기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출
이 논문에서
요약
초록
불완전 한 chimerism의 존재는 환자 thalassemia 메이저에 대 한 골 수 이식 또는 낫 세포 질병의 큰 비율에 기록 됩니다. 이 관찰으로 후속 치료 immunomodulation 전략 임상 결과 향상 시킬 수 있는 엄청난 의미를 갖는다. 통상, 짧은 탠덤 반복의 중 합 효소 연쇄 반응에 기초를 둔 분석 혈액 세포 기증자 파생 된 chimerism를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 nucleated 세포에 제한 이며 천연된 단 세포 계보를 구분할 수 없습니다. 우리는 짧은 탠덤 반복 조 혈 조상 cytometric 정렬 셀 흐름의 분석을 적용 하 고이 짧은 탠덤 반복 선택 된 버스트 형성 단위-erythroid 식민지에서에서 얻은 두 뼈에서 수집 된의 분석에 비해 수입니다. 이 방법으로 우리는 서로 다른 확산 및 erythroid 구획에 기증자 세포의 수 있습니다. 이 기술은 설정 줄기 세포 이식에서 chimerism의 전류 모니터링 완료 수 이며 따라서 적용된 미래에 임상 연구, 줄기 세포 연구 그리고 유전자 치료 실험의 디자인 수 있습니다.
서론
수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 매우 손상에 대 한 90%의 질병-무료 생존 율을 달성 조 혈 시스템의 선천적인된 유전 질환의 다양 한 사용 가능한 유일한 치료 접근 및 생활 제한 환자1. 이 중요 한 치료 도구의 효능 중의 독성을 제한 하 여 최적화 된-이후의 regimens2, 이식 하지만 또한 개입 안정적인 이식 기능을 유지 하기 위한, 여는 정량의 가까운 모니터링 하 여 기증자 파생 셀3,,45.
완전 한 chimerism (CC) chimerism (MC) 혼합은 용어에 있을 때 기증자와 받는 사람 파생 셀 동시에 다양 한 반면 기증자 파생 된 세포에 의해 lymphohematopoietic 구획의 전체 교체를 의미 하는 일반적으로 비율입니다. 분할 chimerism (SC) 혼합된 chimerism erythroid 구획에서와 같은 단일 셀 계보에서 관찰의 동시 사용을 나타냅니다. 질병 재발 및 기증자 림프 구 혼합 또는 면역의 감소 등 시작 이후 immunomodula....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 절연의 조 혈 골 수 세포 다중 매개 변수 형광 활성화 된 세포 분류에 의해
- 샘플 얼룩이 지는 프로세스를 시작 하기 전에, 다음 항목 수집 필요가 준비:
- 12 x 75 m m 흐름 관 얼룩 세포
- 단의 준비에 대 한 그라데이션 미디어 (GM), 50 mL 원뿔 튜브 셀
- 얼룩 버퍼: 인산 염 (PBS) + 3% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 버퍼링
- 펫 < /l 난 >
- FC 블록 및 항 체 (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450 BD Biosciences) 얼룩. 이 형광 색소 조합으로 다른 채널에 무시할 일 좀 하지만 다른 적합 한 형광 색소 결합도 가능 하다.
- 보상 구슬 (필요한 경우)
- 정지 버퍼: 행 크 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS) + 25mm HEPES + 3 %FCS
- Trypan 블루와 hemocytometer
- 컬렉션 튜브: 정렬된 셀의 컬렉션에 대 한 높은 혈 청 튜브 (1 mL FCS + 25mm HEPES 포함)와 함께 풍부한 매체를 사용할 수 있습니다.
- 골 수 샘플: 엉덩이 뼈의 뒤쪽의 장 골도 머리에서....
- 샘플 얼룩이 지는 프로세스를 시작 하기 전에, 다음 항목 수집 필요가 준비:
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
FACS 셀 정렬 lymphohematopoietic 창시자의 분리
우리 여기에서 다운스트림 STR 분석에 필요한 세포 인구를 정렬 결과 보여 줍니다. 골 수 세포 V450 활용 된 안티-CD45, FITC 활용 된 안티-CD36와 APC 활용 된 안티-CD34 얼룩이 있었다. 관심의 인구는 megakaryocyte erythroid 창시자 (MEP), nucleated 세포 적혈구의 개발에 대 한 책임 이다. 이러한 셀 CD36, 표현 하지만 백혈구 공통 항 원 CD45에 대 한 부정적 (그림 1C). 필요한 경우 이러한 셀 수 더 분화 될 따라 CD36 식 수준에. 몇 가지 추가 인구 컨트롤을 정렬할 수 있습니다. 우리는 성숙한 골수성 세포 (
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재 연구의 목적은 hemoglobinopathies 치료 분석 기증자/받는 사람 chimerism erythroid 창시자 HSCT 환자에서 다음에 대 한 관객에 게 두 가지 방법의 조합을 제공 하는: 1.) 형광 활성화 된 세포 분류 조상 조 혈 모 세포 골 수 샘플 짧은 탠덤 반복 및 2의 분석에 의해 다음에.) 콜로 니 형성 단위 성장, 골 수 세포의 다양 한 시 조 형식에 식민지의 분류 다음 짧은 탠덤 반복의 분석. 이 방법의 참신 개별 식민지에 기증자 또는 받는 사람 chimerism를 평가 하는 프로토콜에서 기술을 결합에 있다.
이 접근의 특별 한 중요성 hemoglobinopathies HSCT 환자 치료 후 혼합된 chimerism의 맥락에서 찾을 수 있습니다. 몇몇 학문은 설명 했다 erythroid의 전조 세포 혼합 조 혈 chimerism3, 긴-지속적인 안정에서 및 결과와 상관 관계가 기증자 골수성 세포의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 Kinderkrebshilfe의 무지개 Südtirol에 의해 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE 헬스케어 | GE17-1440-02 | RBC 제거 |
| 50mL 원뿔형 튜브 | , Falcon | 14-432-22 | 시료 준비 |
| 12 x 75mm 유동 튜브 | , Falcon | 352002 | FACS 분류 |
| , 인산염 완충 식염수 | Gibco | 10010023 | PBS, |
| 태아 종아리 혈청 | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (열 불활성화) |
| CD34 APC | BD 생명 과학 | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD 생명 과학 | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD 생명 과학 | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan 블루 | Gibco | 15250061 | |
| 혈구 측정기 Invitrogen | Inc. | C10227 | 행크 자동 셀 카운 |
| 팅 s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Element of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| 이소코브 s 수정된 둘베코' s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 배양 성분 |
| CD34+ 자석 비드 | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ 정제 |
| 재조합 인간 G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| 재조합 인간 SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| 재조합 인간 GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| 재조합 인간 IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| 재조합 인간 IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA 혈액 추출 키트 | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 스펙트럼 광도계 | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | |
| PCR Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | 응용 생명 과학 | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX 크기 표준 | 응용 생명 과학 | 4310361 | PCR |
| 3130 유전자 분석기 | 응용 생명 과학 | 313001R | PCR |
참고문헌
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
