높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

요약

여기, 선물이 효과적으로 상호 신경 통로 통해 방법 얼룩이 지기 형광으로 biotinylated dextran 아민 (BDA)를 공개 하는 세련 된 프로토콜. 그것은 미세 구조 분석 적합 BDA 라벨 및 다른 신경 요소 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 구별의.

초록

높은 분자량 biotinylated dextran 아민 (BDA)은 많은 십 년간 동안 매우 민감한 신경 해부학 추적 프로그램으로 사용 되었습니다. 이후 그 라벨의 품질은 여기, 다양 한 요인에 의해 영향을 제공 세련 된 프로토콜 높은 분자량 BDA의 응용 프로그램에 대 한 중앙 신경 시스템에 최적의 신경 라벨을 공부 합니다. 복 부 posteromedial 핵 (VPM)의 섬세 한 유리 피 펫을 통해 쥐에 시상에 BDA의 정위 적 주입 후 BDA 형광 streptavidin-알 렉 사 (AF) 594로 얼룩진 고 형광 Nissl 얼룩 AF500/525와 counterstained. 녹색 Nissl 얼룩의 배경, 빨간 BDA 라벨, 신경 셀 시체 및 axonal 터미널을 포함 하 여 더 분명히 somatosensory 피 질에서 시연 했다. 또한, BDA에 대 한 형광 염색을 두 번 및 칼슘 묶는 단백질 parvalbumin (PV) BDA 라벨 및 로컬 신경 공부 하는 기회를 제공 하는 대뇌 피 질의 대상에 태양광 발전-긍정적인 수의 상관 관계를 관찰 하기 위해 실시 되었다 회로 및 그들의 화학 특성 따라서,이 세련 된 방법은 고품질 신경 시상과 대뇌 피 질 사이의 상호 신경 경로 통해 높은 분자량 BDA로 머릿속에 적합 하지 않습니다 하지만 또한 동시 시범 허용 됩니다. 다른 신경 마커 형광 histochemistry 또는 immunochemistry입니다.

서론

높은 분자량 BDA (10000 분자량), 매우 민감한 트레이 서 20 년 이상의¹중추 신 경계에서에서 신경 경로 추적 사용 되었습니다. BDA의 사용은 일반적인 신경로 추적 기법, BDA 라벨의 품질 다양 한 요인^1,,23에 의해 동물에서 달라질 수 있습니다. 우리의 최근 연구 표시 BDA 라벨의 최적의 구조는 관련 된 적절 한 후 주입 생존 시간 뿐만 아니라 또한 착 색 방법⁴와 상관. 지금, 기존의 avidin 비타민 b 복합체 과산화 효소 복합물 (ABC), streptavidin fluorescein isothiocyanate streptavidin-AF594까지 착 방법은 이전의 연구^{2,3, BDA 라벨 공개에 대 한 사용 되었다 4,5}. 비교에서는, 형광 성 얼룩 BDA에 대 한 수행할 수 있습니다 쉽게.

높은 분자량 BDA의 응용 프로그램을 확장 하기 위하여 세련 된 프로토콜은 현재 연구에 도입 되었다. 쥐 뇌에서 시상의 VPM에 BDA의 주입, 따라 이중 형광 얼룩, BDA 라벨의 상관 관계를 관찰을 위해 실시 되었다 뿐만 아니라 표준 ABC 얼룩의 일반적인 방법으로 계시 고 기본 했다 BDA 라벨 신경 요소 또는 streptavidin AF594 및 형광 Nissl histochemistry 또는 PV-immunochemistry, 대뇌 피 질의 대상에 수 각각. VPM 기본 somatosensory 피 (S1)^6,,78사이 상호 신경 경로 통해 우리는 BDA 예상 thalamocortical 축 삭 및 corticothalamic에 라벨에 우리의 관찰 집중 s 1에서 예상된 셀 somas입니다. 이 과정에 의해 우리는 높은 분자 무게 BDA, 신경 라벨의 높은 품질을 얻기 위해 상세한 프로토콜 뿐만 아니라 다른 형광 신경 마커 및 형광 BDA 라벨의 조합에 세련 된 프로토콜을 제공할 것으로 예상 histochemistry 또는 immunochemistry입니다. 이 접근은 로컬 신경 회로 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 그들의 화학 특성을 공부 하는 것이 좋습니다.

프로토콜

이 연구 윤리 위원회에는 중국의 중국 의학 과학원 (참조 번호 20160014)에 의해 승인 되었다. 모든 절차는 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박, 워싱턴, D.C., 1996)에 대 한 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다. 4 성인 남성 쥐 (체중 250-280 g)이이 연구에 사용 되었다. 모든 동물에 12 h 명암 주기 제어 온도와 습도, 그리고 음식과 물에 자유 접근. 악기 및 현재 연구에 사용 된 자료 그림 1에 보였다 했다.  수술을 하기 전에 모든 장비 stereotaxic 프레임 및 유리 피 펫, 70% 에탄올을 사용 하 여 청소 했다.

1. 수술 절차

1. VPM stereotaxic 아틀라스⁹ (그림 2A)를 사용 하 여에 대 한 관심의 좌표 위치를 결정 합니다.
2. 1 µ L 마이크로-주사기 (약 10-20 µ m의 팁 직경)와 유리 제 micropipette 장착 준비 (그림 1D) 액체 파라핀으로 그것을 테스트.
3. 복 주입에 의해 7 %chloral 하이드 레이트 (0.7 mL/100 g)와 쥐를 anesthetize.
4. 깊은 마 취 확인 꼬리 핀치 철수 반사 페달, 전기 면도기와 동물의 머리의 면도 하 고 뒤 70% 에탄올에 각각 10 %povidone 요오드와 수술 부위의 3 번 스크럽.
5. 쥐 stereotaxic 장치에 무딘 귀 바 귀에 배치 하 여 고 입 홀더 (그림 1E)로 쥐의 위 앞 니를 장소 놓고 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
6. 70% 에탄올을 사용 하 여 다시 수술 부위의 머리 피부를 청소. 무 균 조건 하에서 수술을 유지 하기 위해 무 균 수술 장갑과 수건을 사용 합니다.
7. 화살 봉합 (그림 1 층)에 따라 메스로 피부에 절 개를 화살을 확인 합니다.
8. 근육과 살 균 면 밀고 도포를 사용 하 여 제어 출혈 (그림 1 층)을 수술을 통해 두개골에서과 다쳤어요.
9. 아틀라스 (그림 2A)에서 미리 정의 된 좌표를 사용 하 여 craniotomy (그림 1G)의 위치 (-3.3 m m Bregma 포인트, 2.6 m m 오른쪽 중간에) 결정 합니다.
10. Craniotomy 라운드 팁 비트 (#106) (그림 1 H)와 함께 버 드릴을 사용 하 여 수행 하 고 계속 meninges (그림 1I)에 도달할 때까지 몇 분 이내는 1 mm 깊이 대 한 드릴.
11. Dura mater 사출 사이트 (그림 1I)을 통해 대뇌 피 질을 노출 하는 microforceps를 사용 하 여 삭제하시오
12. 10 %BDA (10000 분자량, 증류수에) 솔루션 (그림 1J) 마이크로 주사기에 액체 파라핀을 변경 합니다.
13. Microinjection 장치에 주사기를 탑재 하 고 마이크로 펌프 (그림 1 K)와 연결 합니다.
    참고: 볼륨 주입 마이크로 펌프의 속도에 따라 달라 집니다. 여기 그것은 nL/30min (그림 1 L)에 조정 되었다.
14. stereomicroscope에서 5.8 m m (그림 1 M)의 깊이에서 뇌의 대뇌 피 질의 표면을 통해 VPM에 유리 제 micropipette microinjection 장치를 수동으로 삽입 합니다.
15. 압력 주입 100 10%의 nL 마이크로 펌프 (그림 1 L, M)와 3 분 (35 nL/min)의 기간 동안 VPM에 BDA.
16. 주입 후 추가 5 분을 위한 장소에 피펫으로 유지 하 고 천천히 철수 다음.
17. 무 균 실 (그림 1N) 상처 봉합 사전 및 수술 후 진통에 대 한 당신의 현지 동물 보호 위원회 지침을 따릅니다.
18. 의식 회복은 완 치 될 때까지 따뜻한 복구 영역에 쥐를 놓습니다.
19. 그것의 감 금 소를 다시 복구 된 쥐를 반환 합니다.

2. perfusions 및 섹션

1. 일반적으로 10 일의 생존 시간 후 안락사를 유도 복 주입 하 여 사용 10% 우 레 탄 (2 mL/100 g)의 과다와 동물을 주입.
2. (그림 1O) 후드에서 실험 쥐 perfuse
   1. 호흡 중지가 위, 집게를 사용 하 여 마음에 액세스 하는 쥐의 흉 강을 엽니다. 대동맥으로 좌 심 실에는 정 맥 카 테 터를 삽입 한 다음 오른쪽 auricle 엽니다.
   2. 먼저 perfuse 0.9% 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 생리 적인 온도 (37 ° C)와 약 1-2 분 혈액에서에서 종료 될 때까지의 선택을 취소 한 다음 0.1 M 인산 버퍼 (PB, pH 7.4)에 250-300 mL 4 %paraformaldehyde 계속.
3. 관류, 후 머리 피부를 incise 하 고, 두개골을 열고 쥐 뇌를 해 부. 후 해 부 뇌 실내 온도 (26 ℃), 0.1 m M PBS (pH 7.4) 두뇌 솔루션 (그림 1 P)에 몰입 될 때까지 4 ° C에서 3 일 동안에 30% 자당 다음 cryoprotect에서 2 h 4 %paraformaldehyde 수정.
4. 두뇌는 솔루션에 몰입은, 일단 뇌 매트릭스 (그림 1 분기)에 코로나 방향에 3 개의 블록으로 두뇌를 나눕니다. 중앙 블록 VPM와 s 1에 포함 되어 있습니다.
5. 톰 시스템 코로나 방향으로 슬라이딩 동결 단계에 40 µ m에서 뇌의 중앙 블록을 잘라. 이러한 섹션 (인물 1R, S) 0.1 M PBS (pH 7.4)를 가진 6-잘 접시에 질서를 수집 합니다.

3. 표준 ABC 얼룩

참고: 두뇌의 모든 세 번째 코로나 섹션에서 무료 부동 섹션 표준 ABC 절차¹⁰BDA 라벨 시각화 사용 되었다.

1. 약 1 분 동안 0.1 M PBS에 섹션 린스.
2. (PH 7.4) 포함 0.3%에서 0.1 M PB 1 %ABC 솔루션에서 섹션을 품 어 실 온에서 1 h에 대 한 트라이 톤 X-100.
3. 워시 50 m m Tris 버퍼 (pH 7.4)에 세 번 섹션.
4. 0.02 %3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (한 덩어리) 및 실 온에서 약 2-5 분 50 mM Tris 버퍼에 0.01% H₂O₂ 를 포함 하는 솔루션에 섹션을 얼룩.
5. 워시 50 m m Tris 버퍼 (pH 7.4)에 세 번 섹션.
6. 현미경 슬라이드 표준 조직화 학적인 기법 (1T 그림; 참조 추가 비디오 파일 III, 관류 및 섹션)를 사용 하 여 섹션을 탑재 합니다.
7. 건조 실 온에서 하룻밤 공기에 섹션.
8. 탈수 알코올 (50%, 70%, 95%, 100%) 솔루션의 일련에 간단히 섹션. 약 15 각 솔루션에 슬라이드 잠수함 s. 각 단계 사이 건조 슬라이드를 허용 하지 않습니다.
9. 크 실 렌에서 섹션 3 회, 약 20 분을 선택을 취소 합니다.
10. 조각에 봉 선화의 2 또는 3 방울을 넣어 다음 coverslips 섹션에 배치 합니다.

4. BDA 및 대뇌 피 질에 기본 신경 요소 더블 형광 성 얼룩

참고: 반면, 이중 형광 얼룩 실시 BDA 라벨의 상관 관계를 관찰에 대 한 위의 인접 섹션에 기본 신경 요소 streptavidin AF594와 함께 사용 하 고 형광 Nissl 얼룩 AF500/525와 counterstained.

1. 약 1 분 동안 0.1 M PBS에 섹션 린스.
2. (PH 7.4) 포함 0.3 %streptavidin-AF594 (1: 500) 및 0.1 M PBS에 AF500/525 녹색 형광 Nissl 얼룩 (1:1, 000)의 혼합 솔루션에서 섹션을 품 어 실 온에서 2 h에 대 한 트라이 톤 X-100.
3. 0.1 m M PB (pH 7.4)에 세 번 섹션을 씻어.
4. 현미경 슬라이드 표준 조직화 학적인 기술을 사용 하 여 섹션을 탑재 합니다. 약 1 h 공기에 섹션을 건조.
5. 관찰 하기 전에 증류수에 50% 글 리세 린과 형광 섹션에 coverslips를 적용 합니다.

5. 더블 형광 얼룩 BDA 및 대뇌 피 질에서 수

참고: 이중 형광 얼룩 BDA 라벨 및 streptavidin AF594와 태양광 발전-immunochemistry 대뇌 피 질의 대상에서 대표 섹션에 수의 상관 관계를 관찰 실시 했다.

1. 약 1 분 동안 0.1 M PBS (pH 7.4)에 대표 섹션 린스.
2. 차단 솔루션 3% 정상 염소 혈 청 0.3%를 포함 하는 섹션을 품 어 30 분 0.1 M PBS에 트라이 톤 X-100.
3. 전송 섹션 마우스 단일 클로 널 안티-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) 포함 1% 정상 염소 혈 청에 0.3%의 솔루션으로 4 ° c.에 하룻밤을 위해 트라이 톤 X-100
4. 다음 날, 0.1 m M PBS (pH 7.4)에 세 번 섹션을 씻어.
5. 염소 안티 mouse AF488 이차 항 체 (1: 500), 0.1 m M PBS (pH 7.4) 포함 1% 정상 염소 혈 청에서 streptavidin-AF594 (1: 500), 그리고 4' 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) 및 0.3의 혼합 솔루션 섹션 노출 % 트리톤 1 h X-100입니다.
6. 4.5 4.3 단계를 반복 합니다.

6입니다. 관찰

1. VPM, 축 삭 thalamocortical, 및 corticothalamic 신경의 이미지를 가져가 라.
   1. 목표 렌즈를 장착 하는 confocal 이미징 시스템으로 형광 샘플 관찰 (4 x, 나: 0.13; 10 x, 나: 0.40;와 40 x, 나: 0.95). 사용 하 여 405 (파랑), 488 (녹색)의 여기 및 방출 파장 및 559 (빨간색) nm.
      참고: 여기, confocal pinhole 152 µ m (4 배, 10 배)와 105 µ m (40 x)입니다. 이미지 캡처의 공간 해상도 1024 × 1024 픽셀 (4 배, 10 배) 및 640 × 640 픽셀 (40 x).
   2. 40 µ m (Z 시리즈)의 두께에 각 섹션에서 2 µ m의 연속 프레임에 20 이미지를 가져가 라.
   3. 다음과 같이 3 차원 분석을 위한 소프트웨어 시스템을 처리 하는 confocal 이미지와 단일-초점 이미지에 이미지를 통합: 설정된 시작 초점 평면 → 설정된 끝 초점면 → 설정된 단계 크기 → 선택 깊이 패턴 → 이미지 캡처 → Z 시리즈.
2. 디지털 카메라를 갖춘 가벼운 현미경에 의해 명시 이미지를 받아 (4 x, 나: 0.13; 10 x, 나: 0.40;와 40 x, 나: 0.95 렌즈). 노출 시간의 500 양 사용 사진 편집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 레이블 추가를.

결과

BDA는 VPM에 10 일 포스트 주입의 생존 강렬한 신경 라벨 해당 피 질 영역에 주입 쪽 (그림 2) 동측 생산에 대 한 충분 한 했다. 기존 ABC와 BDA에 대 한 절차를 얼룩이 지기 형광 공개 anterogradely를 포함 하 여 s 1에 신경 라벨의 비슷한 패턴 thalamocortical 축 삭을 표시 하 고 retrogradely corticothalamic 신경 (그림 2C, D를 표시 ).

축 삭을 표시 하는 anterogradely에 대 한 그들은 레이어 2에서에서 레이어 6 레이어 4에 높은 밀도로 관찰 했다 그리고 thalamocortical 축 삭의 전형적인 유형 배럴 영역 (

토론

적절 한 추적 프로그램을 선택 하는 성공적인 신경 추적 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. BDA, 높은 분자량 BDA의 가족에서 (10, 000 분자량) 저 분자 무게 BDA (분자량 3000)^2,3 달리 참가자 신경 통로 통해 우선적으로 수송 될 추천 ^{, 11 , 12 , 그러나 13}., 많은 연구는 또한 그 높은 분자량 BDA도 사용 될 수 있습니다 잠재적으로^1,2,3추적 참가자와 병렬로 역행 경로 추적에 대 한 제안 했다. VPM와 S1 간의 상호 신경 경로 통해 우리...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biotinylated dextran amine (BDA)	분자 프로브	D1956	10,000 분자량
Streptavidin-Alexa Fluor 594	분자 프로브	S32356	빛으로부터 보호
500/525 녹색 형광 Nissl 얼룩	분자 프로브	N21480	빛으로부터 보호
뇌 입체 택시 기기	Narishige	SR-50
냉동 마이크로톰	Thermo	Microm International GmbH
컨포칼 이미징	Olympus	FV1200
시스템
마이크로 드릴	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC 키트	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus 현미경 슬라이드	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
포토샵 및 일러스트	Adobe	CS5