주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

Summary

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

Abstract

3D 세포 배양에 전통적인 2D 셀 문화를 업그레이드 하려면 우리 cryogelation 기술로 3D microtissues를 형성 하기 위하여 세포 유형의 다양 한 적재 될 수 있다 macroporous 미 cryogels (microcryogels), 생산 소를 통합 했습니다. 여기, 우리는 다양 한 3D microtissues와 재생 치료와 약물 검사에 응용 프로그램을 조작 하는 프로토콜을 제시. 크기와 모양을 제어할 수 microcryogels 하거나 수 있는 수확된 칩 재생 주사 치료에 대 한 개별 셀 로드 사업자로 조립된 온-칩 높은 처리량에 대 한 3D microtissue 배열에 추가 되는 배열 칩에 날조 될 수 있다 의약품 심사입니다. 높은 탄성의 특성상 이러한 미 cryogels, 3D microtissues 주입 시 기계적 전단 힘에서 세포를 보호 하 여 최소 침 습 세포 치료에 대 한 큰 injectability를 전시 한다. 이 향상 된 세포 생존 및 마우스 사지 허 혈 모델에서 치료 효과 보장합니다. 한편, 3D microtissue 배열 표준 384-멀티-잘 형식에의 높은 처리량 약물이 다양 한 3D 셀 문화 플랫폼에 상영 활성화 일반적인 실험실 시설 및 장비, 사용 용이.

Introduction

문화 요리 등 다 잘 접시, 일반된 2 차원 (2D) 표면에 전통적인 세포 배양 수 거의 그들의 원시 상태에 가까운 셀 동작을 유도 했다. 다양 한 세포 유형, 세포 외 매트릭스 및 3 차원 (3D) 아키텍처^{1,2,3 에에서 생리 활성 성 요인의 구성 하는 기본 세포 microenvironments의 정확한 재현 부 4}, biomimicking 조직에서을 체 외에서 조직 공학, 재생 의학, 응용 프로그램 생성에 필수적 이다 기본적인 생물학 연구 및 약물 검색^{5,6,7 ,,89}.

2 차원 세포 배양, 대신 3D 세포 배양은 널리 biomimetic 마이크로 건축을 이용 하 고 생체 외에서배양 세포의 기능적 특징. 인기 있는 3 차원 셀 문화 방법은 spheroids^7,,89,10로 집계 셀 것 이다. 세포질 spheroids 향상 된 세포 보존 및 분산 된 세포의 주입에 비해 생존 부상된 조직에 주입 수 있습니다. 그러나, 비균일 회전 타원 체 크기와 세포에 주입 하는 동안 유체 전단 힘에 의해 부과 하는 피할 수 없는 기계 부상 이어질 가난한 셀 치료 효과^11,,1213. 마찬가지로, spheroids의 집계 하는 동안 고유의 비 균일 그들의 번역을 3D 셀 기반 높은 처리량 마약 도전¹⁰상영을 했다.

3D 세포 배양에 대 한 또 다른 방법은 일반적으로 수성 hydrogels 또는 다공성 건설 기계 셀을 캡슐화 바이오의 도움으로 이루어집니다. 그것은 3D 아키텍처를 구축에 더 큰 융통성을 허용 한다. 치료, 세포 대량 건설 기계에는 침략 적 이며 외상, 머리 맡에는 다양 한 번역을 따라서 제한 수술 주입을 통해 동물의 시체에 보통 전달 된다. 다른 한편으로, 수성 hydrogels 제자리에서 겔 화 온도-, 화학 또는 효소 가교¹¹를 통해 수 있도록 동물 시체로 히드로 전조 솔루션에 정지 세포를 주입 하 여 최소 침 습 치료를 사용 합니다. 그러나, 셀 하이드로 겔 선구자 수성 상태에 아직도 있는 하는 동안 전달 됩니다, 그들은 또한 노출 됩니다 기계적 전단에 주입 하는 동안. 만 그리 하이드로 겔의 겔 화 현장에서 중 화학 또는 효소 가교 내 세포에 손상을 부과 또한 수 있습니다. 약물 검사에 대 한 소재를 이용한 세포 배양 균일성, 제어력 및 처리량 문제를 얼굴. Hydrogels 사용 하 여, 세포는 일반적으로 참여 겔 화, 동안는 프로세스 영향을 미칠 수 세포 생존 능력 및 기능. 셀 시드 동안 겔 화 또한 저해 사용 대부분 높은 처리량 장비는 히드로 셀 시드 전에 겔 화를 방지 하기 위해 얼음에 보관 해야 할 수 있기 때문에 히드로 정확도 보장 하기 위해 일반적으로 매우 얇은 분배 팁 잼 수 있습니다. 높은 처리량 심사입니다. 그러나 미리 형성 된 건설 기계 수 잠재적으로 별도 소재 제조 절차 세포 배양에서 가장 비 계 기반 제품은 상대적으로 낮은 처리량¹⁴대량 자료로 사용할 수 있습니다.

현재 3D 문화 방법의 단점 들을 극복 하기 위해 상용 하 고 사용자 친화적인 microcryogel 배열 칩¹⁵조작 하 소-cryogelation 통합 기술을 개발 했습니다. 이 프로토콜에 젤라틴으로 생체, 분해성, 비용, 추가 수정에 필요한 및 셀 첨부 파일 microcryogel 제조 기법을 예증 선택 합니다. 천연 또는 합성 근원의 다른 고분자 어플리케이션 제작을 위해 사용 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 소형 및 높은 탄력 있는 microcryogels 제어 크기, 모양 및 레이아웃을 조작 수 있습니다. 다양 한 세포 유형으로 로드 될 때 3D microtissues 다양 한 응용 프로그램에 대 한 형성 될 수 있습니다. 이러한 독특한 기능은 가능 원하는 injectability, 셀 보호 및 보존 사이트 감독 주입에서 vivo에서 향상 된 치료 효과 대 한 후 만 그리는 microcryogels 일반적인 실험실 장비 및 다양 한 마약 검사 및 다른 세포질 분석 실험에 대 한 높은-처리량 셀 문화를 실현 하기 위해 악기와 호환 되는 3D microtissue 어레이를 더 처리할 수 수 없습니다. 여기, 우리 microcryogels과 개별 3D microtissues 또는 두 가지 중요 한 응용 프로그램, 세포 치료 및 의약품 심사, 각각^{10,15 3D microtissue 배열 후 치료의 제작 과정을 자세히 한다} .

Protocol

동물 실험 동물 윤리 위원회에 센터의 생물 분석, 칭화 대학에 의해 찬성 하는 엄격한 프로토콜을 따 랐 다. 윤리 위원회의 승인 아래 인간 지방 조직에서 환자 동의와 부의 성형 수술의 북경 연합 병원에서 얻은 했다.

1. 3D Microcryogels의 제조

1. microstencil 배열 칩의 설계 및 제조
   1. 디자인 배열 특정 형상, 원 등의 상용 소프트웨어를 사용 하 여 타원, 삼각형 또는 클로버 ¹⁴, 후속 응용 프로그램에 따라.
      참고: 재생 의학에 대 한 프로토콜 섹션 2 참조 하 고 섹션 디자인 세부 사항에 대 한 마약 검사에 대 한 프로토콜의 3.
   2. 는 레이저 레이저 조각 기계를 동반 하는 소프트웨어를 조각으로 디자인을 가져옵니다. 레이저 조각 기계에 대 한 공장 권장 사항에 따라 레이저 설정을 사용 하 여 레이저-오목 폴 리 (methymethacrylate) (PMMA)에 가져온된 디자인 시트.
   3. 는 Microstencil 배열 칩 레이저 조각에서 청결 한 파편에 이온을 제거 된 물으로 씻는 다. 건조 microstencil 배열 칩 실내 온도에 봉인된 된 봉투에 60 ° c.가 게에서 개월.
2. Microcryogel 배열 칩의 제조
   1. 장소 4 microstencil 샘플 쟁반에 칩을 배열 하 고 청소기 플라스마로 삽입. 청소기의 문을 닫고 하 고 2 분 동안 진공 펌프를 켜고 다음 최대 RF 전력 화란 증가를 실 온에서 3 분 동안 플라스마에 microstencil 배열 칩 청소기 치료 (18 승)에.
   2. 추가 0.06 g 젤라틴 형태로 1 mL 이온된 물 6% (wt/vol) 젤라틴 전조 솔루션 (만들 정도로 5 칩). 따뜻한 물 목욕을 적절 하 게 해산에 60 ° C에서. 5 분 ice에 품 어
   3. 추가 3 µ L의 0.3%의 최종 농도에 젤라틴 전조 솔루션으로도. 철저 하 게 혼합.
   4. 피펫은 200 µ L 전조 솔루션 microstencil 어레이 칩의 상부 표면에 글.
      참고: 200 µ L 75 m m × 25 m m 칩 디자인에 대 한 충분 하다. 칩의 표면 영역을 증가 하는 경우 금액을 비례 증가.
   5. 수동으로 균등 솔루션 칩에 다시 된다고 하 여 앞뒤로 구부러진된 유리 막대와 2 ~ 3 회.
      참고: 각 마이크로-microstencil 칩에 잘 채워질 수 있다 그들의 친수성 특성상 전조 솔루션 플라즈마 처리 후.
   6. 즉시 선구자-솔루션-채워진 어레이 칩 cryogelation에 대 한 16 h-20 ° C 냉장고에 배치.
   7. 조정 30 분-40 ° C에 lyophilizer 배열 칩은 lyophilizer에서 cryogelation 후 고 진공 상태에서 2 시간에 대 한 배열 칩 lyophilize.
      참고: 상호 macropores와 젤라틴 microcryogels는 lyophilizer에서 cryogelation sublimes 동안 얼음 형성 때문에 형성 된다.
   8. 중요 한 사지 허 혈 (CLI)의 처리를 위한 2 섹션 3 높은 처리량 마약 검사에 대 한 섹션을 진행.

2. CLI의 치료에 대 한 개별 Microcryogels 양식을 주사 3D Microtissues 수확

1. 수확 개별 microcryogels
   1. 디자인에 각각 400 µ m 직경, 600 원의 (75 m m × 25 m m) 배열 주 사용 3D microtissue 건설에 대 한 상용 소프트웨어입니다. 에 섹션 1.1 microstencil 어레이 칩의 제작을 위해 300 µ m 두께의 아크릴을 사용 하 여.
   2. 섹션 1.2에서 microcryogel 배열 칩 조작.
   3. 단계 2.1.1 표준 소프트 리소 그래피 ^{16 ,} 하 여 ¹⁷에서 동일한 디자인을 가진 PDMS 이젝터 핀 배열 조작.
   4. 오버레이 PDMS 이젝터 핀 배열, 정렬 배열에 이젝터 핀 각 microcryogel 위에 microcryogel 어레이 칩. Microcryogel 배열 칩 개별 microcryogels 수확 PDMS 이젝터 핀 배열에 튀어나온 핀 microwells에서 microcryogels를 밀어 이젝터 핀 배열 쪽으로 누릅니다.
   5. 물으로는 microcryogel을 수확 하 고 세포 멤브레인의 도움으로 그들을 수집 합니다. 한 스 트레이너를 사용 하 여 하나의 칩 (즉, 600 microcryogels)에서 microcryogels 수집.
   6. 워시 microcryogels uncross-연결 된 알데하이드 잔류물을 풀기 위해 20 분 동안 얼음에 0.1 m M NaBH ₄. 칩 당 0.1 M NaBH ₄의 5 mL을 사용 합니다. NaBH ₄를 삭제 하 고 각 시간 3 ~ 5 번, 15 분 동안 5 mL 이온을 제거 된 물으로 씻어.
   7. 셀 여과기에서 물 삭제 및 셀 여과기 당 하나의 클러스터로 microcryogels를 수집 하 고 곡선된 족집게를 사용 하 여 한 35 mm 페 트리 접시에 하나의 클러스터를 배치. 50-70 µ L 이온된 각 클러스터에 물 및 페 트리 접시의 뚜껑을 커버를 추가 합니다. 아무 microcryogels 페 트리 접시의 표면에 microcryogels의 단층을 형성 하는 또 다른 microcryogel 위에 누워 있도록 모든 microcryogels, 밖으로 단계로 탁상에 페 트리 접시를 부드럽게 누릅니다.
   8. 2 h (단계 1.2.7 참조)에 대 한 그들을 lyophilizing 하기 전에 4 ~ 16 h-20 ° C에서 수확된 microcryogels를 고정 합니다. 추가 사용 때까지 실 온에서 진공 상태에서 microcryogels 저장.
2. Microcryogels의
   1. 전자 현미경 (SEM) 이미지를 스캔 하 여 평가 하는 microcryogels의 숨 구멍.
   2. Immobilize 더블 측면 접착 테이프와 90 스퍼터 coater 골드와 코트 샘플 홀더에 수확 하 고 동결 건조 된 microcryogels
      s, SEM ¹¹ 이미징 하기 전에. 평가 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 7 다른 SEM 이미지에서 microcryogel에 있는 숨 구멍의 직경의 분포 분석.
   3. 말린된 젤라틴 microcryogels (GMs)의 무게에 대 한 35 mm 페 트리 접시에 600 동결 건조 된 microcryogels에의 한 클러스터를 무게. 60 µ L 이온된 물 동결 건조 된 microcryogels의 클러스터에 추가 하 고 30까지 기다리는 완전히 물을 흡수 하 고 팽창 하는 microcryogels에 대 한 s. 무게 부 microcryogels.
      1. 결정 평형 팽 윤 비와 건조 젤라틴 microcryogels과 수 화 microcryogels의 microcryogels에서 개최 물의 무게의 비율을 부 어 microcryogels의 무게의 비율으로 microcryogels의 다공성 각각 ¹³.
   4. 디지털 힘으로 통합 하는 프로그래밍 가능한 주사기 펌프를 사용 하 여 microcryogels의 측정 injectability ¹⁴ 게이지. Trypan에 의해 microcryogels의
      1. 얼룩 600 조각 블루 그리고 균질 배포를 달성 하기 위해 600 µ L 15% 젤라틴 해결책에서 중단 했다. 1 mL microcryogel 현 탁 액 1 mL 주사기에 로드 합니다. 1 mL/분의 유량에서 프로그래밍 가능한 주사기 펌프를 사용 하 여 1 mL 주사기에 부착 된 27 게이지 바늘을 통해 혼합물을 주사
      2. 모니터 실시간 주입 힘 디지털 힘에 의해 테스트 게이지 그리고 힘-시간 곡선을 플롯. 주입 후 관찰 현미경 microcryogels의 무결성.
         참고: GMs 15% (wt/vol) 젤라틴 솔루션에 원활 하 게 주입 하 고 수 주입 후 그대로 남아.
   5. Microcryogels의 분해성 특징.
      1. 먼저, 건조 중량으로 35 mm 페 트리 접시에 600 동결 건조 된 microcryogels에의 한 클러스터의 무게를 측정. 다음, 담가 2 mL 0.025% (vol/vol) 트립 신/EDTA에에서 600 동결 건조 된 microcryogels.
      다른 시간 지점에서 셀 스 트레이너를 사용 하 여 솔루션에서
      2. 수집 microcryogels (즉, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 그리고 70 분). 심지는 조직으로 멀리 초과 솔루션. 다른 시간 지점에서 microcryogels의 무게를 측정 하 고 특정 시점 시간 시간 0에서 microcryogel의 microcryogel의 무게의 비율으로 저하도 계산.
3. Autoloading 양식 3D microtissues microcryogels로 셀의
   1. vac에서 12 h degassing 뒤 에틸렌 산화 살 균 시스템 12 h 가스 노출에 의해 단계의 2.1.8 microcryogels 소독uum.
   2. 는 마우스 허 혈 성 hindlimb의 처리를 위한 인간 지방이 많은 파생 mesenchymal stromal 세포 (hMSCs)을 선택합니다. 다음 절차에 의해 격리 셀 이전 보고 ¹⁸.
   3. 성장에 문화 hMSCs 매체 포함 하는 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF), 10 ng/mL 혈소판 유래 성장 인자 bb (PDGF-bb), 인슐린 처리가 셀레늄 (ITS) X 1, 10 ^-8 M dexamethasone, 10 ^-4 M ascorbic 산 2 인산, 100 U/mL 페니실린과 DMEM/F12에서 100 µ g/mL 스. 때 confluent 1: 3의 비율로 셀 통로 다음 실험에 통과 3 ~ 5 셀을 사용 하 여.
   4. Trypsin으로 hMSCs을 수확 하 고 계량 Fuchs 로젠 탈 세 챔버를 사용 하 여 셀 번호 8 x 10 ⁶ 셀/mL hMSCs 성장 매체에서의 밀도를 resuspend.
   5. 400의 직경이 600 microcryogels의 단층에 피펫으로 60 µ L hMSCs 정지 섹션 2.1에서에서 35 mm 접시에 µ m. 세포는 microcryogels의 다공성 마이크로 구조에 자동으로 흡수 됩니다.
   6. 습도 챔버에 유지와 연결할 셀 수 있도록 2 h 37 ° C에서 품 어. 외피의 2 시간 후 2 mL 문화 매체를 추가 합니다. 매체 매 2 일 변경. HMSCs 로드 microcryogels 3D microtissues를 2 일 동안 문화.
   7. 후 2 일 경작, 96 잘 접시에 잘 당 100 hMSCs 로드 microcryogels 플라스틱, resazurin 작업 솔루션 제조 업체에 따라 준비의 120 µ L를 추가 ' 각 우물에 s 명령. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 590의 560 nm 및 방출 빛 파장의 여기 광 파장 microplate 리더에서 실행 가능한 세포 대사 resazurin의
      1. 검색 형광 nm. 표준 곡선 보간 키트 프로토콜 ¹³에 따라 미래 실험을 위한 형광 강도에서 휴대폰 번호를 hMSCs를 사용 하 여 형광 대 휴대폰 번호의 설정.
   8. Resazurin를 사용 하 여 4에 설명 된 대로 단계 4 데 하루 0에서에서 2.3.7 하루 하루 0에서에서 microcryogels에 hMSCs의 수 평가.
   9. 셀 microcryogels Calcein 오전의 1: 500 희석 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 Propidium 요오드 화물 (라이브/죽은 얼룩으로 알려진)의 1: 250 희석에에서 얼룩 및 형광 현미경 또는 공초점 형광 현미경 관찰.
4. 3D microtissues에 vivo에서 CLI 마우스 모델에서의 치료를 위해 주사
   1. 보고 ^{11 ,}로 중요 한 hindlimb 허 혈 여성 BALB/c 누드 마우스의 설정 3D microtissue에 기초를 둔 치료의 치료 효과 결정 하기 위해 ¹⁹.
   2. 단계의 2.3.6 5 mL 피 펫을 사용 하 여 셀 스 트레이너에 있는 microtissues를 전송 하 고 문화 매체를 멀리 필터링.
   3. 100 µ L 솔루션 당 100 microcryogels의 밀도에서 15% 젤라틴 용액에서 hMSCs 로드 3D microtissues resuspend.
   4. 수술 전에 압력솥에 의해 수술 도구를 소독 하 고 동물 시설 센터에 동물 수술 실에서 수술을 수행.
   5. 1-3 %isoflurane 적용 건조 방지 하기 위해 마우스의 눈에 리스로 마이 신 1 L/분의 유량에서 100% 산소에서를 포함 하는 마 취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 1 cm 긴 피부 절 개를 통해 선 대 퇴 동맥 및 그것의 분 지 5-10 실크 봉합 하 고 소비 세 ¹⁹.
   혈액의 흐름을 모니터링 하는
   6. 넣기 indocyanine 녹색 (ICG) (100 µ g/mL 0.1 mL) 꼬리 정 맥을 통해 주입 ICG 형광 이미징 형광 이미징 시스템을 사용 하 여 수행 (여기, 수 제 시스템) 반사율 형상 ¹¹.
   7. 피하 주입 동맥 절 개 23 게이지 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 주위 gracilis 근육의 3 개의 사이트 microtissues.
   8. 수술 후 따뜻하게 마우스 온수 패드와 함께 복구 장에. 통증을 완화 하 고 깨어 때까지 계속 모니터 meloxicam 피하 주사.
   9. 후 28 일, 형광 이미징 ¹¹ 여 3D microtissue 치료 다리의 치료 효능을 모니터링.
      참고: 마우스 자발적인 사지 절단 때 통증을 완화 하 meloxicam 피하 주사.
   10. 실험의 완료 후 이산화탄소와 Euthanize 쥐.
       참고: 여기, 이산화탄소로 안락사 수행 되었다 동물 윤리 위원회에 센터의 생물 분석, 칭화 대학에 의해 찬성 하는 엄격한 프로토콜에 따라.

3. 높은 처리량 마약 검사에 대 한 Microtissue 어레이 칩의 조립

1. 칩에 세포 배양에 대 한 microcryogel 배열의 어셈블리
   1. 수정 섹션 1.1 기존의 멀티 잘 접시 크기에 따라 디자인 즉, 384-멀티-잘 형식에 대 한 디자인 다양 한 16 × 24 웰 스 (행 열), 2 mm 직경 및 4.5 m m 센터-센터 간격의 각.
   2. 1.1 섹션에 설명 된 대로 500 µ m 두께 PMMA 시트에 레이저는 새긴다.
   3. Fabricate microcryogels 섹션 1.2 384-멀티-잘 배열 칩에서 얻은 사용에 설명 된 대로 3.1.2 단계. 이 포함 하는 microcryogel 배열 microcryogel 어레이 칩으로 지정 됩니다.
   4. Microcryogel 어레이 칩을 씻고 50 mL의 0.1 M NaBH ₄ 어떤 잔여 알데하이드를 끄다 uncross-연결, 다음 반복 해 서 물으로 헹 구 50 mL 이온된 3 회, 2 시간에 대 한 각 시간.
   5. 물, 4 ~ 16 h-20 ° C에서 microcryogel 어레이 칩 단계 1.2.7 따라 lyophilizing 전에 동결.
   6. 16 × 24 포함 단계 3.1.1에서에서 수정 384-멀티-잘 배열 디자인 우물, 3 m m 직경 및 4.5 m m 센터-센터 간격의 각.
   7. 초박형 (10 µ m) 생체 양면 접착 테이프의 시트에서 지지의 한쪽을 제거 하 고 조각 3 mm 두께 PMMA 시트의 1 개의 측에 그것을 붙여. 레이저는 단계의 3.1.4 섹션 1.1에 따라이 3 mm 두께 PMMA 시트에 설계를 새긴다. 이 배열은 저수지 배열로 지정 됩니다.
   8. 맞춤 microcryogel 배열 저수지 어레이 칩과 칩과 함께 준수 단단히 칩에 세포 배양에 대 한 3D microcryogel 어레이 칩을 조립 하는 것. 1 헤에 대 한 자외선 방사선에 의해 소독
   9. 저장소 차원 microcryogel 배열을 추가 실험을 위한 실내 온도에서 진공에서 칩.
2. 마약 3D microtissue 배열에 상영
   1. 세포 배양을 위한 습도 챔버로 25 mL 무 균 드 이온된 물으로 젖은 상자를 채우기. 사전 열 습도 5% CO ₂ 배양 기 37 ° c.
   2. 비 작은 세포 폐 암 세포 (NCI H460) 및 간세포 암 종 세포 (HepG2) 표준 프로토콜에 따라 조직 배양 배지에서 수확 하 고 다시 10 ⁶ 셀/mL x 1.0의 최종 밀도에 문화 미디어 일시 중지. 철저 하 게 혼합.
      참고: 10% FBS 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 RPM1640 NCI H460 사용 됩니다. 10% FBS 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 HepG2 DMEM 사용.
   3. 는 인큐베이터에서 습도 챔버를 제거합니다. 3.1.9 습도 챔버에 단계에서 신중 하 게 장소 조립된 3D microcryogel 어레이 칩을 핀셋을 사용 합니다. Microcryogels 챔버에 물 젖은 않기로 주의.
   4. 혼합 세포 현 탁 액 각 우물에 microcryogel에 직접 세포 현 탁 액의 철저 하 게, 다음 aliquot 3 µ L.
      참고: 피 펫 팁 해야 가볍게 터치는 microcryogel의 표면 세포 현 탁 액을 추방 하기 전에. 흡수에 의해 microcryogel에 자동 로드 됩니다. 주변 스에서 셀 씨 하지 마십시오.
   5. 각 잘 세포는 96 채널 액체 처리기 같은 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 microcryogel으로 시드를 미디어의 추가 10 μ. 매체는 주변 웰 스에도 추가 됩니다.
      참고: 사용 RPM1640 미디어와 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린 100 µ g/mL streptomyciH460 셀에 대 한 n입니다. 10% FBS 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 DMEM 미디어를 사용 하 여 HepaG2 셀.
   6. 문화 셀 로드 microcryogel 배열 습도 5%에서 24 h 습도 챔버에 칩 형태로 3D microtissue 배열에 37 ° C에서 CO ₂ 인큐베이터.
   7. 분해 독 소 루비 그리고 IMMLG-8439 ⁹ 디 메 틸 sulfoxide 10 m m 재고 솔루션 (DMSO). 2에서 10 희석 농도 기온 변화도를 문화 매체와 약물을 희석 nM ~ 200 µ M.
   8. 각 마약 솔루션의 추가 10 µ L 음. (중간에 희석) 0.1 %DMSO 사용 하 여 제어. 습도 5%에서 약물 로드 3D microtissue 배열 품 어 24 h. 위해 37 ° C에서 CO ₂ 인큐베이터
   9. 각 잘 resazurin 재고 솔루션의 추가 4 µ L. 2 헤 장소 3D microtissue 배열 microplate 리더에서 37 ° C에서 품 어와 590의 560 nm 및 방출 빛 파장의 여기 광 파장에서 실행 가능한 세포 대사 resazurin의 형광을 검출 nm.
   10. 추가 데이터 처리 하기 전에 모든 우물에서 resazurin 기준 신호를 뺍니다. 제어 우물의 평균 형광 신호에 의해 형광 신호를 분할 하 여 각의 세포 생존 분수 계산.
   11. Y 축과 x 축으로 약물 농도의 밑수 10으로 세포 생존 분수와 함께 그리기 소프트웨어에 복용량 응답 곡선을 플롯. 0.5의 세포 생존 능력 부분에서 50% 금지 농도 (IC50) 보간.

Results

제조 그리고 3D microtissue 형성에 대 한 microcryogels의 특성.

이 프로토콜에 따라 microcryogels 형태로 3D microtissues 및 개별 microcryogels 또는 microcryogel 배열 조작 했다 고 재생 치료와 약물 검사, 각각 (그림 1)에 적용 했다. Microstencil 배열 칩 PMMA에서 조작 microcryogel 어레이 칩에 대 한 micromolds로 적용 되었다. 가변 기하학적 디자인 microstencil 어레이 칩에 대 한 준비 수 있습니다. 우리는 예를 들어, (즉, 원, 타원, 삼각형 및 클로버) 다양 한 형태와 다양 한 크기와 원형 microstencil 어레이 칩 포함 대표 45 x 1...

Discussion

마약 검사에 대 한 재생 의학 및 생체 외에서 모델은 조직 공학^5,6,7,,89에 대 한 두 가지 중요 한 응용 프로그램입니다. 이러한 두 응용 프로그램을가지고 있지만 다른 요구, 그들 사이의 공통 분모를 셀 기능¹⁹를 향상 시키기 위해 더 많은 biomimetic 경작 조건에 대 한 필요에 있다. 만 향상 된 세포 기능 연구에서 질병 더 나은^20,21, 취급 수와 배양된 세포 약물 응답 더 정확 하 게 반영 하는 경우 우리가 마약 발견⁶

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
젤라틴	시그마	G7041	다른 모든 시약은 달리 표시되지 않는 한 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다.
글루타르알데히드	제이앤드 K	902042	재료의 제조에서 가교제로 사용됩니다.
유리 커버 슬립 (24 x 50 mm)	CITOGLASS, 중국	10212450C	마이크로 스텐실 어레이 칩에 prcursor 용액을 긁어 넣습니다.
나트륨  borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	겔화 후 남아있는 글루타르알데히드를 씻어냅니다.
진공 항아리	asperts, 중국	VC8130	진공 상태에서 마이크로 젤을 보존합니다.
폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 시트	Sunjin Electronics Co., Ltd, 중국		일반 PMMA 시트.
Rayjet 레이저 시스템	Rayjet, 호주	Rayjet 50 C30	PMMA 시트를 조각하여 우물을 형성합니다.
플라즈마 클리너	Mycro Technologies, 미국	PDC-32G	PMMA를 최면으로 만듭니다.
동결 건조기	Boyikang, 중국	SC21CL	재료를 동결 건조합니다.
Trypan Blue 용액 (0.4 %)	Zhongkekeao, 중국	DA0065	마이크로 젤을 염색합니다.
독소루비신 염산염	에너지 화학, 중국	A01E0801360010	2D 또는 3D 마이크로겔에서 세포의 약물 내성을 테스트합니다.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies(일본 구마모토)	CS01-10	살아있는 세포와 죽은 세포를 구별합니다.
Cell Titer-Blue	Promega (미국 위스콘신).	G8080	세포 생존력을 테스트합니다.
세포 여과기	BD Biosciences, USA	352360	마이크로겔을 수집하기 위해.
D-Luciferin	SYNCHEM (독일)	s039	세포를 압정합니다.
주사 전자 현미경	FEI, 미국	Quanta 200	마이크로겔 형태를 특성화합니다.
기계 시험기	Bose, USA	3230	기계적 특징을 측정합니다.
프로그래밍 가능한 주사기 펌프	World Precision Instruments, 미국	ALADINI 1000	injactabiliy를 테스트합니다.
디지털 포스 게이지	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., 중국	H-50	injactabiliy를 테스트하기 위해.
에틸렌 옥사이드 살균 시스템	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	에틸렌 옥사이드 가스로 마이크로 젤을 살균합니다.
Microplate reader	Molecular Devices, USA	M5	마이크로 어레이에서 형광 강도를 측정합니다.
컨포칼 현미경	Nikon, Japan	A1Rsi	세포 분포를 3D로 관찰합니다.
제노젠  Lumina II 이미징 시스템	Caliper Life Sciences, 미국	IVIS	동물의 세포를 추적합니다.
액체 일 stataion	살구 디자인, 미국	S 피펫	매체 또는 세포 현탁액을 high-throuputly를 적재하기 위하여.