여기, 우리는 인간 세포에서 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 기반의 레트로 바이러스 벡터의 통합 사이트의 게놈 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Moloney murine leukemia (MLV) 바이러스 기반 레트로 바이러스 벡터는 주로 아세틸 화 된 인핸서와 프로모터에 통합됩니다. 이러한 이유로 mLV 통합 사이트는 능동적 인 규제 요소의 기능적 표지자로 사용될 수 있습니다. 여기에 우리는 세포 특이 적 인핸서 (enhancer)와 프로모터 (promoter)에 대한 게놈 차원의 식별을 가능하게하는 레트로 바이러스 스캐닝 도구를 제시한다. 간단히 말해, 표적 세포 집단은 mLV 유래 벡터로 형질 도입되고 게놈 DNA는 절단 제한 효소로 절단된다. 호환 DNA 링커와 게놈 조각의 연결 후, 링커 중재 폴리머 라제 연쇄 반응 (LM-PCR)은 바이러스 - 호스트 게놈 교차점의 증폭을 허용합니다. amplicons의 대규모 시퀀싱은 게놈 전체 mLV 통합 프로필을 정의하는 데 사용됩니다. 마지막으로, 반복적 통합의 클러스터는 세포 유형 특이적인 전사 프로그램의 활성화를 담당하는 세포 특이 적 조절 영역을 확인하기 위해 정의된다.
예를 들면 체세포 줄기 세포)의 회고 확인을위한 도구 기술을 대표한다.
서론
세포 동일성은 특정 유전자 세트의 발현에 의해 결정됩니다. 프로모터 및 인핸서와 같은 시스 조절 요소의 역할은 세포 유형 특이 적 전사 프로그램의 활성화에 결정적이다. 이러한 조절 부위는 특이적인 히스톤 변형, 전사 인자 및 보조 인자 결합, 염색질 접근성과 같은 특이적인 염색질 특징을 특징으로하는데, 이는 여러 세포 유형 1 , 2 , 3 에서 게놈 전체의 식별을 위해 널리 사용되어왔다. 특히 히스톤 H3 라이신 27 (H3K27ac)의 게놈 전체 프로파일은 활성 프로모터, 인핸서 및 슈퍼 인핸서 4 , 5 , 6 을 정의하는 데 일반적으로 사용됩니다.
Moloney murine leukemia virus (MLV)는 유전자에 널리 사용되는 감마 - 레트로 바이러스입니다포유 동물 세포에서 전달. 표적 세포를 감염시킨 후 retroviral RNA genome은 pre-integration complex (P....
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프로토콜
1. 인간 세포의 MLV 형질 도입
- 대상 세포를 분리하고 eGFP 리포터 유전자를 포함하고 Vesicular Stomatitis Virus G (VSV - G) 또는 amphotropic 봉투 glycoprotein 16 pseudotyped mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 그들을 transduce.
- 모의 변형 된 세포를 다음 분석을위한 음성 대조군으로 유지하십시오. mLV 기반의 레트로 바이러스 벡터는 효율적으로 분열하는 세포를 형질 도입 할 수 있기 때문에 세포 분열을 자극하는 조건에서 표적 세포 집단을 배양하십시오. 형질 도입 조건은 연구중인 각 세포 유형에 대해 특별히 최적화되어야합니다. 인간 조혈 전구 세포, T 세포 및 표피 세포에 대한 세포 성장 및 형질 도입 조건은 문헌 7, 14, 15 및 17에 기재되어있다.
- 48 시간 후, 2 % 태아 소 혈청을 함유 한 인산염 완충 식염수 (PBS) 300 μL에 100,000 세포를 재현하고 f에 의해 eGFP 발현을 측정한다낮은 cytometric 분석 (488 nm의 여기 레이저). 모의 - 형질 전환 된 세포를 음성 대조군으로 사용하십시오. 최적의 통합 사이트 검색을 위해 Fluor....
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결과
레트로 바이러스 스캐닝 절차의 워크 플로우
레트로 바이러스 스캐닝 절차의 워크 플로가 그림 1 에 나와 있습니다. 표적 세포 집단을 정제하고 eGFP 리포터 유전자를 발현하는 mLV 유래 레트로 바이러스 벡터로 형질 감염시켰다. 형질 도입 유전자는 2 개의 동일한 긴 말단 반복 (5 '및 3'LTR)에 의해 둘러싸여 있으며, 합성, 역전사 및 바이러스 게놈의 숙주 DNA 내로의 통합을 보장한다. 형질 도입 효율은 eGFP 발현의 FACS 분석에 의해 평가된다. mLV - transduced 세포의 높은 비율 (> 30 %)을 포함하는 세포 인구가 증폭하고 통합 mLV 바이러스 카세트를 포함하는 게놈 DNA를 추출하기 위해 lysed. 게놈 .......
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토론
여기에서 우리는 염색질 부위를 표적으로하는 레트로 바이러스 인 mLV의 통합 사이트의 게놈 - 전체 매핑을위한 프로토콜을 설명했으며, 활성 프로모터 및 인핸서로 후생적으로 표시했습니다. 프로토콜의 중요한 단계 및 / 또는 한계는 다음을 포함합니다 : (i) 표적 세포 집단의 mLV 형질 도입; (ii) LM-PCR에 의한 바이러스 - 숙주 접합부의 증폭; (iii) 통합 사이트의 높은 비율의 검색. mLV- 기반 레트로 바이러스 벡터는 분열 세포를 효율적으로 형질 전환시킨다. 비분 할 세포 (예 : 사후 유사 분열 신경 세포)의 형질 도입 효율이 낮 으면이 기법의 잠재적 한계가됩니다. 그러나, 리포터 유전자 ( 예, eGFP)의 발현에 기초하여 형질 감염된 집단의 세포 분류를 통해 극복 될 수있다. LM-PCR (150 ~ 500 bp)에 의한 상대적으로 짧은 앰플 리콘의 생성은 현재 사용되는 방대한 시퀀싱 전략과 호환되는 앰플 리콘 라이브러리를 생성하고 포괄적 인 유전자를 허용하는 데 필수적입니다mLV 통합 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 이탈리아 교육, 대학 및 연구부 (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003)의 유럽 연구위원회 (ERC-2010-AdG, GT-SKIN) , EPIGEN Epigenomics 대표 프로젝트), 이탈리아 보건부 (젊은 연구자는 2011 GR-2011-02352026) 및 Imagine Institute Foundation (프랑스, 파리).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | 또는 동등한 |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | 또는 동등한 |
| 0.2 ml 튜브 | 일반 실험실 공급업체 | ||
| 1.5 ml 튜브 | 일반 실험실 공급업체 | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | 또는 동등한 |
| T4 DNA 리가제 | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA 리가제 반응 버퍼 | New England BioLabs | M0202T | |
| 링커 플러스 스트랜드 올리고뉴클레오티드 | 일반 실험실 공급업체 | 5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' (정화 등급: SDS-PAGE) | |
| 링커 마이너스 스트랜드 올리고뉴클레오티드 | 일반 실험실 공급 업체 | 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (정화 등급: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | 또는 동급의 |
| PCR 등급 물 | 일반 실험실 공급 업체 | ||
| 96-well thermal cycler (가열 뚜껑 포함) | 일반 실험실 공급 업체 | ||
| 링커 프라이머 | 일반 실험실 공급 업체 | 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (정제 등급 : PCR 등급) | |
| MLV-3' LTR 프라이머 | 일반 실험실 공급 업체 | 5 '-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3 ' (정제 등급 : PCR 등급) | |
| 링커 중첩 프라이머 454 | 일반 실험실 공급 업체 | 5'-GCCTTGCCAGCCCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](정제 등급: SDS-PAGE) | |
| MLV-3' LTR 중첩 프라이머 454 | 일반 실험실 공급 업체 | 5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](정제 등급: SDS-PAGE) | |
| 링커 중첩 프라이머 Illumina | 일반 실험실 공급업체 | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](정제 등급: SDS-PAGE) | |
| MLV-3' LTR 중첩 프라이머 Illumina | 일반 실험실 공급 업체 | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](정제 등급: SDS-PAGE) | |
| 아세트산 나트륨 용액(3M) pH 5.2 | 일반 실험실 공급업체 | ||
| 분자 생물학용 에탄올(절대) | Sigma-Aldrich | E7023 | 또는 동급 |
| Topo TA 클로닝 키트(pCR2.1-TOPO 벡터 포함) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick 젤 추출 키트 | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 또는 동등한 |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | 또는 동급 |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | 또는 동급 |
| 6x 로딩 버퍼 | , ThermoScientific | R0611 | 또는 동급 |
| NanoDrop 2000, UV-Vis 분광광도계 | , ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index 키트 | , Illumina | FC-131-1001 또는 FC-131-1002 | |
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| Dynal 2 ml 튜브용 마그네틱 스탠드 | Invitrogen | 12321D | 또는 동급 |
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| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | 일반 실험실 공급업체 | ||
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| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | 또는 동급 |
| D1000 시약 | Agilent Technologies | 5067-5583 | 또는 |
| 동급 Illumina 플랫폼용 KAPA 라이브러리 정량 키트(ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR 시스템 | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, 분자 생물학 등급 | 일반 실험실 공급업체 | ||
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| MiSeq 시약 키트 v3 (150 사이클) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq 시스템 | , Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
참고문헌
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet.
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재인쇄 및 허가
