주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

요약

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

초록

3D 세포 배양에 전통적인 2D 셀 문화를 업그레이드 하려면 우리 cryogelation 기술로 3D microtissues를 형성 하기 위하여 세포 유형의 다양 한 적재 될 수 있다 macroporous 미 cryogels (microcryogels), 생산 소를 통합 했습니다. 여기, 우리는 다양 한 3D microtissues와 재생 치료와 약물 검사에 응용 프로그램을 조작 하는 프로토콜을 제시. 크기와 모양을 제어할 수 microcryogels 하거나 수 있는 수확된 칩 재생 주사 치료에 대 한 개별 셀 로드 사업자로 조립된 온-칩 높은 처리량에 대 한 3D microtissue 배열에 추가 되는 배열 칩에 날조 될 수 있다 의약품 심사입니다. 높은 탄성의 특성상 이러한 미 cryogels, 3D microtissues 주입 시 기계적 전단 힘에서 세포를 보호 하 여 최소 침 습 세포 치료에 대 한 큰 injectability를 전시 한다. 이 향상 된 세포 생존 및 마우스 사지 허 혈 모델에서 치료 효과 보장합니다. 한편, 3D microtissue 배열 표준 384-멀티-잘 형식에의 높은 처리량 약물이 다양 한 3D 셀 문화 플랫폼에 상영 활성화 일반적인 실험실 시설 및 장비, 사용 용이.

서론

문화 요리 등 다 잘 접시, 일반된 2 차원 (2D) 표면에 전통적인 세포 배양 수 거의 그들의 원시 상태에 가까운 셀 동작을 유도 했다. 다양 한 세포 유형, 세포 외 매트릭스 및 3 차원 (3D) 아키텍처^{1,2,3 에에서 생리 활성 성 요인의 구성 하는 기본 세포 microenvironments의 정확한 재현 부 4}, biomimicking 조직에서을 체 외에서 조직 공학, 재생 의학, 응용 프로그램 생성에 필수적 이다 기본적인 생물학 연구 및 약물 검색^{5,6,7 ,,89}.

2 차원 세포 배양, 대신 3D 세포 배양은 널리 biomimetic 마이크로 건축을 이용 하 고 생체 외에서배양 세....

프로토콜

동물 실험 동물 윤리 위원회에 센터의 생물 분석, 칭화 대학에 의해 찬성 하는 엄격한 프로토콜을 따 랐 다. 윤리 위원회의 승인 아래 인간 지방 조직에서 환자 동의와 부의 성형 수술의 북경 연합 병원에서 얻은 했다.

1. 3D Microcryogels의 제조

1. microstencil 배열 칩의 설계 및 제조
   1. 디자인 배열 특정 형상, 원 등의 상용 소프트웨어를 사용 하 여 타원, 삼각형 또는 클로버 ¹⁴, 후속 응용 프로그램에 따라.
      참고: 재생 의학에 대 한 프로토콜 섹션 2 참조 하 고 섹션 디자인 세부 사항에 대 한 마약 검사에 대 한 프로토콜의 3.
   2. 는 레이저 레이저 조각 기계를 동반 하는 소프트웨어를 조각으로 디자인을 가져옵니다. 레이저 조각 기계에 대 한 공장 권장 사항에 따라 레이저 설정을 사용 하 여 레이저-오목 폴 리 (methymethacrylate) (PMMA)에 가져온된 디자인 시트.
   3. 는 Microstencil 배열 칩 레이저 조각에서 청결 한 파편에 이온을 제거 된 물으로 씻는 다. 건조 microstencil 배열 칩 실내 온도에 봉인된 된 봉투에 60 ° c....

결과

제조 그리고 3D microtissue 형성에 대 한 microcryogels의 특성.

이 프로토콜에 따라 microcryogels 형태로 3D microtissues 및 개별 microcryogels 또는 microcryogel 배열 조작 했다 고 재생 치료와 약물 검사, 각각 (그림 1)에 적용 했다. Microstencil 배열 칩 PMMA에서 조작 microcryogel 어레이 칩에 대 한 micromolds로 적용 되었다. 가변 기하학적 디자인 microstencil 어레이 칩에 대 한 준비 수 있습니다. 우리는 예를 들어, (즉, 원, 타원, 삼각형 및 클로버) 다양 한 형태와 다양 한 크기와 원형 microstencil 어레이 칩 포함 대표 45 x 1.......

토론

마약 검사에 대 한 재생 의학 및 생체 외에서 모델은 조직 공학^5,6,7,,89에 대 한 두 가지 중요 한 응용 프로그램입니다. 이러한 두 응용 프로그램을가지고 있지만 다른 요구, 그들 사이의 공통 분모를 셀 기능¹⁹를 향상 시키기 위해 더 많은 biomimetic 경작 조건에 대 한 필요에 있다. 만 향상 된 세포 기능 연구에서 질병 더 나은^20,21, 취급 수와 배양된 세포 약물 응답 더 정확 하 게 반영 하는 경우 우리가 마약 발견⁶

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
젤라틴	시그마	G7041	다른 모든 시약은 달리 표시되지 않는 한 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다.
글루타르알데히드	제이앤드 K	902042	재료의 제조에서 가교제로 사용됩니다.
유리 커버 슬립 (24 x 50 mm)	CITOGLASS, 중국	10212450C	마이크로 스텐실 어레이 칩에 prcursor 용액을 긁어 넣습니다.
나트륨  borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	겔화 후 남아있는 글루타르알데히드를 씻어냅니다.
진공 항아리	asperts, 중국	VC8130	진공 상태에서 마이크로 젤을 보존합니다.
폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 시트	Sunjin Electronics Co., Ltd, 중국		일반 PMMA 시트.
Rayjet 레이저 시스템	Rayjet, 호주	Rayjet 50 C30	PMMA 시트를 조각하여 우물을 형성합니다.
플라즈마 클리너	Mycro Technologies, 미국	PDC-32G	PMMA를 최면으로 만듭니다.
동결 건조기	Boyikang, 중국	SC21CL	재료를 동결 건조합니다.
Trypan Blue 용액 (0.4 %)	Zhongkekeao, 중국	DA0065	마이크로 젤을 염색합니다.
독소루비신 염산염	에너지 화학, 중국	A01E0801360010	2D 또는 3D 마이크로겔에서 세포의 약물 내성을 테스트합니다.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies(일본 구마모토)	CS01-10	살아있는 세포와 죽은 세포를 구별합니다.
Cell Titer-Blue	Promega (미국 위스콘신).	G8080	세포 생존력을 테스트합니다.
세포 여과기	BD Biosciences, USA	352360	마이크로겔을 수집하기 위해.
D-Luciferin	SYNCHEM (독일)	s039	세포를 압정합니다.
주사 전자 현미경	FEI, 미국	Quanta 200	마이크로겔 형태를 특성화합니다.
기계 시험기	Bose, USA	3230	기계적 특징을 측정합니다.
프로그래밍 가능한 주사기 펌프	World Precision Instruments, 미국	ALADINI 1000	injactabiliy를 테스트합니다.
디지털 포스 게이지	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., 중국	H-50	injactabiliy를 테스트하기 위해.
에틸렌 옥사이드 살균 시스템	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	에틸렌 옥사이드 가스로 마이크로 젤을 살균합니다.
Microplate reader	Molecular Devices, USA	M5	마이크로 어레이에서 형광 강도를 측정합니다.
컨포칼 현미경	Nikon, Japan	A1Rsi	세포 분포를 3D로 관찰합니다.
제노젠  Lumina II 이미징 시스템	Caliper Life Sciences, 미국	IVIS	동물의 세포를 추적합니다.
액체 일 stataion	살구 디자인, 미국	S 피펫	매체 또는 세포 현탁액을 high-throuputly를 적재하기 위하여.