맨 틀 세포 림프 종 (MCL) B 세포 장애 치료 하기 어려운 이며, 그것은 동등 하 게 연구 하 고 치료제를 개발 기본 MCL의이 종이 식 마우스 모델을 설정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리 생물학의 기본을 이해할 수 있도록 마우스에 MCL xenografts의 성공적인 설립을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
B 세포는 주로 집에 면역 세포 순환에 그들은 핵심 선수 하 고 림프 기관에. 반면 정상 B 세포는 T 세포에 의해 자극 될 때만 증식, 종양 B 세포 생존과 정의 되지 않은 장기 틈새에서 자율적으로 확장. 맨 틀 세포 림프 종 (MCL)은 하나의 같은 B 세포 장애, 환자의 평균 생존 율은 4-5 년. 이는 유도 및 이러한 셀의 engraftment는 생존을 증가 하기 위하여 차단 하는 효과적인 메커니즘의 필요와 환자 들의 장 수에 대 한 호출 합니다. 따라서, 유도 장치에는 vivo에서 차단 하 여 MCL 치료제의 효능을 연구 하는 종이 식 마우스 모델을 개발 하기 위해 노력 최대 중요성 이다. 관련 전 임상 마우스 모델은 화면 새로운 치료제에 중요 한, 개발 초기 단계 약물 테스트를 인간 세포 xenotransplantation 받는 동물의 긴 추구 되어 있다. 이 동물 모델 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병에 대 한 모델 설정 개발 되 고 그것은 다른 림프 종 종류의 질병의 진행을 공부 하 고 전 임상 후보 약물에 대 한 테스트를 수행 하는 매우 유용한 도구 될 수 있습니다. 혈액 악성 종양, MCL 같은. 우리는 종이 식 마우스 모델을 연구 하 고 MCL에 대 한 새로운 치료 접근을 개발 하는 우수한 자원으로 될 것입니다 설립.
서론
자연으로 세포는 면역 감시에 중요 역할 그리고 림프 구 매매 항 원 특정 면역1,2설치에서 중요 한 단계. 이 프로세스는 naïve T 세포 혈 류를 thymus에서 그리고 동족 항 원을 만나는 2 차 림프 기관, 림프절, Peyer의 패치, 또는 비장를 포함 하 여 거기에서의 마이그레이션 포함 됩니다. B 세포 골 수에서 분화 하 고 2 차 림프 기관3의 낭으로 순진한 셀으로 마이그레이션할. 이 B 세포 중 일부는 그들의 수용 체와 항 원 바인딩 하 고 특정 T 세포에 의해 활성화 됩니다. 확산 및 B 세포의 뿌리의 맨 틀 영역으로 비-활성화, 순진한 B 셀을 푸시합니다. 활성화 된 세포 차별화할 수 있습니다 다음 메모리 B 세포, 몸, 순찰 또는 골4마이그레이션하는 플라스마 세포를 은닉 하는 면역 글로불린으로 성숙.
MCL 맨 틀 영역에서 순진한 B 림프 톨 종양으로 변환 될 때 발생 합니다. 이 림프 종 세포 림프 기관의 microenvironment에 있으며 특정 T 림프 구 제어 독립적으로 격 증. 그러나, 밀도의 특정 단계에서 그들은이 틈새에서 탈출 하 고 다른 장기에 틈새에 대 한 검색에서 혈 류에서 recirculate. 접착 분자의 복잡성과 발산 및 그들의 수용 체의 성행위, 고려이 셀룰러 밀매 vivo에서 의 메커니즘은 제대로 이해 하 고 따라서 치료를 저해. 림프 종 B 세포 새로운 microenvironments에 도달 하지 않도록 하려면이 마이그레이션 프로세스를 효과적으로 차단 하 새로운 방법 필요 합니다.
MCL B 세포 악성 종양을 치료 하는 가장 어려운 중 하나입니다. MCL의 종양 약 형의 개발 다단계 폭포, 독특한 생물 학적 속성의 취득에 의해 특징의 결과 이다. 진단의 시간, 대부분의 환자 (70%) 이미 현재 전파 질병, 비장, 골 수, 또는 위장5,6extranodal 참여 전시 하는 경우의 대다수와. 치료 환자에서 몇 년 이내에 저항 하는 종양에 의해 재발 하더라도 기존의 화학요법 유도 단기7,8에서 높은 면제 율 일반적입니다. 여기에 우리가 현재 MCL 보급의 기본 생물학을 이해 하는 것을 도울 수 있는 새로운 질병 모델: 우리는 환자의 기본 종양 세포에서 유래 하는 인간의 MCL이 종이 식 마우스 모델을 설립. 우리는이 모델 MCL 보급에 대 한 치료 전략을 개발 하 고 가능 하 게 최적의 진단 및 재발 환자의 치료에 대 한 새로운 임상 원근법을 제공 도움이 될 것입니다 바랍니다.
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프로토콜
인간의 혈액 샘플은 로컬 윤리 제네바 대학 병원의 인간 실험 위원회에 의해 승인 절차에 따라 사용 되었다.
동물 절차는 기관 윤리 위원회의 동물 관리 제네바, 스위스 및 Cantonal 수의 사무실에 따라 수행 했다 (승인 번호: GE/26/15).
1. 밀도 그라데이션 분리 하 여 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비
참고: 말 초 혈액의 3-5 mL MCL leukemic 단계에서 제시 하는 환자에서 얻은 했다. 진단 그리고 염색체 전 좌 t(11;14)의 존재와 D1의 overexpression에 의해 확인 이후에 cytometry (CD5 +, CD23−, CD200 +, 단일 클로 널 B 세포 인구)에 대 한 표준 진단 기준에 따라 설립 되었다. 모든 경우에 단일 클론 B 세포를 구성 > 총 B 세포 인구의 90%. 나머지는 monocytes 그리고 몇몇 T 세포 주로 했다.
- 로스웰 파크 기념 연구소 매체 1640 (RPMI) (그림 1A)의 5 mL로 MCL 혈액 샘플의 (1:1) 5 mL를 희석.
- 철저 하 게 혼합 되도록 사용 하기 전에 여러 번 밀도 그라데이션 미디어 (자료 테이블) 반전.
- 피 펫 흡 인기를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 밀도 그라데이션 미디어는 흡 인기 (혈액 밀도 그라데이션 미디어 비율을 2:1, 예를 들어, 밀도 그라데이션 미디어의 5 ml는 혈액 10 mL 이어야 한다)를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브를 통해 희석된 혈액 샘플 레이어. 한다 주의 하지 믹스 (그림 1B, C) 두 개의 레이어.
- 원심 브레이크 해제와 함께 실 온에서 40 분에 대 한 400 x g에서 샘플을 원심.
- 중간 계층 (약간 흰, 얇은 반지 화살표 (그림 1D, E)으로 표시)을 발음 부드럽게 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 단 세포를 포함 하 고 깨끗 한 관으로 그들을 전송.
- 단 셀의 세척
- 전송 된 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 예측 하 고 그것에 추가 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 살 균 1의 3 볼륨.
- 여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 현 탁 액을 혼합.
- 실 온에서 10-15 분 400-500 x g에서 정지 원심
- 셀 공 세척 단계를 다시 반복 하는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 상쾌한을 제거 하 고 원하는 볼륨, 예를 들어, 1 또는 2 mL PBS의 셀 resuspend.
- 자동된 셀 카운터 또는 수동으로 hemocytometer (Neubauer 챔버)을 사용 하 여 셀의 개수를 계산 합니다.
2. B 세포 부정적인 선택에 의해 B 세포의 농축
- 50 x 106 셀/mL의 최종 농도에 셀 PBS에 희석.
- 하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 셀을 전송. 세포 현 탁 액 2 mL를 B 세포 농축 키트에서 항 체 칵테일의 100 µ L을 추가 하 고 (그림 2-1) 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.
- 10 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.
- 짧게 소용돌이 자석 입자 키트에 제공 된는 B 세포 농축 30 s (그림 2-2). 샘플의 2 mL에 자석 입자의 150 µ L를 추가 합니다.
- 실 온에서 또 다른 5 분에 대 한 샘플을 품 어.
- 1 x PBS 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 2.5 mL를 샘플 볼륨을 가져와. 자석에 튜브를 놓고 또 다른 3-5 분 (그림 2-3)에 대 한 튜브를 품 어.
- 장소, 그리고 하나의 연속 모션 튜브와 자석까지, 풍부한 세포 현 탁 액을 신선한 튜브 (그림 2-4) 수집할 튜브를 가만히 따르다. 자동된 셀 카운터 또는 B 세포의 총 수익률을 얻을 수 있는 hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀을 계산 합니다.
참고: 일반적으로 수익률은 ~ 105 B 셀/mL 정상 B 세포와 106 셀/MCL l x 5-50. - B 세포 농축의 순도 확인
- 받아 ~ 50000 셀 안티-CD19/CD20 항 체와 세포를 품 어 고 (1시 20분 희석)와 안티 CD45 항 체 결합 다른 형광 (1시 10분 희석) 15-30 분 동안 실내 온도에.
- PBS + 1% BSA x 1의 1 mL로 세척 하 고 400-500 x g 5 분 동안에 세포를 원심 resuspend ~ 200 µ L의 PBS에 셀.
- Cytometry에 의해 셀 샘플을 확보 하 고 B 세포의 순도 대 한 분석. 순도 대부분 > 90%가이 방법 (그림 3).
3입니다.이 종이 식 마우스 모델의 개발
- 1 x PBS (마우스 당 주사 하는 데 필요한 볼륨)의 150-200 µ L에 106 셀 x 40-60을 일시 중단 합니다.
- 세포 현 탁 액의 150 µ L를 정 맥 주사 (i.v.) (그림 4A) 성별에 관계 없이 오래 된 6-7 주 immunodeficient 끄 덕 scid 감마 (NSG) 쥐의 꼬리 정 맥 각에.
- 쥐 인간 림프 종 ~ 10 주에 대 한 개발을 허용 합니다.
참고: 기본 인간 림프 종 세포 인간 림프 종 세포 라인 (3 주)에 비해 종양 개발에 훨씬 더 오래 걸릴. - 동물 체중 감소 같은 치명적인 질병의 증상을 보여 시작, 뻗 치고 머리, 감소 활동, 뒷 다리 마비, 등, 희생 쥐 CO2 질 피를 심장 심장 찔린 다음에 의해.
- 수집 다른 쥐를 해 부하 여 골 수, 비장, 그리고 간 같은 기관과 종양 engraftment 분석에 대 한 희생의 때에는 심장에서 혈액을 그리기에 의해 말 초 혈액을 수집 (그림 4B -F).
4. chimerism 분석 Engrafted 다른 장기에 종양 세포의
- 다른 장기를 수집한 후 기계적 장애 적혈구 (RBC) 세포 혈액 및 골 수, 비장, 대 500 µ L 간 2 mL에 대 한 염화 염화 칼륨 버퍼 x 1의 200 µ L를 사용 하 여 다음 단일 셀 정지를 생성 하 여 처리 .
- 계산 하 고 인간 B 세포 특정 항 체, 즉, 안티-CD19, 안티-CD20, 및 안티-CD45를 사용 하 여 셀을 얼룩.
참고: NSG 마우스 부족 B 세포 그리고 그러므로 분석에 대 한 셀은 스테인드 인간의 특정 B 세포 마커. - Cytometry에 의해 게이팅 (CD19 + CD20 +, CD45 +) B 세포에 의해 각 기관에서 파생 된 세포를 분석 합니다.
- 4.3 (그림 4G) 단계에서 표시 된 대로 문이 셀에 따라 MCL 주입 마우스에서 파생 하는 다른 장기에 engrafted 종양 세포를 계량.
주: 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
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결과
원고는 engraftment MCL 셀의이 종이 식 마우스 모델의 성공적인 개발을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. (이 경우 MCL 셀에), 순수한 셀 인구의 준비는 매우 성공적인 MCL xenografts 개발에 중요 한 이다. 그림 1 밀도 그라데이션 분리에 의해 MCL 환자 혈액에서 단 세포 격리에 대 한 대리점 단계를 나타냅니다. 단 세포 쥐에이 종이 식 주입에 대 한 순수한 세포 인구를 부정적인 B 세포 농축 키트를 사용 하 여 순수 B 세포를 더 처리 됩니다. 위해서는 성공적인 MCL engraftment 최대 순도를 주의 한다. 이 메서드를 사용 하 여 얻은 순도 보통 > 90%. 나머지는 주로 monocytes 그리고 몇몇 T 세포 (데이터 표시 되지 않음) 했다.
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토론
임상 약물 개발의 고급 단계에 있지만 약물 발견에 사용할 수 없습니다 수 있습니다. 인간 세포 xenotransplantation 동물 받는 초기 단계 약물을 테스트 하기 위해 개발 하는 노력 추구 오래 있다. 여기 우리가 제시 하는 동물 모델을 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병, MCL 같은 모델을 설정할 수 있습니다. 현재 인간의 종양 engraftment 및 종양의 성장 메커니즘 연구의 종이 식 모델입니다. 여기 우리는 NSG 마우스 림프 종 engraftment의 더 중대 한 성공을 달성 하기 위하여 날짜를 가장 면역 결핍 마우스 모델 중 하나를 사용 합니다. NSG 마우스 부족 성숙한 T 세포, B 세포, NK 세포. 그들은 또한 cytokine 신호 장애 있다 하 고 타고 난 면역 반응에 있는 결함.
밀도 기울기에 의해 기본 MCL 샘플에서 림프 구 준비는 적혈구 및 혈소판 같은 다른 셀 형식을 제거 하는 중요 한 단계 이다. 전통적으로, 조밀도 기온 변화도...
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 리그 Genevoise 죄수 르 암에 의해 지원 되었다 Fondation 박사 뒤부아 Ferriere Dinu Lipatti, Oncosuisse KPS OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, 스위스 국립 과학 재단 그랜트 31003A_156760 및 310030 153456.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ficoll-paque 매체 | GE Healthcare | 17-1440-02 | 단핵 세포 분리를 위한 |
| RPMI 매체 1640 | Gibco-Life technologies | 61870-010 | 혈액 샘플 희석용 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | 세포 세척 |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | 분리 중 세포 세척에 사용되는 1% BSA로 PBS 제조용 |
| CD19-APC700 | 벡크만쿨터 | B49212 | human pan-B cell marker |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | human pan-B cell marker |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | human pan-B cell marker |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | human T cell marker |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | MCL에 일반적으로 없는 세포 표면 단백질 |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Pan-leucocyte marker |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | 에 일반적으로 없는 세포 표면 단백질 |
| , 이 연구 | |||
| 에서 MCL 이종이식편을 개발하는 데 사용된 Charles River Laboratories 5557Easy sep Human B cell enrichment kit | 줄기 세포 기술 | 19054 | B 세포를 농축하여 마우스에 주입하기 위한 순수 세포를 얻는 데 사용됨 |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | MCL 샘플을 특성화하고 MCL 생착을 위한 기관을 연구하는 데 사용됨 |
| 1X 염화암모늄 칼륨 완충액 | 완충액(NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; 에디타. Na2&중간 점; 2H2O 3.722 마그네슘/L ) |
참고문헌
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