다. 염색질 압축 정도는 단백질 기계가 복제, 전사 및 수리와 같은 기본적인 DNA 템플릿 공정을 수행하기 위해 기본 DNA에 접근 할 수있는 정도를 조절합니다.

염색체의 맥락에서 게놈 접근성의 주요 조절 인자는 히스톤 단백질 ^{2 , 3} 의 구조화되지 않은 꼬리와 핵심 부위의 PTM입니다. 히스톤 PTM은 염색질 ⁴ 의 구조에 직접적으로 영향을 미치고 간접적으로 기능합니다.염색질 개질, 효소 및 스캐 폴딩 활동을하는 독자 단백질 및 관련 거대 분자 복합체의 모집 ⁵ . 지난 20 년간 히스톤 PTM 기능에 대한 연구는 세포의 운명....

프로토콜

1. ArrayNinja 설치 및 실행

1. www.virtualbox.org에서 Oracle Virtual Box를 다운로드하여 설치하십시오.
2. http://research.vai.org/Tools/arrayninja에서 ArrayNinja 가상 시스템 (VM)을 다운로드하고 압축을 푸십시오.
3. VirtualBox를 열고 'Machine', 'Add'를 클릭하여 ArrayNinja VM을 추가하고 ArrayNinja VM이 저장된 폴더에서 arrayninja.vbox를 선택하십시오.
4. 가상 박스에서 ArrayNinja를 선택하고 초록색 '시작'화살표를 클릭하여 ArrayNinja를 시작하십시오.
5. Virtual Box는 새 창을 열고 웹 브라우저에서 localhost : 2080으로 이동하여 VM에 액세스 할 수 있다는 메시지를 표시합니다.60; 참고 : ArrayNinja의 컨테이너 버전 hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/를 통해도 가능합니다

2. 배열 슬라이드 및 소스 플레이트 레이아웃 디자인

1. ArrayNinja 인터페이스의....

결과

이 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성의 분석을위한 펩타이드 마이크로 어레이 플랫폼을 설계하고 제조하는데 사용되었습니다. 이 어레이는 핵심 및 변형 히스톤 단백질에서 발견되는 PTM의 많은 조합을 나타내는 300 개 이상의 고유 한 펩타이드 기능 (20-40 잔기 길이) 라이브러리를 조회합니다 ³⁸ . 이 파이프 라인은 널리 사용되고 상업적으로 이용 가능한 많은 히스톤 PTM 항체의 스크리닝을위한 작업 원이었으며, 전체 데이터 세트는 Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com)에서 이용할 수 있습니다. ^{17 세}

우리의 파이프 라인의 백본 ArrayNinja, 마이크로 어레이 작업

토론

생물 의학 연구 분야의 항체 신뢰도가 가장 중요합니다 ^{46 , 47} . 이것은 히스톤 PTM의 풍부성과 분포를 특성화하기 위해 개발 된 대부분의 기술에 대한 핵심 도구로서 항체의 위치를 ​​고려할 때 염색질 생화학에서 특히 그렇습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 히스톤 PTM 항체 특이성을 분석하기위한 펩타이드 마이크로 어레이의 설계, 제조 및 사용을위한 최적화 된 파이프 라인을 상세히 설명합니다. 이 파이프 라인은 상업적으로 이용 가능하고 널리 사용되는 히스톤 PTM 항체의 큰 숫자를 선별하는 데 사용되었으며,이 실험에서 생성 된 데이터는 온라인 및 확장 히스톤 항체 특이성 데이터베이스 (www.histoneantibodies.com) ^(17)를 통해 자유롭게 사용할 수 있습니다.

우리와 다른 사람들의 연구에서 명백한 것은 his.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인쇄 버퍼	ArrayIt	PPB
BSA	Omnipure	2390
Streptavidin-coated glass microscope slides	Greiner Bio-one	439003-25
polypropylene 384 well plate	Greiner Bio-one	784201
Biotin-fluorescein	Sigma	53608
contact microarray printer	Aushon	2470	Aushon 2470 Microarray 프린터
접촉 microarray 프린터	유전자 기계	OmniGrid 100	OmniGrid Microarray 프린터
PBS	Invitrogen	14190
차단 버퍼	어레이It	SBB
소수성 왁스 펜	Vector Labs	H-4000	ImmEdge 소수성 장벽 PAP 펜
실리콘 개스킷	Grace Bio-labs	622511
Hybridization Vessel	Thermo Scientific	267061	또는 이와 유사한 vessel
형광 염료 접합 2차 항체	Life Technologies	A-21244	Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
형광 염료 접합 2차 항체	Life Technologies	A-21235	Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
왁스 Imprinter	ArrayIt	MSI48
Tween-20	Omnipure	9490
마이크로어레이 스캐너	Innopsys	InnoScan 1100AL	또는 동급 마이크로어레이 스캐너
EipTitan 히스톤 펩타이드 마이크로어레이	에피시퍼	112001
AbSurance Pro 히스톤 펩타이드 마이크로어레이	Millipore	16668
MODified 히스톤 펩타이드 어레이	활성 모티프	13001
히스톤 코드 펩타이드 마이크로 어레이	JPT	His_MA_01
왁스	로얄 오크	걸프 왁	임프린터
용 왁스 가습 마이크로 어레이 슬라이드 혼성화 챔버	VWR	97000-284
고 처리량 현미경 슬라이드 세척 챔버	ArrayIt	HTW
현미경 슬라이드 원심분리기	VWR	93000-204
항체 1	Abcam	8898
항체 2	Millipore	07-473
비오틴화 히스톤 펩타이드	EpiCypher	12-0001	펩타이드 예. 다양한 변형을 가진 유사한 펩타이드는 여러 상업적 출처에서 구할 수 있습니다.
ImageMagick			https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja			https://rothbartlab.vai.org/tools/

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