레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.
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방법 논문
고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
레이저와 로컬 microirradiation 라이브 세포에서 DNA 복구 관련 프로세스의 연구에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리가 로컬로 microirradiated chromatin에서 시간 또는 단백질 단백질 상호 작용을 통해 단백질 DNA 병 변에서 활동을 분석 하는 방법론 접근 방식을 설명 합니다. 우리 또한 세포 주기 세포 주기 의존적인 단백질 DNA 병 변에서 속도 론을 공부 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하 여 개별 단계를 인식 하는 방법을 보여 줍니다. 2 자외선 레이저를 사용 하 여의 방법론 설명 (355 nm, 405 nm) 다른 유형의 DNA 손상 유도 하는 것 또한 제공 됩니다. 만 405 nm 다이오드 레이저 셀 microirradiated 유사 분열을 통해 정상적으로 진행 하 고 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs) 없는 했다. 우리는 또한 어떻게 microirradiated 셀 관심의 내 생 단백질의 immunodetection를 수행 하기 위해 주어진된 시간에 고쳐질 수 있다 보여줍니다. 또한 생물 방법 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광) 및 FLIM (형광 일생 화상 현미경 검사 법)를 포함 하 여 자연 발생 된 셀에서의 사용 설명 DNA 수 선 연구, DNA 손상 포커스. 우리는 또한 단백질 단백질 상호 작용의 실험 연구에 FLIM-무서 워 (형광 공명 에너지 전송)의 응용 프로그램을 보여줍니다.
서론
구성 된 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, 및 단일 가닥 DNA 변의 모양을 이끌어 DNA 손상 또는 더블-스트랜드 나누기1,2. Γ 광선은 높은 에너지와 높은 penetrance 이온화 방사선의 형태, 따라서 방사선의이 소스는 방사선 치료3에서 널리 이용 된다. 다른 한편으로, 실험적으로 UV 레이저 모방 자연 UV 빛에 노출으로 인 한 DNA 손상을 유도 한다. 현미경 방법으로 UVA microirradiation은 개별 살아있는 세포에서 DNA 손상 연구 실험 도구를 나타냅니다. Microirradiation은 염색체 지구4,5의 조직 공개 40 년 전에 처음으로 사용 되었다. 이 기술은 매우 중 confocal 현미경의 기능 특성 또는 현대 nanoscopy의 기술적인 한계에 종속 됩니다. DNA 병 변을 유도 하 세포 5' bromodeoxyuridine (BrdU) 또는 Hoechst 33342 UV 조사 전에 presensitized 수....
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프로토콜
1. 재배의 셀 라인
- 헬러 파생 셀 라인
참고: 사용 헬러 자 궁 경부 암 세포: 히스톤 H2B 안정적으로 표현 하거나 HeLa 세포 GFP 또는 헬러 Fucci 셀 RFP Cdt1 표현 태그 g 1와 이른 S 단계 및 GFP geminin S/g 2-M 단계 ( 그림 1)에서- 모든 헬러 파생 셀 라인의 경작, 사용 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% CO 2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 적절 한 항생제와 보충. 대체 매체 2-주 당 3 번.
- 문화 매체를 제거 하 고 씻어 트립 신 억제제를 포함 하는 혈 청의 모든 흔적을 제거 하기 위해 1 x PBS를 사용 하 여 셀. 실 온에서 생물 학적 후드에이 단계를 수행.
- 셀 레이어 커버 prewarmed 트립 신-EDTA 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 셀 계층 분산 (일반적으로 3-5 분) 때까지 37 ° C. Trypsinize 세포에서 세포를 유지.
- 트립 신-EDTA, 비활성화를 prewarmed 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 하 고 부드럽....
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결과
고급 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여, DNA 병 변에서 mCherry 태그의 53BP1 및 mCherry PCNA 단백질의 축적을 관찰 합니다. 분석은 살아있는 세포의 지역 microirradiation에 의해 수행 되었습니다. 우리는 초기 S, g 1을 확인 하는 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하는 개별 세포 주기 단계에서 DNA 복구 관련 단백질의 핵 배포 패턴을 인식 하 고 셀의 G2 단계 주기 (그림 1). 우리는 Suchankova 외 에 출판 Fucci 세포 모델의 생물 학적 응용 26 그 53BP1의 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 동안이 단백질의 기능에 연관 되었다, 세포 주기 G1, S, G2 단계에서 로컬로 유발된 DNA 장애에 채용 되었다 표시를 선도 하는 주요 메커니즘 중 하나 이중 가닥 브레이크 수리입니다. 다른 한편으로.......
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토론
현미경 검사 법 기술 연구 실험실에서 기본 도구를 나타냅니다. 여기, 단백질 모집의 연구에 대 한 사용 하는 방법에 대 한 간략 한 설명을 하 고 속도 론 DNA 병 변에서 선물 된다. 우리는 특히 살아있는 세포의 지역 microirradiation의 분야에서 우리의 실험 경험을 언급 하 고 우리가 FRAP 및 단백질-단백질 상호 작용 수락자 표백 무서 워28 에 의해 DNA 병 변 및 그것의 첨단에 의해 단백질 활동의 연구를 토론 수정 무서 워-FLIM (그림 4A-D). 여기에 표시 된 메서드는 DNA 복구 프로세스, 특히 단백질 활동 생활 셀룰러 시스템에서의 진정한 이해를 위한 필수 도구 고급 confocal 현미경6,,78.......
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공개 사항
저자 아무 충돌 다는 것을 선언 합니다.
감사의 글
이 작품의 체코 공화국, 프로젝트 P302-12-G157 부여 기관에 의해 지원 되었다. 실험 또한 체코 노르웨이어 연구 프로그램 CZ09, 노르웨이 자금, 그리고 교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국에 의해 감독에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 7F14369).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM PAN-Biotech | P03-0710 | ||
| DMEM 고혈당 | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| 소 태아 혈청(FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES 세포 FBS | Gibco | 16141-079 | |
| 비필수 아미노산(NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF(마우스 백혈병 억제제 인자) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG(1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Biosera | XC-A4122/100 | |
| 트립신 - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | 1 ×로 희석; 비율 1 : 6 |
| Nunclon 세포 배양 접시 | Sigma-Aldrich | P7866 | mESC D3 세포 배 |
| µ -Dish 35m + A15 : I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | 현미경 접시 |
| 0.2 % 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G1890-100G | 스틸 물에 희석 및 오토 클레이브 |
| Name< / strong> | Company< / strong> | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| >Cell transfection | |||
| GFP-p53 | plasmid Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | , Cristina Cardoso, Technische Universitä t 다름슈타트 | ||
| mCherry-53BP1 플라스미드 | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020– 2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | transfection 사용 1 × 뉴클레아제가 없는 물에 희석된 PBS |
| 5-bromo-2'-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | >카탈로그 번호 | Comments |
| >Confocal 현미경 | |||
| T현미경 라이카 TCS SP5 | 라이카 마이크로시스템 | ||
| 현미경 라이카 TCS SP8 | 라이카 마이크로시스템즈 | ||
| 백색광 레이저 | 라이카 마이크로시스템 | ||
| 355nm 레이저 | Coherent Inc. | 레이저 출력 80 mW | |
| 405-nm 레이저 | Leica Microsystems | 레이저 출력 50 mW | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% 파라포름알데히드 | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| 퀼라야 껍질의 사포닌 | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | 1차 항체 |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | 2차 항체 |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | 장착 매체 |
참고문헌
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.
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재인쇄 및 허가
