방법 논문

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

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DOI:

10.3791/55994

⸱

2017년 8월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

이 논문에서

요약

쥐에서 대규모 중앙 신경 유전자 배달 방법 적용 됩니다. 이 예제에서는 목적은 전체 척수에 영향을 미치는 질병을 모방 이다. 광범위 한 변환, 주변 관리에서 CNS에 치료 단백질을 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다.

초록

정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR), optogenetics, cre lox 타겟팅, 등 클러스터 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 신경 과학에 키 시는. 이 원고의 목적은 AAV의 꼬리 정 맥 주입을 통해 쥐에 광대 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 유전자 전송을 시도 하는 탐정을 원조 하기 위하여. 대규모 식 광범위 한 병 리, 조건에 대 한 관련 이며 쥐 모델은 중요 한 그것의 큰 크기와 쥐에 비해 인 간에 게 생리 적인 유사성 때문입니다. 이 예제에서는 응용 프로그램에서 대규모 신경 전달 전체 척수, 루 경화 증 (ALS)에 영향을 미치는 신경 질환을 모방 하는 데 사용 됩니다. 효율적인 대규모 CNS 변환 전 임상 연구에서 치료 단백질 요소를 전달 하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇 주 후 주입 식 간격 후 변환의 효과 평가 됩니다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 제어 벡터에 대 한 소 뇌에 GFP 양의 기본적인 이미징 프로그램에 의해 신속 하 고 안정적으로 추정 된다. ALS에 의해 유도 모터 질병 고기 관련 단백질 양자가 응답 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질, 적자 탈출 반사와 rotarod에 의해 득점 된다. 질병 모델링 및 유전자 치료, 대규모 진 여기에 설명 된 대상에 대 한 다양 한 잠재적인 신청이 있다. 이 메서드를 사용 하 여 확장 된 가설 신경 과학에서 neurogenetics 테스트를 신속에 도움이 됩니다.

서론

왜냐하면 그들은 너무 신경 vivo에서 시험에 대 한 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터 CNS 연구를 위한 필수적인 도구는. AAV 벡터는 매우 다른 transgenes 및 단백질 isoforms, 다른 조직, 다른 호스트 종, 그리고 관리의 다른 노선 공부에 대 한 다양 한. 예를 들어, AAV 관리할 수 마우스 주변 기기로, 상대적으로 비-침략 적, 처음으로 신경 통해 CNS transduce를 정 맥 주사 설명 Foust 외 에 두 끼 외. Gombash 그 외 여러분 에 의해 (참조 정돈 종이 (2014))입니다. 1 , 2 , 3 이 유전자 납품 방법은 어느 녹색 형광 단백질 (GFP)를 효율적으로 표현 하 쥐에 사용 됩니다 또는 ALS 관련 단백질, 양자가 응답 CNS에서 43 kDa (TDP-43)의 DNA 묶는 단백질. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 중요 한는 쥐에서 일 쥐의 생리 및 대사 매개 변수는 마우스에 비해 인 간에 게 가까이 있으며 행동 및 독물학 분석 실험 쥐를 위해 특별히 설계 된 때문입니다. 또한, 더 많은 유전자 변형 쥐 라인 제공 되고있다는 AAV 유전자 전달 연구에 이용 될 수 있다.

메서드는 쥐, 그리고 결과의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 광대 한 CNS 유전자 이동에 대 한 자세한. 대규모 CNS 변환 척수 전체 TDP-43으로 표현 하 여 쥐에서 ALS의 징후를 모방 하는 데 사용 됩니다. 방법은 TDP-43 벡터 잭슨 외 에 사용으로 젊은 성인 쥐의 꼬리 정 맥 주사 6 , 8 , 9 몇 주 후, TDP-43-유도 모터 적자는 승리 두 가지 방법으로: 반사와 데이 턴 외 에 잭슨 그 외 여러분 사용 rotarod 탈출 5 , 6 , 7 , 9 사후 분석, 제어 GFP 벡터에 대 한 소 뇌의 형광 영역으로 계산 됩니다 변환 효율 잭슨 외 에서 사용 되는 인덱스 6 , 8 소 뇌의 분석 주변 유전자 납품 후 CNS 변환의 정도의 신속 하 고 신뢰할 수 있는 색인 것을 입증 했다 고 주변 중앙 유전자 전송을 시도 하는 접근의 다양 한에 적용 해야 합니다.

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프로토콜

모든 절차에 따라 적절 한 NIH 지침. 모든 절차는 동물 관리 및 사용 위원회 위조에 LSU 건강 과학 센터에 의해 승인 된 동물 프로토콜을 따 랐 다. 여성 Sprague-Dawley 쥐 나이의 6 주에는이 절차에 대 한 사용 되었다.

1. 필요한 벡터의 복용량/볼륨 결정

  1. 무게 벡터 준비 titer (농도)를 기반으로 하는 주입 각 동물에 필요한 바이러스 성 벡터의 크기를 결정 하 쥐. 이전 쥐 CNS에에서 효율적인 식 성공 했습니다 벡터 복용량을 사용 하 여 (잭슨 외를 참조 하십시오. 6).
    참고: AAV9 TDP-43 또는 AAV9 GFP, 전형적인 복용량은 3 × 10 13-1 x 10 14 벡터 게놈/kg 사이. 나이의 6 주에 젊은 성인 쥐 무게 약 150 g.
  2. 체계적인 비교에 대 한 모든 동물에 kg 당 동등한 복용량을 확인합니다. 볼륨 표준 권고 주입 볼륨 (250 g 쥐 250-500 µ L)를 초과 하지 않는 확인 하십시오. 전형적인 주입 볼륨은 젊은 성인 쥐에 200 μ.

2. 준비 작업 역

  1. 필요한 모든 용품을 수집: 한 파라핀 영화 동물, 동물, 거 즈 패드 (2-3 동물 당) 당 하나의 알코올 준비 패드 당 (약 5 x 5 cm) 사각 피펫으로 팁, 그리고는 micropipette.
  2. 70% 에탄올으로 표면 청소 작업 면을 준비 합니다. (~ 37 ° C) 낮은 설정 온도 아래로 열 패드를 놓습니다. 벤치 패드 난방 패드 위에 놓습니다.
  3. 가스 마 취 (isoflurane) 준비합니다. 적절 한 산소와 절차에 대 한 마 취 가스를 확인 합니다. 70% 에탄올, 유도 약 실 및 마 취 마스크를 청소 하 고 벤치 패드에 마 취 마스크를 놓습니다.

3. 벡터를 준비

  1. 벡터 실 온에서 해 동 하 고 각 동물에 대 한 살 균 microcentrifuge 튜브 라벨.
  2. 피펫으로 AAV의 볼륨에 결정 1.1 적절 한 관을 원하는 주입 볼륨 (여기, 200 μ)까지 볼륨 lactated 벨소리가지고 ' s 솔루션 또는 염 분.
  3. 소용돌이 1-2에 대 한 샘플 펄스와 다음 펄스 5 원심 분리기 튜브의 하단에 샘플을가지고 s.
  4. 피펫으로 튜브와 파라핀 영화의 광장에 쥐에 대 한 총 주입 볼륨.
  5. 1 mL 주사기 30 게이지 바늘 위.
  6. 는 파라핀 영화에 벡터에 아래로 향하게 하는 경사와 바늘을 놓습니다. 때까지 모든 바이러스 바늘과 주사기 주사기 플런저에 다시 당겨. 연습 쉽게 되는 바늘으로 공기 방울 그리기 않도록 주의 하십시오.

4. 쥐를 준비

  1. 1 L/min까지 산소 고 isoflurane 마 취 5%로 설정. 모든 연결 호스 및 자 지의 방향을 확인 하 여 가스 마 취 유도 챔버를 흐르는입니다 확인 하십시오.
  2. 쥐 응답 하지 않는 때까지 약 3 분, 가스 마 취 유도 실에서 쥐를 장소.
  3. 는 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 발가락 핀치 후 발 또는 다리에 운동 되어야 합니다.
  4. Isoflurane 마 취 마 취의 유지 보수에 대 한 2%로 감소 하 고는 자 지를 조정 하는 마 취는 마 취 마스크를 흐르는.
  5. 쥐 장소 ' s 마 취 마스크에서 코와 그것의 측면에 거짓말은 쥐를 조정.
  6. 식별 측면 꼬리 정 맥.
    참고: 약 10 2 o에서 측면 꼬리 정 맥 거짓말 ' 12 꼬리의 지 느 러 미 상단 시계 o ' 시계. 쥐의 측면에 누워와 측면 꼬리 정 맥 한다 직면 자책점
  7. 는 알코올 준비 패드 주입 영역을 닦으십시오. 주사 부는 꼬리의 길이 아래로 2/3.

5. 벡터를 주입

  1. 단단히 잡고 꼬리 약간 한 손가락으로 주입 영역 위에 측면 꼬리 정 맥에 직접;이 정 맥을 팽창 합니다.
  2. 빗면 위로 향하도록 정렬 같은 방향으로 보이는 꼬리 정 맥으로 바늘.
  3. 을 피하기 위해 다른 한편으로는 꼬리를 잡고 고 꼬리 정 맥에 큰 관심을 복용 하는 동안 꼬리 정 맥을 통해 피부를 피어스.
  4. 정상 혈액 흐름 수 있도록 꼬리 정 맥에서 압력을 풀어.
  5. 정 맥에 바늘을 이동합니다. 바늘 꼬리 정 맥 구멍은 되도록 뒤로 당겨 약간 플런저 합니다. 정 맥에 바늘 있으면 바늘으로 혈액 흐름 것입니다.
  6. 조정 필요에 따라 바늘
      입니다. 바늘을 안정, 사출 사이트 아래에 주사 부 위에 손을 이동 그리고 꼬리에 대 한 주사기의 끝을 잡고.
  7. 꼬리 (약 20 µ L/s)에 벡터를 천천히 주입.
    참고: 정 맥은 그것을 통해 벡터 흐름으로 색상을 잃을 수 있습니다. 징후는 솔루션 혈관 밖에 주입 했다 포함 blebbing, 벡터를 주입 하는 경우는 피부, 또는 저항의 창백. 연습으로, 여분 혈관 노출 최소화 될 수 있다.
  8. 벡터를 투여 후 쥐에서 바늘을 제거 하 고 30-60 미에 대 한 출혈을 막기 위해 주사 사이트에 대 한 거 즈 패드를 눌러

6. 정리

  1. 해제는 isoflurane 마 취와 산소. 의식, 차릴 때까지 쥐를 모니터링 하 고 다음 그것의 감 금에 반환.
  2. 신중 하 게 sharps 컨테이너에 모든 바늘을 배치합니다. 잠재적으로 오염 된 AAV 적절 한 생물 용기에 다른 모든 일회용 재료의 처분. 70% 에탄올과 작업 역 청소.

7. 평가 hindlimb 탈출 반사

참고: Hindlimb 적자 일반적으로 발생 하는 벡터 복용량에 따라 TDP-43 유전자 이동 후 2-6 주.

  1. 두 손가락으로 파편의 평면 클리어에는 쥐를 잡아 ' s는 몸에서 약 2 cm 꼬리. 앞 발은 쥐의 복 부 아래쪽을 보는 동안 걸려 때까지 쥐를 부드럽게 들어올립니다.
    1. 수행 주간 과정에 걸쳐 실험 시간-유전자 이동 후 절차 (예를 들어, 유전자 이동 후 12 주까지).
      참고:이 방법으로 또한 점수를 forelimb 적자 하지만 hindlimb 적자는이 모델을 사용 하는 벡터 복용량에 따라에서 발생할 가능성이 높습니다.
  2. 하나 또는 둘 모두 hindlimbs 10 동안 중간 선 향해 닥 10 미 메모는 hindlimbs 관찰 s.
  3. 반복 30 세 번의 총에 대 한이 테스트 시험 사이 s. 하나 또는 둘 모두 hindlimbs는 3 개의 시험의 각각에 대 한 꽉, 쥐 모터 역 기능을 보이고 있다. 경우에 모든 3 개의 시험에서 떨림 일관 된 어느 일방 또는 양자 hindlimb 적자 존재로 (주)에서 수동으로 데이터를 기록.

8. 평가 rotarod에 모터 기능

  1. rotarod, 설정 하는 rotarod 아래 벤치 패드를 배치 하 고 2 분 이상 (속도 증가 ~0.3 rpm/s) 4-40 분당 회전 (rpm)를 가속 설정. 12 주 시간-과정, 2, 4, 8에서 주제를 실행 하 고 유전자 후 12 주 전송.
  2. 허용 20 분에 대 한 테스트 룸에 두었던 쥐
  3. 는 rotarod 처음으로 사용 하 여 쥐를 훈련 하는 먼저 4 rpm의 설정된 속도에서 rotarod 시작 다음는 rotarod에 쥐를 놓고. 쥐 4 rpm에서 한 전체 혁명에 대 한 걸 다음 가속을 시작 하 고 쥐 그것 떨어지 때까지 rotarod에 걸을 수 있도록. 쥐 적어도 40에 대 한 지속적으로 걸을 수 있을 때까지 훈련을 계속 s. 건강 한, 젊은 성인 쥐 쉽게 이러한 방식으로 훈련 될 것 이다.
    1. 눈에 띄는 모터 손상 된 쥐의 경우는 기준 대기 시간 40의가을 달성에서 쥐를 되지 않을 수 있습니다 s, 쥐 rotarod 득점을 시작 하기 전에 3-5 교육 시도 제공.
  4. Rotarod 테스트를 시작 하는 쥐에는 rotarod 놓고는 rotarod의 가속을 시작. 참고 rotarod;에서 쥐가는 시간 이것은을에 대기 시간 이다. 쥐 120 후는 rotarod에 남아 경우 s,이 시점에서 세션 모자는 rotarod에서 쥐를 제거 하 고 120의가 대기 시간을 기록 s.
  5. 테스트 3 재판의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 피로의 효과 최소화 하기 위해 떨어져 재판 적어도 5 분 간격. 3 시험의 점수를 평균 한다. 손상 되지 않은 성인 쥐 일반적으로의을에 평균 대기 시간을가지고 > 40 s.
  6. 장에 다시 쥐를 놓고 rotarod 및 70% 에탄올과 주변 지역 청소.

9. 소 뇌에 GFP 식의 정량화

  1. Anesthetize 쥐 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 다음 4% paraformaldehyde perfuse. 두뇌 및 척수를 dissect 하 고는 정착 액에 담가 하룻밤 조직 30% 자당 해결책에 그들을 이동. 평형, 후에 동결 단계 4 , , 5 6와 슬라이딩 톰 50 μ m 코로나 섹션 컷.
  2. 는 Vermis, 소 뇌의 중앙 엽에에서 균등 하 게 배치 하는 소 뇌의 3-6 섹션을 선택 합니다. 신호를 최대화 하기 위해 GFP 레이블을 붙일. 1: 500에 GFP에 대 한 1 차적인 항 체를 사용 하 고 알 렉 사-488 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 1:300 4 , , 5 6의 희석에.
    참고: 참조 참조 4 , , 5 6 자세히는 샘플링에 대 한 단면, 그리고 절차를 얼룩.
  3. 낮은 배율 렌즈 현미경을 사용 하 여 관심의 정의 된 영역에 각 섹션을 photomicrograph. 2.5 X 목표 (0.12 없음)를 사용 하 여 필터 설정 10, 450-490/515-565 여기/방출). 카메라 설정 (노출 시간, 예를 들어, 2 s) 샘플 분석을 통해 동일. 다른 이름으로 저장 한. TIF 파일.
  4. 널리 귀 공자 이미지 프로그램에는 photomicrograph를 열고; 2 개의 창이 열립니다. 닫기 창으로 표시 " 인덱스 색상 ".
  5. 선택 " 옵션 ", 다음 " 밀도 SliceŔ 그늘의 범위는 룩 업 테이블 (LUT) 창에 빨간색으로 표시 됩니다. 창에서 커서를 사용 하는 특정 GFP 라벨만 입력 하 고 일반적인 배경 이미지에 뽑 시작 중지.
    참고:이 측정할 수를 photomicrograph에 형광 영역을 강조 표시 됩니다. 설정을은 구체적으로 모든 가시 형광 셀을 잡으려고 최적화 되어야 합니다. 연습으로,이 방법은 정확 하 게 특정 형광 강조 수 있습니다.
  6. 형광 영역을 측정 하기 전에 먼저 올바른 단위 (픽셀)는 측정 인지 확인. 이렇게 하려면 " 분석 ", 다음 " 설정 ScaleŔ 네 번째 줄 라고 한다 " 단위 ". 픽셀 픽셀 단위로 측정을 클릭을 선택 드롭-다운 목록에서 " 확인 ". 분석 옵션을 설정/해제 " 인테리어 구멍 포함 " 분석에서 몸 전체 세포의 포함 되도록.
  7. 형광 면적 측정 클릭 " 분석 "을 클릭 하 고 " 측정 ". 이 값을 표시 하려면 " 분석 " 클릭 " 표시 ResultsŔ 결과 창이 나타납니다. 라는 제목 아래 형광 영역 측정 될 것입니다 " 지역 ".
  8. 측정에 걸쳐 표준화를 위해 LUT 창에서 강조 표시 된 값을 변경 하지 마십시오.
  9. 모든 측정 기록 되었습니다, 일단 평균 (동물 당 3-6 절)에서 각 동물에 대 한 값입니다. 적절 한 통계 테스트를 사용 하 여 그룹 간의 transduced 영역 비교. 6

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결과

TDP-43 유도 모터 장애 AAV TDP-43 사용 (그림 1)의 복용량에 따라 2-6 주 이내에 발생 한다. 실패 한 꼬리 정 맥 주사 될 부분 또는 없음; AAV 효과 생산 하기 위해 혈 류를 도달 해야 합니다. AAV GFP의 성공적인 주입 벡터 복용량 의존 방식으로 뇌와 척수에 걸쳐 GFP 식에서 발생 합니다. 드라이브 식, 세포 치킨 베타 걸 하이브리드 발기인, CAG 발기인 라고도 강한 재조합 발기인을 사용 하는 경우 CNS 간, 심장 등 다른 여러 조직에 효율적인 표현이 이다. 4 , 5 , 10 내 쥐 CNS, AAV9 또는 AAV PHP를 사용 하는 경우. B 벡터, 패턴은 주로 신경 전달만 스파스, 산발적 glial 변환.

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토론

다양 한 전달 경로 AAV 벡터에 대 한 테스트 되었습니다: 내부 parenchymal 내부-cerebroventricular, 내부 thecal, 정 맥, intranasal, 내부 근육, 등. 각 경로 특정 장점 뿐만 아니라 단점으로 할 수 있습니다. AAV의 성인 쥐의 꼬리 정 맥 행정은 CNS의 일관 된 변환 달성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 주변 주입 방법 CNS 조직으로는 주입 정 맥의 소개를 방지 하 고 최소 침 습 이므로. 이 방법으로 얻을 수 있는 효율적인 CNS 식 기법의 가장 큰 장점은입니다. 다른 실용적인 장점은 주입 방법은 매우 빨리 처음부터 끝까지 동물 당 (약 10 분)와 꼬리 정 맥 주사는 매우 기술 및 따라서 신속 하 게 마스터 수 있습니다. 물론, 주요 단점은 AAV preps 1 x 1013 벡터 게놈/ml 미만입니다 경우 타당성 문제를 될 것입니다 높은 titer 벡터의 많은 필요 하다는 점입니다. 추가 기능을 대상으로 하는 벡터의 구체화,이 이렇게 유리한 임상 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 ALS 협회, Karyopharm 치료제, Inc., Meira GTx, 토마스 Lawson을 우리는 감사에서 ALS 연구에 대 한 자선 기부에 의해 투자 되었다. 우리 감사 Elysse 과수원과도 나 Burney 조언과 훈련. JAS 거짓말 재단이 지원 하 고 건강의 국가 학회 GM103418를 부여 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ScalePelouzeSP5
Nalgene 버킷Thermo Scientific120140004000 mL
마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5500
젖산 링거 용액Baxter Healthcare0338-0114-04
Mini vortexerFisher Scientific128101
원심분리기Eppendorf22624415
Laboratory filmBemisPM996
1-mL 주사기BD30962625g 바늘이 부착된 상태로 제공됩니다.
주입용 27-30g 바늘로 교체
30g 바늘BD305106
IsofluranePiramal Healthcare66794-013-25Isoflurane USP 250 mL
마취 마스크Kopf Instruments906
GauzeHenry Schein100-25242" x 2" (5cm x 5cm)
피펫 팁USA Scientific1111-0816
MicropipetGilson4642080
가스 마취 기화기SurgiVet4214322Classic T3
가스 마취 청소기SurgiVet32373B10Enviro-PURE
가열 패드Sears17280
벤치 패드VWR56617-006
RotarodPanlab/Harvard Apparatus76-0772쥐 4마리/ 생쥐 4
70% 에탄올Decon Laboratories, Inc.2401140 증거
70% 이소프로판올VWR89108-160
Scion ImageScion Corporation
GFP 태그 다클론 항체InvitrogenA111221차 항체 - 1:500 희석
AlexaFluor 488InvitrogenA110702차 항체 - 1:300 희석
Axioskop 40 현미경Zeiss
마리

참고문헌

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

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