높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

Summary

여기, 선물이 효과적으로 상호 신경 통로 통해 방법 얼룩이 지기 형광으로 biotinylated dextran 아민 (BDA)를 공개 하는 세련 된 프로토콜. 그것은 미세 구조 분석 적합 BDA 라벨 및 다른 신경 요소 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 구별의.

Abstract

높은 분자량 biotinylated dextran 아민 (BDA)은 많은 십 년간 동안 매우 민감한 신경 해부학 추적 프로그램으로 사용 되었습니다. 이후 그 라벨의 품질은 여기, 다양 한 요인에 의해 영향을 제공 세련 된 프로토콜 높은 분자량 BDA의 응용 프로그램에 대 한 중앙 신경 시스템에 최적의 신경 라벨을 공부 합니다. 복 부 posteromedial 핵 (VPM)의 섬세 한 유리 피 펫을 통해 쥐에 시상에 BDA의 정위 적 주입 후 BDA 형광 streptavidin-알 렉 사 (AF) 594로 얼룩진 고 형광 Nissl 얼룩 AF500/525와 counterstained. 녹색 Nissl 얼룩의 배경, 빨간 BDA 라벨, 신경 셀 시체 및 axonal 터미널을 포함 하 여 더 분명히 somatosensory 피 질에서 시연 했다. 또한, BDA에 대 한 형광 염색을 두 번 및 칼슘 묶는 단백질 parvalbumin (PV) BDA 라벨 및 로컬 신경 공부 하는 기회를 제공 하는 대뇌 피 질의 대상에 태양광 발전-긍정적인 수의 상관 관계를 관찰 하기 위해 실시 되었다 회로 및 그들의 화학 특성 따라서,이 세련 된 방법은 고품질 신경 시상과 대뇌 피 질 사이의 상호 신경 경로 통해 높은 분자량 BDA로 머릿속에 적합 하지 않습니다 하지만 또한 동시 시범 허용 됩니다. 다른 신경 마커 형광 histochemistry 또는 immunochemistry입니다.

Introduction

높은 분자량 BDA (10000 분자량), 매우 민감한 트레이 서 20 년 이상의¹중추 신 경계에서에서 신경 경로 추적 사용 되었습니다. BDA의 사용은 일반적인 신경로 추적 기법, BDA 라벨의 품질 다양 한 요인^1,,23에 의해 동물에서 달라질 수 있습니다. 우리의 최근 연구 표시 BDA 라벨의 최적의 구조는 관련 된 적절 한 후 주입 생존 시간 뿐만 아니라 또한 착 색 방법⁴와 상관. 지금, 기존의 avidin 비타민 b 복합체 과산화 효소 복합물 (ABC), streptavidin fluorescein isothiocyanate streptavidin-AF594까지 착 방법은 이전의 연구^{2,3, BDA 라벨 공개에 대 한 사용 되었다 4,5}. 비교에서는, 형광 성 얼룩 BDA에 대 한 수행할 수 있습니다 쉽....

Protocol

이 연구 윤리 위원회에는 중국의 중국 의학 과학원 (참조 번호 20160014)에 의해 승인 되었다. 모든 절차는 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박, 워싱턴, D.C., 1996)에 대 한 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 했다. 4 성인 남성 쥐 (체중 250-280 g)이이 연구에 사용 되었다. 모든 동물에 12 h 명암 주기 제어 온도와 습도, 그리고 음식과 물에 자유 접근. 악기 및 현재 연구에 사용 된 자료 그림 1에 보였다 했다.  수술을 하기 전에 모든 장비 stereotaxic 프레임 및 유리 피 펫, 70% 에탄올을 사용 하 여 청소 했다.

1. 수술 절차

1. VPM stereotaxic 아틀라스⁹ (그림 2A)를 사용 하 여에 대 한 관심의 좌표 위치를 결정 합니다.
2. 1 µ L 마이크로-주사기 (약 10-20 µ m의 팁 직경)와 유리 제 micropipette 장착 준비 (그림 1D) 액체 파라핀으로 그것을 테스트.
3. 복 주입에 의해 7 %chloral 하이드 ....

Results

BDA는 VPM에 10 일 포스트 주입의 생존 강렬한 신경 라벨 해당 피 질 영역에 주입 쪽 (그림 2) 동측 생산에 대 한 충분 한 했다. 기존 ABC와 BDA에 대 한 절차를 얼룩이 지기 형광 공개 anterogradely를 포함 하 여 s 1에 신경 라벨의 비슷한 패턴 thalamocortical 축 삭을 표시 하 고 retrogradely corticothalamic 신경 (그림 2C, D를 표시 ).

축 삭을 표시 하는 anterogradely에 대 한 그들은 레이어 2에서에서 레이어 6 레이어 4에 높은 밀도로 관찰 했다 그리고 thalamocortical 축 삭의 전형적인 유형 배럴 영역 (

Discussion

적절 한 추적 프로그램을 선택 하는 성공적인 신경 추적 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. BDA, 높은 분자량 BDA의 가족에서 (10, 000 분자량) 저 분자 무게 BDA (분자량 3000)^2,3 달리 참가자 신경 통로 통해 우선적으로 수송 될 추천 ^{, 11 , 12 , 그러나 13}., 많은 연구는 또한 그 높은 분자량 BDA도 사용 될 수 있습니다 잠재적으로^1,2,3추적 참가자와 병렬로 역행 경로 추적에 대 한 제안 했다. VPM와 S1 간의 상호 신경 경로 통해 우리.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotinylated dextran amine (BDA)	분자 프로브	D1956	10,000 분자량
Streptavidin-Alexa Fluor 594	분자 프로브	S32356	빛으로부터 보호
500/525 녹색 형광 Nissl 얼룩	분자 프로브	N21480	빛으로부터 보호
뇌 입체 택시 기기	Narishige	SR-50
냉동 마이크로톰	Thermo	Microm International GmbH
컨포칼 이미징	Olympus	FV1200
시스템
마이크로 드릴	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC 키트	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus 현미경 슬라이드	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
포토샵 및 일러스트	Adobe	CS5