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방법 논문

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

7.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56002

⸱

2017년 9월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical University Innsbruck, 2Department of Internal Medicine V (Hematology & Oncology), Medical University Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Department of Pediatrics, Medical University Graz

이 논문에서

요약

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

초록

불완전 한 chimerism의 존재는 환자 thalassemia 메이저에 대 한 골 수 이식 또는 낫 세포 질병의 큰 비율에 기록 됩니다. 이 관찰으로 후속 치료 immunomodulation 전략 임상 결과 향상 시킬 수 있는 엄청난 의미를 갖는다. 통상, 짧은 탠덤 반복의 중 합 효소 연쇄 반응에 기초를 둔 분석 혈액 세포 기증자 파생 된 chimerism를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 nucleated 세포에 제한 이며 천연된 단 세포 계보를 구분할 수 없습니다. 우리는 짧은 탠덤 반복 조 혈 조상 cytometric 정렬 셀 흐름의 분석을 적용 하 고이 짧은 탠덤 반복 선택 된 버스트 형성 단위-erythroid 식민지에서에서 얻은 두 뼈에서 수집 된의 분석에 비해 수입니다. 이 방법으로 우리는 서로 다른 확산 및 erythroid 구획에 기증자 세포의 수 있습니다. 이 기술은 설정 줄기 세포 이식에서 chimerism의 전류 모니터링 완료 수 이며 따라서 적용된 미래에 임상 연구, 줄기 세포 연구 그리고 유전자 치료 실험의 디자인 수 있습니다.

서론

수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 매우 손상에 대 한 90%의 질병-무료 생존 율을 달성 조 혈 시스템의 선천적인된 유전 질환의 다양 한 사용 가능한 유일한 치료 접근 및 생활 제한 환자1. 이 중요 한 치료 도구의 효능 중의 독성을 제한 하 여 최적화 된-이후의 regimens2, 이식 하지만 또한 개입 안정적인 이식 기능을 유지 하기 위한, 여는 정량의 가까운 모니터링 하 여 기증자 파생 셀3,,45.

완전 한 chimerism (CC) chimerism (MC) 혼합은 용어에 있을 때 기증자와 받는 사람 파생 셀 동시에 다양 한 반면 기증자 파생 된 세포에 의해 lymphohematopoietic 구획의 전체 교체를 의미 하는 일반적으로 비율입니다. 분할 chimerism (SC) 혼합된 chimerism erythroid 구획에서와 같은 단일 셀 계보에서 관찰의 동시 사용을 나타냅니다. 질병 재발 및 기증자 림프 구 혼합 또는 면역의 감소 등 시작 이후 immunomodulatory 전략 취약 환자를 식별할 수 있습니다 그것으로 chimerism 상태 HSCT 다음의 신속한 결정이 중요, 치료6.

HSCT 후 engraftment를 모니터링 하기 위한 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. 면역 글로불린의 Isotyping 및 세포 유전학 분석 가난한 감도 있고 다형성7,8감지 하는 그들의 능력에서 제한 됩니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 소개 chimerism HSCT, 후 모니터링에서 감도 향상 시킬 수 있습니다 하지만 섹스 불일치 이식9로 제한 됩니다. 현재, 연쇄 반응 (PCR) chimerism를 검색 하는 데 사용 가장 광범위 한 방법 이며 변수 번호 탠덤 반복 (VNTRs)의 전통적인 agarose-아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법에 따라 또는 짧은 탠덤 반복 (STRs). 일상적으로 사용 양이 많은 PCR는 HSCT 다음 잔여 기증자 세포의 아주 작은 비율을 감지 수 있습니다. 지금까지 연구의 주요 한계는 MC 탐지 nucleated 세포 보다는 성숙 적혈구의 존재로 거의 독점적으로 제한, 즉 그 환자에 대 한 기능적으로 중요 한 영향을 받는 hemoglobinopathies 세포. 환자에서 다른 혈액 그룹, 그것은 cytofluorometric 분석은 단일 클론 항 체는 적혈구 항 원 ABO와 C, c, D, E 및 e10 으로 이동 하 여 적혈구에서 chimerism를 식별할 수 있게 기억할 만한 가치가 , 11. erythroid 계보에서 chimerism 평가의 서로 다른, 하지만 매우 재미 있는 의미는 흐름 cytometric clonogenic 분석 실험, 배양에 의해 erythroid 창시자 및 다양 한 erythroid 조상 종류의 정렬의 조합 다음 STR12의 분석. 이 방법은 erythroid 구획에서 기증자와 받는 사람 chimerism의 상대 비율을 정할 수 이며 골 수 이식 유지 전략에 활용 될 수 있습니다.

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프로토콜

1. 절연의 조 혈 골 수 세포 다중 매개 변수 형광 활성화 된 세포 분류에 의해

    1. 샘플 얼룩이 지는 프로세스를 시작 하기 전에, 다음 항목 수집 필요가 준비:
      1. 12 x 75 m m 흐름 관 얼룩 세포
      2. 단의 준비에 대 한 그라데이션 미디어 (GM), 50 mL 원뿔 튜브 셀
      3. 얼룩 버퍼: 인산 염 (PBS) + 3% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 버퍼링
      4. 펫 < /l 난 >
      5. FC 블록 및 항 체 (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450 BD Biosciences) 얼룩. 이 형광 색소 조합으로 다른 채널에 무시할 일 좀 하지만 다른 적합 한 형광 색소 결합도 가능 하다.
      6. 보상 구슬 (필요한 경우)
      7. 정지 버퍼: 행 크 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS) + 25mm HEPES + 3 %FCS
      8. Trypan 블루와 hemocytometer
      9. 컬렉션 튜브: 정렬된 셀의 컬렉션에 대 한 높은 혈 청 튜브 (1 mL FCS + 25mm HEPES 포함)와 함께 풍부한 매체를 사용할 수 있습니다.
      10. 골 수 샘플: 엉덩이 뼈의 뒤쪽의 장 골도 머리에서 골 수 생 검에 대 한 동의 일반적으로 필요. 골 수 샘플은 보다 얼룩까지 RT에서 heparinized 주사기에 보관. 다음 프로토콜 단계 기관의 지침에 따라 수행 됩니다 ' 인간의 복지에 대 한 s 인간 연구 윤리 위원회.
    2. 골 수 샘플의 단일 세포 현 탁 액을 생성. 원심 분리기 튜브에 GM의 3 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 GM 솔루션에 단일 세포 현 탁 액 4 mL 레이어. 20 ° 섭씨 (C)에서 30 분 550 g에서 원심 분리기 (브레이크 해제). 플라즈마 및 인터페이스에서 단 셀 레이어를 그대로 두고 살 균 피 펫을 사용 하 여 혈소판을 포함 하는 상위 계층의 그립니다. 살 균 피 펫을 사용 하 여 메 마른 분리기 관에 단 세포의 레이어를 전송.
    3. 버퍼 얼룩 5 mL로 세척 후 resuspend 2 mL 정지 버퍼에서 셀 및 셀 농도 결정. 나사 모자 테스트 튜브에 세포 현 탁 액의 장소 5 µ L. 0.2 %Trypan 푸른 얼룩의 95 µ L를 추가 합니다. 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분 동안 서 서 허용. 셀 계산 서 hemocytometer를 입력 합니다. 현미경으로 관찰 가능한 아닌 경우는 얼룩이 지 고 가능한 셀.
    4. 20 ° C에서 10 분 동안 250 g에서 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 100 µ L 당 최대 1 x 10 6의 농도에 버퍼를 얼룩에 셀 resuspend.
    5. 블록 FcR 2.5 µ g 당 10-15 분에 대 한 얼음에 1 x 10 6 셀 Fc 블록 사용 하 여
    6. 1 x 10 6 세포 얼룩을 어둠 속에서, 4 ° C에서 20 분 동안 품 어 추가 10 µ g mAb의 적절 한 조합 3 mL 버퍼 얼룩 세척 단계 옵니다. 정확한 보상에 대 한 셀 (또는 선호 보상 구슬)의 작은 aliquots는 물 들일 단일 항 체를 각; 흠 없는 남은 한 약 수.
    7. 20 x 10 6 셀/ml 농도 조정.
    8. 세트 고 셀 정렬 최적화. 교류 cytometer 및 소프트웨어를 설정 하는 프로세스는 회사에서 제공 하는 상세한 지침을 표준화 하 고 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 할.
  2. 정렬 셀 정렬
    1. 단계의 1.1.1.9 컬렉션 튜브 준비.
    2. 이항 음모 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 표시를 포함 하는 서식 파일 설정.
    3. 셀을 실행 하 고 금감위/SSC 규모의 인구를 조정
    4. 부정적인 제어 튜브 기록.
    5. 실행 하는 단일 긍정적인 통제 관, 각 관에 대 한 데이터를 기록.
    6. 수집 소프트웨어에서 제공 하는 기능으로 수동 또는 자동으로 보상을 계산.
    7. 실험 샘플을 확보 하 고에 이항 FSC/SSC 점 ( 그림 1A) 림프 및 골수성 세포를 포함 하도록 게이트. FSC (즉, 높이, 너비, 및 지역)의 다른 신호를 비교 하 여 남자와 집계 제외 ( 그림 1B). CD45 및 CD36 표시 이항 도트에 내의 셀을 시각화 ( 그림 1C). CD45에 대 한 긍정적인 이벤트는 백혈구 (를 포함 하 여 그들의 창시자), 그 CD45에 대 한 부정적인 CD36에 대 한 긍정적인 erythroid 창시자는. CD45 + 세포 제어 도구 정의 CD36 + (해당 되는 경우,이 세포 분할 될 수 있다 더 높은 CD36에 및 셀 낮은 표현)를 사용 하 여. CD45 + 이벤트 CD34 및 SSC 매개 변수를 표시 하는 또 다른 점 음모에서를 시각화 합니다. 게이팅 CD34 + 세포 (백혈구 창시자) 및 SSC 높은 세포 (골수성 세포 감 별 법의 다양 한 단계에서) 정의 하는 도구를 사용 하 여.
    8. 게이츠 결정 되었습니다, 일단 성문 외부 컬렉션 튜브에 정렬 선택할 수 있습니다.
    9. 셀의 필요한 수를 얻을 때까지 4 ° C에서 정렬 진행
    10. 정렬된 세포 인구 ( 그림 1E, 1F)의 순도 결정 하는 정렬 후 분석을 수행.

2. Clonogenic 분석 결과

  1. 시 약의 준비
    다음 항목을 수집 하 고 준비 해야 하는 프로세스를 시작 하기 전에:
    1. 펫, 100 mm 접시
    2. Trypan 블루와 hemocytometer
    3. 다시 구성 0.1% 이상 포함 하는 메 마른 PBS 500ml U에서 인간 재조합 형 erythropoietin (EPO) 인간 혈 청 알 부 민. 작은 aliquots에이 솔루션을 분할 하 고 반복된 동결-해 동을 피하기 위해-20 ° C에서 유지.
    4. 준비 완료 Iscove ' s 수정 Dulbecco ' 5 %FCS, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린/스 (PS)의 최종 농도와 매체 (IMDM) s. 완전 한 IMDM 매체에 별도 우물에 다른 농도에서 재조합 인간 erythropoietin (EPO) 추가: 3 단위 6 단위 EPO/잘 12 EPO 단위/잘 EPO/잘 (1 배속, 2 배속, 4 x EPO 각각).
  2. 골 수 세포의 준비
    1. 20 mL PBS에 희석 골 수 샘플의 10 mL은 천천히 두 단계 사이 명확한 인터페이스를 유지 하는 50 mL 원뿔 튜브에 15 mL 밀도 그라데이션 매체 위에 층이 nder 멸 균 조건입니다. 다음 9로 설정 하는 가속 및 감속 0 (또는 브레이크 해제)으로 설정 실 온 (RT)에서 30 분 동안 550 x g에서 15 mL 원뿔 튜브 원심.
    2. 원심, 후 새로운 50 mL 튜브에 인터페이스를 제거 하 고 최종 볼륨 50 mL의 PBS를 추가.
    3. 250 g 10 ° C에서 10 분 동안 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 하 고 약 0.5 x 10 6 셀/mL에서 완전 한 IMDM 매체에 셀 resuspend. 세포 현 탁 액의 10 µ L를 microtube, Trypan 블루 솔루션 (0.4%)의 같은 양으로 혼합 그리고는 hemocytometer를 사용 하 여 계산.
    4. O선택적: CD34 + 세포 Milteny CD34 구슬 제조에 의해 주어진 지침에 따라 정렬 하는 자기 세포에 의해 풍성 하 게. 이 농축 단계의 주요 장점은 50 ng/mL 줄기 세포 요소 (SCF), 20 ng/mL granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF), 20 ng/mL와 추가 반 고체 매트릭스에 재배 되는 조 혈 줄기 세포의 품질을 감지 하는 인터 루 킨-3 (3 일), 20 ng/mL 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 20 ng/mL granulocyte 콜로 니 자극 인자 (G-CSF) 및 1.4에서 EPO의 3 다른 농도.
    5. 희석 셀 0.1-0.15 x 10 6 단 셀/mL 또는 2 x 10 3 CD34 + 셀/mL 전체 IMDM 매체를 추가 하 여 보충 3 mL에 EPO 및 전송 300 µ L Methocult H4434 매체. 동요와 5 분 접시 3 짧은 보육 1, 1 시간 후 35 mm 접시에 mL. 2 제 3-물-로 가득 함께 이러한 문화 요리 100 mm 접시에 배치 됩니다.
    6. 셀 5% CO 2 습도 37 ° C 배양 기에서 14 일에 대 한 교양.
  3. 식민지의 분석
    1. 식민지는 득점 그리드로 표시 된 문화 접시에 40 배 확대에서 거꾸로 현미경으로 그들의 형태에 따라 주어진 다. 우리의 분석 결과에서는 콜로 니 형성 단위 (CFU) 4 종류로 분류 된다: multipotential 조상 세포 (CFU-GEMM), granulocyte-대 식 세포 조상 세포 (CFU-GM), 버스트 형성 단위-erythroid (BFU-E) 식민지 형성 단위-erythroid (CFU-E)입니다. 제조 업체를 참조 하십시오 ' 더 식민지 하위 분류에 대 한 지침 s.
    2. 추가 분석을 위해 셀 CFU 시험 접시에서 복구 별도로 4 범주에 따라 4 mL 실내 온도 2%를 포함 하는 PBS에 일시 중단 하 여 FCS/IMDM. 4 ° C에서 10 분 동안 400 g에서 원심 분리 후 세포는 PBS에 resuspended, 계산, 및 DNA 추출 처리.

3. Chimerism의 분석

  1. DNA 고립
  2. 10 분 400 g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은
    1. 격리 DNA 혈액 DNA 추출 킷 (QIAmp DNA 혈액 추출 kit)를 사용 하 여. 미리 eluted DNA의 수율을 향상 시키기 위해 37 ° C에서 차입 버퍼 (AE)를 따뜻한.
    2. 는 Nanodrop ND-1000 스펙트럼 photometer와 DNA 농도 측정합니다. 1.8-2.0 사이 OD 260/280 샘플 추가 분석을 위해 사용 됩니다.
    3. DNAase 무료 H 2 O 50 µ L의 전체 볼륨에 0.1 ng / µ L 희석 DNA.
  3. STR 분석
    1. 반응 혼합, AmplTaq 골드 DNA 중 합 효소 및 프로파일러 플러스 뇌관 세트 20 µ L 게놈 DNA를 혼합 하 여 PCR 반응 설정 (0.1 ng / µ L) 설명서에 따라 (뇌관 키트 포함는 레이블이 없는 뇌관 증폭 STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, 및 D7S820, 그리고 성별 마커 amelogenin 버퍼에). 부정적인 통제로 nuclease 무료 물 등 긍정적인 통제로 9947A. 기증자와 받는 사람 모두에서 사전 이식 DNA도 포함 되어 있습니다.
    2. Eppendorf mastercycler 그라디언트를 사용 하 여 다음 조건으로 수행 PCR 반응: 11 분 동안 95 ° C 1 분, 1 분, 1 분에 72 ° C 59 ° C 95 ° C의 28 증폭 주기 다음 45 분 동안 60 ° C
    3. 세트 조각 최대 분석 반응 12 µ L을 추가 하 여 안녕-디 Formamid 및 0.5 µ L GeneScan 500를 이용한 크기 표준 (모든 적용 농) PCR 제품의 1 µ L를. 첫 번째 및 마지막 위치에 사다리를 유전자 (Genotyper 앰프 플로리다 STR, 녹색 II 파란색과 노란색, 적용 농) 필요 하다.
    4. 전기 악기와 전기 및 수집 시작.
    5. 분석 Loci, 대립, 샘플 및 컨트롤 소프트웨어 13의 피크 높이.

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결과

FACS 셀 정렬 lymphohematopoietic 창시자의 분리

우리 여기에서 다운스트림 STR 분석에 필요한 세포 인구를 정렬 결과 보여 줍니다. 골 수 세포 V450 활용 된 안티-CD45, FITC 활용 된 안티-CD36와 APC 활용 된 안티-CD34 얼룩이 있었다. 관심의 인구는 megakaryocyte erythroid 창시자 (MEP), nucleated 세포 적혈구의 개발에 대 한 책임 이다. 이러한 셀 CD36, 표현 하지만 백혈구 공통 항 원 CD45에 대 한 부정적 (그림 1C). 필요한 경우 이러한 셀 수 더 분화 될 따라 CD36 식 수준에. 몇 가지 추가 인구 컨트롤을 정렬할 수 있습니다. 우리는 성숙한 골수성 세포 (

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토론

현재 연구의 목적은 hemoglobinopathies 치료 분석 기증자/받는 사람 chimerism erythroid 창시자 HSCT 환자에서 다음에 대 한 관객에 게 두 가지 방법의 조합을 제공 하는: 1.) 형광 활성화 된 세포 분류 조상 조 혈 모 세포 골 수 샘플 짧은 탠덤 반복 및 2의 분석에 의해 다음에.) 콜로 니 형성 단위 성장, 골 수 세포의 다양 한 시 조 형식에 식민지의 분류 다음 짧은 탠덤 반복의 분석. 이 방법의 참신 개별 식민지에 기증자 또는 받는 사람 chimerism를 평가 하는 프로토콜에서 기술을 결합에 있다.

이 접근의 특별 한 중요성 hemoglobinopathies HSCT 환자 치료 후 혼합된 chimerism의 맥락에서 찾을 수 있습니다. 몇몇 학문은 설명 했다 erythroid의 전조 세포 혼합 조 혈 chimerism3, 긴-지속적인 안정에서 및 결과와 상관 관계가 기증자 골수성 세포의...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 Kinderkrebshilfe의 무지개 Südtirol에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Ficoll-PaqueGE 헬스케어GE17-1440-02 RBC 제거
50mL 원뿔형 튜브, Falcon14-432-22시료 준비
12 x 75mm 유동 튜브, Falcon352002FACS 분류
, 인산염 완충 식염수Gibco10010023PBS,
태아 종아리 혈청Invitrogen Inc.16000-044FCS (열 불활성화)
CD34 APCBD 생명 과학561209FACS-Ab
CD36 FITCBD 생명 과학555454FACS-Ab
CD45 V450BD 생명 과학642275FACS-Ab
Trypan 블루Gibco15250061
혈구 측정기 InvitrogenInc.C10227행크 자동 셀 카운
팅 s Balanced Salt SolutionGibco14025092Suspension buffer in FACS analysis
HEPESGibco15630080Element of suspension buffer
FcRBD Bioscience564220Block FCR
FACS Aria IBD Bioscience23-11539-00FACS Sorter
Recombinant  human erythropoietinAffimetrix eBioscience14-8992-80EPO
이소코브 s 수정된 둘베코' s MediumGibco12440053IMDM
L-GlutamineInvitrogen25030-081배양 성분
CD34+ 자석 비드Milteny Biotech130-046-702CD34+ 정제
재조합  인간 G-CSFGibcoPHC2031CFU-Assay
재조합  인간 SCFGibcoCTP2113CFU-Assay
재조합  인간 GM-CSFGibcoPHC2015CFU-Assay
재조합  인간 IL-3BD Bioscience554604CFU-Assay
재조합  인간 IL-6BD Bioscience550071CFU-Assay
Methocult H4434 MediumStemcell Technologies4444CFU-Assay
QiAmp DNA 혈액 추출 키트Qiagen51306DNA Isolation
Nanodrop ND-1000 스펙트럼 광도계Thermo ScientificND 1000DNA Quantification
DNAase free H2OThermo ScientificFEREN0521DNA Preparation
AmplTaq Gold DNA PolymeraseApplied BioscienceN8080240
PCR Eppendorf mastercycler gradientEppendorf6321000019PCR 
Hi-Di Formamid응용 생명 과학4311320PCR
GeneScan 500 ROX 크기 표준응용 생명 과학4310361PCR
3130 유전자 분석기응용 생명 과학313001RPCR
, , , , ,

참고문헌

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