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방법 논문

마우스 모델에서 심폐 바이패스: 새로운 접근

10.6K 조회수

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DOI:

10.3791/56017

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2017년 9월 22일

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1Department of Cardiothoracic, Transplantation, and Vascular Surgery, Hannover Medical School, 2Department of Hematology, Oncology, Immunology, Rheumatology, and Pulmonology, University Hospital Tuebingen, 3Department of Pneumology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 문서에서는 마우스에 심폐 바이패스를 수행 하는 방법을 설명 합니다. 이 새로운 모델은 장기 손상에 관여 하는 분자 메커니즘의 조사를 촉진할 것 이다.

초록

심장 중재 동안 장기간된 심폐 바이패스 본질적인 되면서 절차 최적화에 대 한 고 장시간된 extracorporal 순환 기관 피해를 최소화 하기 위한 임상 수요 증가 발생 합니다. 이 문서의 목표 마우스에 심폐 바이패스의 완전 한 기능 및 임상 관련 모델을 설명 했다. 우리는 장치를 설계, 관류 회로 최적화와 microsurgical 기술에 보고합니다. 이 모델은 여러 피 도면에 대 한 필요성으로 인해 생존와 호환 되지 않습니다는 급성 모델. 이 모델 마우스 (예를 들어, 마커, 녹아웃, 등)에 사용할 수 있는 도구의 범위 때문에 장기 손상 및 다른 관련 심폐 바이패스의 효과의 분자 메커니즘에 조사를 촉진 한다 comorbidities입니다.

서론

심장과 폐 우회 (CPB)의 병원에 도입, 이후 그것은 심장 수술1에 필수적인 역할을 담당해 왔습니다. 현대 심장 수술, 장기 CPB 시간 광범위 한 대동맥 개조 및 결합 된 절차를 수행 하기 위해 필수적입니다. 기술의 진보 엄청난 되었습니다, extracorporal 순환의 사용은 관련 내부-와 수술 후 조직 및 지역 기관 손상2,3.

대형 동물 모델 생리 적 프로세스4,5에 CPB의 역할을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 이러한 모델은 CPB의 일부에 대 한 통찰력 관련 합병증 제공, 비록 그들은 매우 비용이 많이 드는 고 분자 도구 (예, 항 체)는 매우 제한 된. 작은 동물에 더 많은 비용 효율적인 대안 개발 되었습니다. 그들의 개발 이후 여러 연구 쥐와 토끼5,6,7,,89CPB 모델을 최적화 하기 위해 실시 되었습니다. 병 태 생리 질병 프로세스;의 측정을 위한 좋은 기초를 제공 하는 이러한 모델 그러나, 그들은 아직도 조사 하는 세포와 체액 성 면역학 관련 항 체 및 시 약의 부족 때문에 충분 하지 않습니다. 이 연구의이 분야에서 그들의 역할을 손상 한다.

우리는 최근 CPB의 마우스 모델을 개발 했습니다. 때문에 다양 한 마우스 관련 시 약 및 유전자 변형 쥐, 마우스 모델은 일반적 생리 적, 분자, 그리고 면역학 연구10,11에 대 한 선택의 모델입니다. 따라서, 우리의 모델 임상 관련 질병12,13사용할 수 있는 많은 쥐 종자는 다양 한 comorbidities 관하여 CPB의 연구를 촉진 한다. 따라서,이 종이 자세하게에서 설명 합니다, 쥐에 CPB를 수행 하는 방법을. 깊은 호흡과 순환 상 검거 후 산소와 hemodynamic 매개 변수는 밀접 하 게 모니터링 됩니다.

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프로토콜

모든 동물 실험 독일 동물 보호 법률 (TierSchG)에 따라 수행 하 고 (낮은 작센 주 사무소 소비자 보호 및 식품 안전, 프로토콜에 대 한 지역 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다 TSA 14/1556)입니다. 이 모델에 대 한 적합 한 마우스의 최소 무게는 25 이다 g.

1. 수술 전 준비

참고: 모든 프로시저 압력가 악기와 함께 깨끗 한, 비 살 균 조건 하에서 수행 됩니다.

  1. 장소 50-60 8 cm 긴 프로필 렌 중공 섬유 튜브에 병렬로 하 고 양쪽 모두 T 어댑터와 연결. 접착제와 속이 빈 섬유 및 T-어댑터의 외부 분기 사이 공간을 채우기.
  2. 허용 적어도 24 h 강화를 접착제에 대 한
      . 표준 톰을 사용 하 여 T 어댑터에서 밖으로 확장 하는 빈 섬유를 자르고 연결 사이트를 실리콘 튜브를 당겨.
  3. 2 Fr 폴리우레탄 정 (26 G branule)에서 27 G 금속 바늘을 삽입. 외과 블레이드를 사용 하 고 마이크로-가 위 현미경 (8-12 배 확대)을 3 ~ 4 fenestrations 약 0.15 cm의 각 보장 정의 원심 세 번째 내 최적의 정 맥 반환 흐름.
  4. 제거 완료 되 면 와이어
      입니다. 무뚝뚝한 절 개 및 구조의 철회에 대 한 면봉을 사용 합니다. 거 즈 면봉 (5 x 5 cm 2)를 사용 하 여 조직의 탈수를 방지 하기 위해 초과 하는 액체를 흡수.
  5. 못쓰게 볼륨을 준비. 완성 하기 위해 헤 파 린 못쓰게 솔루션 및 2.5 %v / v NaHCO 3 버퍼링의 8.4% 솔루션의 mL 당 30 IU를 추가 합니다. 사용 될 때까지 4 ° C에서이 솔루션을 저장.
  6. 채우기 CPB 회로 (즉,, 펌프, 공기 사냥꾼, 튜브와 두 뉼) 정 맥 캐 뉼 러를 통해 850 µ L 못쓰게 솔루션. 일단, CPB 순환 동물 cannulation에 대 한 준비가 될 때까지 유지.

2. 동물 마 취

마 취 관리, 동물 유도 챔버 미만 2.5%를에 장소
    • v/v isoflurane/산소 혼합물. 페달 철수 반사, 꼬리 핀치 반사와 눈 깜박임 반사를 평가 하 여 적절 한 마 취를 확인 합니다. 눈 건조를 피하기 위해 수의 눈 연 고를 적용.
    1. 온도 조절 기능을 가진 온난 패드에 동물을 배치합니다. 신체 온도 rectally 삽입 및 데이터 수집 시스템에 연결 된 프로브 측정.
    2. 전체 마 취를 달성 후 동물 orotracheally 20 G 플라스틱 braunule를 사용 하 여, 구두로 삽입 및 시각적인 통제 기관에 밀어 넣어야. 기계 환기 마우스 통풍 기에 연결 하는 isoflurane 기화 기를 사용 하 여 시작 합니다. 동물 체중에 따라 조정 환기 250-350 µ L의 해 일 볼륨 이루어집니다.
    3. 보장 완전 한 진통, 5 mg/kg 동물 bodyweight carprofen 피하 주사. 1.3-2.5% 산소에서 사이 isoflurane 농도 유지 하는 것이 좋습니다. Isoflurane 농도 절차의 단계에 따라 수동으로 조정 될 수 있습니다.

    3. 과적

    1. 전체 마 취 및 삽 관 법, 달성 후 날카로운가 위를 잘 목에 중간 피부 절 개를 수행, 무딘 패션에서 근육을 분리 하 고 바로 경 정 맥과 왼쪽된 경 동맥을 노출. 준비 하는 동안 최소한의 혈액 손실 되도록 수의학 coagulator 양극 겸 자에 연결을 사용 하 여 작은 혈관 응고.
    2. Jugular 혈관의 준비, 후 cranially 8-0 비단 봉합을 사용 하 여 그것의 분기를 왼쪽된 일반적인 경 동맥의 원심 세그먼트 선.
    3. 연결 동맥, 경 동맥에 정 맥의 끝 삽입의 인접 세그먼트에서 실리콘 커넥터 (0.5 m m ID, 1 m m OD), 장소 8-0 비단 봉합 슬립을 사용 하 여 동맥 유입 튜브를 27 G 정의 원심 끝 매듭.
    4. 이죠 proximally 대동맥 아치에 3-4 m m 되도록 사전 정 팁을 정 팁의 정확한 위치, 후. 8-0 실크 매듭으로 확보 하 여 정 팁 수정.
    5. 사용 microsurgical 집게와가 위, 무딘, 날카로운 해 부를 수행, 바로 경 정 맥 쇄 골, 가까이 sternocleidomastoid 근육을 옆으로 조직의 무딘 준비 하 여 노출과 선단부와 8-0 8 0 실크 매듭을 배치 근 위 끝을에서 루프.
    6. 경 정 맥의 선단부의 결 찰 후 정 맥 정 맥의 끝에 바로 경 정 맥 및 오른쪽 아 트리 움 쪽으로 진행 하 고 실크 매듭을 사용 하 여 보안. 최적의 정 맥 반환, 그것은 우 심 실에 정 맥 팁을 미리 해야 할 수 있습니다.
    7. 올바른 정 위치 달성 되 면 경 정 맥 혈관에 직접 주사를 통해 동물 bodyweight의 그램 당 덤플링의 2.5 IU를 추가 하 여 조직의 heparinization 수행.
    8. 실시간 침입 압력 모니터링을 위한 cannulate 왼쪽된 대 퇴 동맥. 사 타 구니 영역을 노출 하 고 부드럽게 대 퇴 정 맥, 대 퇴 신경 25 X 배율 아래에서 일반적인 대 퇴 동맥을 분리.
    9. Ligate 대 퇴 동맥의 말 초 부분
        . 일시적으로 슬립 매듭 인접 부분을 가리고 하 고 마이크로 집게를 사용 하 여 앞쪽 벽에 작은 절 개를 하 게.
      1. 이후에, 1 Fr 폴리우레탄 정 대 퇴 동맥으로 삽입 하 고 10-0 봉합 한 실크로 확보. 이 정 맥은 혈액 가스 분석을 위한 혈액 샘플을 추출 하는 데 사용 됩니다.
    10. 펌프 하 여 심폐 바이패스 동맥 및 정 맥 뉼의 성공적인 배치 후 시작. 삽 관 법에서 CPB의 시작 시간은 약 45 분 펌프 속도 증가 시켜 조직의 압력 측정, 및 전체 (4-6 mL/min)을 2 분 이내 증가 혈액의 흐름에 따라 0.5 mL/min의 유량을 사용 하 여 시작.
    11. 전체 모니터링은 위에서 시작 하 고 꼬리 방향으로 5mm가 날카로운가 위를 사용 하 여 상위 sternotomy 수행. Sternal 가장자리 출혈 방지를 즉시 응으십시오 대동맥 아치 두개골 방향에 오른쪽 경 동맥을 당겨 노출.
    12. 최적 제어, 원주 무료 클램핑을 촉진 하기 위하여 주변 조직과 thymus에서 대동맥 아치. 오름차순 대동맥 주위 8-0 실크 루프를 배치 합니다. Cardioplegia에 대 한 교차 클램프를, 당겨 더 나은 노출에 두개골 방향에 실크 루프 오름차순 대동맥.

    4. 심폐 바이패스 및 혈액 가스 분석

    1. 혈액 가스 분석 (BGA)를 사용 하 여 유리 모 세관 튜브 대 퇴 동맥 카 테 터를 통해 60-90 µ L 동맥 혈액을 수집.
      1. 실리콘 튜브에 작은 클램프를 사용 하 고 카 테 터에서 튜브를 분리. 모 세관 튜브의 제어 충전 수 있도록 클램프에 천천히 압력 해제.
      2. 는 실리콘 튜브 카 테 터를 다시 연결합니다. 다음 시간에 측정을 위한 혈액 가스 분석기에 모 세관 튜브를 삽입:
        환기 (BGA1)와 형사 요의 개시 후 10 분
        25 분 CPB의 및 호흡기 체포 (BGA2)의 15 분 후
        CPB의 및 호흡기 체포 (BGA3)의 30 분 40 분 후
        CPB의 55 분, 45 분의 호흡, 그리고 심장 마비 (BGA4)의 20 분 후
    2. 안정적인 CPB 흐름과에서 환기를 중지 하 여 테 호흡기 체포.
    3. 환기의 종료 후 28 º C로 온난 패드를 설정 하 고 몸에 붙이기도 차가운 식 염 수에 젖은 거 즈를 사용 하 여 호흡 검거의 첫번째 20 분 내의 온도 28 º C에 동물을 냉각 시작.
    4. 일단 28 º C의 온도 달성, 그리고 호흡기 체포의 30 분의 총 후에, cardioplegia 시작 하 CPB 회로에 7.45 %KCl 용액의 0.3 mL 관리.
    5. 교차 하는 대동맥의 클램핑, 이전 배치 실크 루프 (단계 3.10) 더 나은 노출 위한 두개골 방향으로 당겨 및 대동맥의 상승 부분에 마이크로 serrefine 클램프를 배치.
    6. 총 60 분 호흡 마비 및 심장 마비의 30 분을 수행합니다. 심장의 reperfusion 시작 오름차순 대동맥에서 마이크로 serrefine 클램프를 제거 합니다. 동시에, 다시 환기 하 고 따뜻한 동물 37 ° c.
    7. Reperfusion 완료 하 고 동물에는 normothermia에 도달 했습니다 CPB 펌프를 해제 하 여 종료 하 고 계속 20 분에 대 한 생리 적 측정 (예: 체온, 심전도, 및 침략 혈압) 모니터링
    8. 실험의 끝에, exsanguinate (5 %isoflurane) 완전 취 동물 및 혈액 및 추가 분석 14 장기 수집.

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    결과

    이 프로토콜에서는 관류 회로, 수술 절차, 및 마우스의 CPB 동안 생리 적인 매개 변수 모니터링. 적절 하 게 숙련 된 microsurgeon에 의해 수행 하면 결과 지속적으로 그리고 reproducibly 얻을 수 있습니다.

    적절 한 조직 관류를 유지 하려면 평균 동맥 압력 및 여분의 볼륨의 추가 형사 요 혈을 조정 하 여 40과 60 mmHg 사이 항상 유지 됩니다. 동물, 볼륨 상태와 체온의 무게에 따라 extracorporal 혈 실험 기간 동안 볼륨 손실의 보정 회로를 못쓰게 솔루션의 0.1 mL의 추가 하 여 이루어집니다 2.3-6.5 mL/분 사이 유지 동안 형사 요. 조직의 pH 안정화 NaHCO2의 8.4 mmol/L을 추가 하 여 이루어집니다. 모든 유체는 공기 색전술의 위험을 줄이기 위해 공기 트래핑 저수지를 통해 관리 됩...

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    토론

    우리는 완전 한 기능 임상 관련 모델 CPB의 마우스를 개발 했습니다. 쥐 데 심혈 관 질환의 30 개 이상의 긴장, 우리의 모델 CPB에 관련 된 새로운 미래의 프로토콜의 개발을 위한 출발점이 될 수 있습니다. 또한, 마우스 관련 시 약 및 녹아웃 아웃 마우스의 과다 때문이 모델 있지만 대체할 수 없습니다만 CPB의 현재 쥐 모델 CPB 관련 장기 손상에 관련 된 분자 메커니즘의 해 부를 촉진 한다. 날짜 하려면, CPB 하지 마우스 마이크로 oxygenator 데 충분히 작은 못쓰게 볼륨의 개발을 포함 한 기술적인 도전 뿐만 아니라 cannulation 기법, microsurgical 문제 때문에 적용 되었습니다. 약 90도 경험이 풍부한 microsurgeon의 근 면 한 일 안정적인 모델을 달성 하기 위해 필요 했다. 다른 롤러 펌프, 튜빙, 그리고 다양 한 저수지 CPB 기계의 이상 15 프로토타입은 테스트 하 고 지속적으로 개선 했다. 10 이상 버전 다른 oxygenators의 내장 되었고 현재 결과 달성 하기 위해...

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    공개 사항

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    저자 아무 승인 있다.

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    재료

    3< / sub > 8,4 % 솔루션 B. Braun Melsungen ml
    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    SterofundinB.Braun Petzold GmbHPZN : 8609189프라이밍 볼륨, 1 : 1 Tetraspan
    Tetraspan 6 % HES 솔루션B. Braun Melsungen AGPZN : 05565416프라이밍 볼륨, 1 : 1 Sterofundin
    Heparin Natrium 25.000Ratiopharm GmbHPZN : 3029843당 2.5 IU
    AGPZN:프라이밍 용액 중 1579775 3%
    KCL 7.45 % 용액B. Braun Melsungen AGPZN:2418577 심정지 용 0.1 mL
    CarprofenZoetis Inc., 미국PZN : 00289615 088591535 mg / kg / BW
    1 Fr PU 카테터Instechlabs INC., 미국C10PU-MCA1301경동
    2 Fr PU 카테터Instechlabs INC., 미국C20PU-MJV1302경정맥
    Vasofix 안전 카테터 20GB.Braun Medical4268113S-01구강 삽관
    8-0 실크 봉합사 꼰Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA75290ligature
    IsofluranePiramal Critical Care Deutschland GmbHPZN : 9714675narcosis
    CLINITUBES 혈액 모세 혈관Radiomed GmbH51750132혈액 샘플링 60 - 95 마이크로 리터
    스프링 가위 - 6mm 블레이드Fine Science Tools GmbH15020-15기기
    스프링 가위 - 2mm 블레이드Fine Science Tools GmbH15000-03기기
    Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools GmbH13009-12기기
    Dumont #55 ForcepsFine Science Tools GmbH11295-51기기
    Castroviejo Micro Needle Holder - 9cmFine Science Tools GmbH12060-02instruments
    Micro SerrefinesFine Science Tools GmbH18555-01악기
    Bulldog SerrefineFine Science Tools GmbH18050-28기기
    마우스용 MiniVent 인공호흡기(모델 845)Harvard Apparatus73-0044기계 환기
    Isoflurane 기화기 Dräger 19.1Drä gerwerk AG & Co. KGaA마취 1.3 - 2.5%
    PowerLab 데이터 수집 장치 4/35ADInstruments Ltd, New ZealandPL3504침습적 압력, ECG, 온도
    ABL 800 FlexRadiometer GmbH혈액 가스 분석
    NMRI 마우스Charles River LaboratoriesCrl:NMRI(Han)수컷, 30 - 35 g, 12주 령, 실험 최소 1주일 전에 보관
    프라이밍 솔루션 NaHCO맥

    참고문헌

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