Method Article

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

DOI:

10.3791/56026

⸱

September 7th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

In This Article

Summary

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C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

Abstract

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칼슘 지표의 사용은 크게 신경 역학 및 규칙의 우리의 이해를 강화 했다. 완전히 매핑된 신 경계와 투명 한 해부학, 선 충 류 꼬마 선 충, 칼슘 표시기를 사용 하 여 실시간 신경 역학을 이해 하기 위한 이상적인 모델을 제공 합니다. 미세 기술 및 실험 설계와 함께, 자유로운 이동 및 덫을 놓은 동물 칼슘 이미징 연구가이 표시기를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나, Chronis 그 외 여러분에서 설명한 후 각 칩 등의 트랩 장치를 이용 하 여 대부분 이전 연구는 보다 적게 일반적인 남성은 둘 다 형태학 상으로 그리고 구조적으로 더 일반적인 자웅 동체에 사용 하기 위해 설계 된 장치 비슷하지. 적응된 후 각 칩 설계와 젊은 성인 동물을 사용 하 여 남성 신경 이미징에서 증가 효율성에 대 한 조작. 차례는 웜 포트 동물 회전 하 고 2D 영상에서 양측 쌍 개별 뉴런의 분리에 대 한 로드로 통합 되었다. 벌레는 자웅 동체 연구 이전에 설명 된 대로 odorant 미세 소자 내에서 제어 흐름에 노출 됩니다. 칼슘 과도 다음 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 여기에 설명 된 절차는 남성 기반 C. 선 충 의 증가 금액에 대 한 허용 해야 칼슘 이미징 연구, 섹스 관련 신경 신호 전달의 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 심화.

Introduction

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미세 장치 증가에 액세스할 정확 하 게 제어 환경의 점에서 동물, C. 선 충, 선 충 류 실험적 조작된1수와 같은. 이러한 연구는 행동 분석, 칼슘 이미징 연구, 또는 특정 고기, 실험 결과1,2,3,4,의 더 정확한 측정 결과 대 한도 검 진 5,6. 마이크로 소규모 액체 상태는 상세한 실험 시 약의 최소한의 금액을 이용 하는 동안 실행 될 수 있습니다 제공 합니다. 거기는 새로운 미세 장치 디자인의 지속적인 생산 다르며 각각의 사용, 자연 정현파 모션 C. 선 충 의 행동 분석 및 신경 영상 연구, 신경 이미징에 사용 되는 장치를 함정을 허용 하는 경기장에서 그리고 후 각 연구, 유전자에서 높은 처리량 phenotypic 분석 화면4,5,....

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Protocol

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1. 장치 제조

참고: 참조 참조 1.

참고: 실리콘 마스터 금형 실리콘 마스터 1 , 7 수 8 포토 레지스트 패터 닝에 대 한 표준 photolithographic 기법을 사용 하 여 날조 했다. 웨이퍼 패턴에 대 한 포토 25000 dpi에서 인쇄 되었다. 남성 적응 장치 기능 Chronis 후 각 칩 디자인 변화는 웜 포트 로드, M. 짐머 (개인 통신, 2016)에서 얻은 디자인을 적응에 19. 차례 동물의 회전을 제어 하는 포함 되어 있습니다. 포트 채널을 로드 하는 벌레의 폭은 50 μ m로 좁혀 졌다. 모든 채널은 32 μ m 높이 이다. 실리콘 마스터 몰드는 사용자에 게 제공 되 면 사용자는 후속 따를 수 프로토콜, 앞에서 설명한 1.

  1. 무게에 의해 10:1 비율로 믹스 PDMS 기본 및 경화 에이전트.
  2. 전송 펫으로 철저 하 게 혼합.
  3. 모든 보이는 거품 제거 될 때까지 1 시간에 대....

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Results

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그림 1A-B에서 전체 장치 설치의 예를 볼 수 있습니다. 그림 1A 는 적절 한 저수지 건설 및 설치를 보여 줍니다. 그림 1B 미세 장치에 저수지의 연결을 보여 줍니다. 그림 1C 는 개별 포트 선명도 대 한 분류와 미세 장치를 묘사 한다.

남성 적응 미세 장치 디자인 로드 포트에 곡선을 포함 되어 있지만 흐름 역학은 Chronis에 의해 설계 된 장치에 동일 외.19(-2 C그림 2A

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Discussion

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남성 적응 후 각 칩 좁은 로드 포트 방향 제어 및 남성 C. 선 충의 효율적인 트래핑 수 있는 회전을 채택 하고있다. Z-스태킹에 대 한 필요 없이 신경 양자 쌍의 왼쪽 및 오른쪽 회원의 시각화에 대 한 수 있습니다. 이 곡선 벌레에 시간의 수직 100% 떨어져 방향을 하나의 양자 쌍 재 (그림 2D-E)29,30같은 형광 표시와 함께 대상으로 리드. 그러나, CEM, 같은 4 개의 광선으로 대칭 신경 세포와 신경 클래스에서 모든 4 개의 신경 세포는 볼 수 단지 1 / 3의 시간. 또 다른 3 분 테스트 벌레의 표시, 4 개의 뉴런의 고 나머지 3만 3만 구별할 수 차이 등 쪽과 복 부 셀 시체, 좌우 비대칭 (데이터 표시 되지 않음) 하지 사이. 좁은 포트는 z 축에 걸쳐 웜 동요를 방지 하기 위해 낮은 채널 높이와 결합.......

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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우리는 마누엘 짐머 남성;와 사용을 위해 적응 시켰다 초기 디자인 파일 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 합성 및 ascr #3;의 공급에 대 한 프랭크 슈뢰더 로스 Lagoy 통찰력 및 영상 및 분석; 그리고 크리스토퍼 낙하산, 함께 마스터 제작 및,로 라 Aurilio이이 원고 검토에 기여. 이 작품에 대 한 자금 국립 보건원 그랜트 1R01DC016058-01 (제), 국립 과학 재단 부여 CBET 1605679 (D.R.A.), 및 버로우즈 Wellcome 경력 수상 과학 인터페이스 (D.R.A.)에서 제공 했다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
실리콘 웨이퍼대학 웨이퍼452
SU-8 2035MicroChemY111070-0500L1GL
개발자MicroChemY020100-4000L1PE
웨이퍼 마스크Cad/Art Services-맞춤 주문. 25,000dpi로 인쇄됩니다.
Sylgard-184Ellsworth 접착제184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0mm 피부 펀치Acuderm Inc.P150
소프트 튜빙콜-팔머EW-06419-01
하드 튜빙IDEX 건강 & 과학1622
핀뉴잉글랜드 소형 튜브NE-1027-12
차단 핀뉴잉글랜드 소형 튜브0.415/0.425" OD x .500 롱배치 PB07027
3mL 주사기BD309657
30mL 주사기바이탈리티 의료302832완충 저장소로 사용됩니다.
스테인레스 스틸 블런트 니들 23 게이지, 폴리프로필렌 루어구성 요소 공급 회사NE-231PL-50
루어 연결이 있는 스톱콕; 3-방향; 남성 잠금; 5 플로우 패턴; 비멸균Cole-PalmerEW-30600-07
Fisherfinest 프리미엄 커버 유리Fisher Scientific12-548-5M
메르카토르 제어 시스템 LF-5 플라즈마 시스템메르카토르LF-5
스카치 테이프스카치BSN43575
시리즈 20 챔버워너 인스트루먼트P-2
진공 건조제Bel-Art Scienceware420250000내경 24cm
무게 보트Cole-PalmerEW-01017-27
Classic Plus BalanceMettler ToledoPB1501-S/FACT
유리 파스퇴르 피펫Cole-PalmerEW-25554-06
트랜스퍼 피펫Genesee Scientific30-202
OvenSheldon Manufacturing Inc9120993모델 번호: 1500E.
60mm, 비통풍식, 날카로운 모서리 페트리 접시TriTech ResearchT3308
Zeiss Axio Observer.A1Zeiss-Hammamatsu
Orca Flash 4.0 Digital CMOSHammamatsuC11440-22CU
Blue FluorescentLumencorSOLA SM6-LCR-SA24-30V/7.9A DC.
조명 어댑터Zeiss423302-0000
시리즈 1 및 2 소형 불활성 PTFE 차단 밸브Parker001-0017-900유량 제어용 3방향 밸브.
ValveLink8.2®AutoMate Scientific01-18유량 스위치 컨트롤러
Micro ManagerMicro-Manager-Free소프트웨어, 다운로드 위치: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJImageJ-Free소프트웨어, 다운로드 위치: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological GradeApex9012-36-6
펩톤에이펙스20-260
CaCl2VWRBDH0224-1KG
MgSO4Sigma-Aldrich230391-1kg
콜레스테롤Alfa AesarA11470
에탄올Sigma-Aldrich270741-4L
테트라미솔Sigma-AldrichL9756-10(G)4 °C.에 보관하십시오.
플루오레세인시그마-알드리치FD2000S-250mg감광성. 광보호용 바이알에 보관하십시오.
글리세롤시그마-알드리치G6279-1L
아스카로사이드 #3--슈뢰더 연구실(코넬 대학교)에서 합성.
NaClGenesee Scientific18-215
KH2PO4BDHBDH9268.25
K2HPO4J.T. Baker3252-025
ASH GCaMP3 line--CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Bargmann 실험실에서 개발. 알브레히트 연구소 도서관에서 제공.
CEM GCaMP6 라인--JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Robyn Lints가 개발했습니다. Srinivasan Lab 라이브러리에서 제공했습니다.
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics CenterOP50
"Reservoir"--To create a Reservoir: "30 mL syringe"는 "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile"에 연결되며, 이는 "3 mL syringe" 및 "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge"에 연결됩니다. 폴리프로필렌 루어". 그런 다음 "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer"를 바늘 아래의 약 1/3 지점에서 "Soft Tubing"에 삽입합니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
  2. Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H.

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