남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

Summary

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

Abstract

칼슘 지표의 사용은 크게 신경 역학 및 규칙의 우리의 이해를 강화 했다. 완전히 매핑된 신 경계와 투명 한 해부학, 선 충 류 꼬마 선 충, 칼슘 표시기를 사용 하 여 실시간 신경 역학을 이해 하기 위한 이상적인 모델을 제공 합니다. 미세 기술 및 실험 설계와 함께, 자유로운 이동 및 덫을 놓은 동물 칼슘 이미징 연구가이 표시기를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나, Chronis 그 외 여러분에서 설명한 후 각 칩 등의 트랩 장치를 이용 하 여 대부분 이전 연구는 보다 적게 일반적인 남성은 둘 다 형태학 상으로 그리고 구조적으로 더 일반적인 자웅 동체에 사용 하기 위해 설계 된 장치 비슷하지. 적응된 후 각 칩 설계와 젊은 성인 동물을 사용 하 여 남성 신경 이미징에서 증가 효율성에 대 한 조작. 차례는 웜 포트 동물 회전 하 고 2D 영상에서 양측 쌍 개별 뉴런의 분리에 대 한 로드로 통합 되었다. 벌레는 자웅 동체 연구 이전에 설명 된 대로 odorant 미세 소자 내에서 제어 흐름에 노출 됩니다. 칼슘 과도 다음 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 여기에 설명 된 절차는 남성 기반 C. 선 충 의 증가 금액에 대 한 허용 해야 칼슘 이미징 연구, 섹스 관련 신경 신호 전달의 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 심화.

Introduction

미세 장치 증가에 액세스할 정확 하 게 제어 환경의 점에서 동물, C. 선 충, 선 충 류 실험적 조작된¹수와 같은. 이러한 연구는 행동 분석, 칼슘 이미징 연구, 또는 특정 고기, 실험 결과^1,2,3,4,^{의 더 정확한 측정 결과 대 한도 검 진 5,6}. 마이크로 소규모 액체 상태는 상세한 실험 시 약의 최소한의 금액을 이용 하는 동안 실행 될 수 있습니다 제공 합니다. 거기는 새로운 미세 장치 디자인의 지속적인 생산 다르며 각각의 사용, 자연 정현파 모션 C. 선 충 의 행동 분석 및 신경 영상 연구, 신경 이미징에 사용 되는 장치를 함정을 허용 하는 경기장에서 그리고 후 각 연구, 유전자에서 높은 처리량 phenotypic 분석 화면^4,5,,67대 한 허용 하는 장치. 마스터 몰드의 제작, 다음 미세 장치는 건설 비용이-마스터의 재사용성을 제공-사용 하기 쉬운, 높은 처리량 연구를 통해 빠른 데이터 생성에 대 한 허용. 등입니다 (PDMS) 폴리머를 사용 하 여 장치의 제조 시간 이내 신제품의 창조에 대 한 수 있습니다.

칼슘 이미징 연구 대상 세포에 표현 된 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)를 사용 하 여 실시간으로^8,9,,1011에 그 세포의 신경 역학 측정. C. 선 충 의 투명 한 자연 동물에이 단백질의 형광 레벨의 기록에 대 한 수 있습니다. GECIs 녹색 형광 단백질 (GFP)을 의존 하는 전통적으로,-하지만 더 최근의 연구 더 나은 신호 대 잡음 비율 및 레드 이동 여기 프로필 있도록 이러한 센서 적응 센서 GFP Calmodulin M13 펩 티 드 (GCaMP)를 기반으로. GCaMP3의 개발에 따라 단백질이 규격 다양, GCaMP6s 및 GCaMP6f 같은 센서를 포함 하 여 (느린 빠르고 형광 오프 비율, 각각), RFP Calmodulin M13 펩 티 드 (RCaMP), 뿐만 아니라 빨간색 이동 있다 활성화 프로필입니다. C. 선 충 세포 관련 유전자 발기인 시퀀스와 이러한 GECIs 조합의 관심사, 특히 감각 신경^12,13,,1415 의 세포를 타겟팅 할 수 있습니다. ^{, 16}.

미세 연구에 선 충 C. 사용의 용이성 명백한 동안, 거의 모든 연구는 광고에 나온 것에 집중 했다. 남성만 0.01-0.02에 대 한 회계에 불구 하 고 야생 형식 인구의 %, 귀중 한 발견 그들의 특성에서 발생할 수 있습니다. 자웅 동체 신경 시스템의 물리적 텀 수십 년¹⁷완벽 하 게 매핑 되었습니다, 반면 남성 텀 동물¹⁸의 머리 지역에서 특히 불완전, 남아 있습니다. 칼슘 이미징 남성에서의 사용은 남성 신 경계와 두 남녀 사이 발생 하는 차이 대 한 이해를 생성 하는 데 도움이 됩니다. 선 충 C. 성인 남성의 더 작은 크기는 큰 광고에 나온 것을 위한 전통적인 후 각 장치의 로드 포트에 효과적이 고 신뢰할 수 있는 트래핑 방지할 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 Chronis 후 각 칩¹⁹ 의 수정된 된 버전 좁은 로드 포트, 낮은 채널 높이, 개발 되었다 고 웜 로드 포트 (이 동물 회전), 양자 왼쪽/오른쪽의 시각화에 대 한 허용에 신경 쌍입니다. 이 디자인 허용: 젊은 성인 남성 (1) 효과적인 트랩핑, 양자 쌍된 뉴런의 두 멤버와 남성 뉴런에서 신경 활동의 정확한 영상 (3)의 시각화에 대 한 동물의 보다 안정적인 방향 (2).

점점, 연구 선 충 C. 남성 ascarosides (ascr), 또는 선 충 류 페로몬^{20,,2122,23의 다양 한 광고에 나온 것 보다 다르게 응답 표시 ,24}. 따라서, 신경 역학과 남성 텀 내 표현에 대 한 이해를 개발 훨씬 더 관련 되고있다. 남성 선 충 C. 포함 자웅 동체^25,26에 없음 87 섹스 관련 신경으로에 텀을 변경-아직 불확 실한 방법. 이러한 독특한 신경 역학 이미지를 수 있는 더 나은 섹스 관련 응답 및 신경 표현 이해 하 고 우리 수 있습니다.

이 프로토콜은 남성 C. 선 충 의 신경 영상에 대 한 남성 적응 후 각 칩의 사용을 설명 합니다 chemosensation. 재 1 M 글리세롤 남성, 이전 일치에 자웅 동체에 안정적으로 응답 nociceptive 신경 연구²⁷. Ascarosides에 노출은 변수 동물 동물에서 시험 될 동물의 많은 수를 요구 하는 응답을 유도 수 있습니다. 남성 전용 CEM 뉴런의 응답 이전 표시 되었습니다, 전기 생리학 및 칼슘 이미징 연구를 통해 변함없이 ascaroside #3²³응답.

Protocol

1. 장치 제조

참고: 참조 참조 ¹.

참고: 실리콘 마스터 금형 실리콘 마스터 ^{1 , 7} 수 8 포토 레지스트 패터 닝에 대 한 표준 photolithographic 기법을 사용 하 여 날조 했다. 웨이퍼 패턴에 대 한 포토 25000 dpi에서 인쇄 되었다. 남성 적응 장치 기능 Chronis 후 각 칩 디자인 변화는 웜 포트 로드, M. 짐머 (개인 통신, 2016)에서 얻은 디자인을 적응에 ¹⁹. 차례 동물의 회전을 제어 하는 포함 되어 있습니다. 포트 채널을 로드 하는 벌레의 폭은 50 μ m로 좁혀 졌다. 모든 채널은 32 μ m 높이 이다. 실리콘 마스터 몰드는 사용자에 게 제공 되 면 사용자는 후속 따를 수 프로토콜, 앞에서 설명한 ¹.

1. 무게에 의해 10:1 비율로 믹스 PDMS 기본 및 경화 에이전트.
2. 전송 펫으로 철저 하 게 혼합.
3. 모든 보이는 거품 제거 될 때까지 1 시간에 대 한 진공 desiccator에 섞어 드.
4. 두께 5 mm (100 g) 때까지 150 m m 직경 접시에 실리콘 몰드 마스터에 혼합물을 부 어. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 모든 거품 또는 혼합물에 도입 된 먼지 제거.
5. 적어도 3 h, 또는 하룻밤 65 ° C에서 구워.
6. 메스를 사용 하 여 금형에서 PDMS를 잘라내어 별도 장치를 떨어져 면도날을 사용 하 여 잘라.
7. 1mm 피부 펀치와 인 레트와 출구 구멍을 펀치.
8. 플러시 dH 구멍 ₂ O, 에탄올, 그리고 다시 dH ₂ O는 펀치에서 입자를 제거 하. 에 어 스트림 펄스에서 장치 건조.
9. 채널 측 및 어떤 먼지 또는 성공적인 접합 수 있도록 장치에 남아 있는 파편 제거 접착 테이프로 장치의 위쪽 청소.
10. 플라즈마-본드 장치, 제 1 덮개 유리, 채널 사이드.
    1. 노출 커버 유리 및 장치 (채널-쪽) 공기 플라즈마 100 W 30 같은 적절 한 결합을 허용 하는 조건을 사용 하 여 s 또는 24 W 60에 대 한 s.
       참고: 설정은 결합 효율을 향상 시키기 위해 조정할 수 있습니다. 플라즈마-결합 조건이 결합 효율을 개선 하려고 할 때 적절 한 청소 만큼 중요있지 않습니다. 이상적인 플라즈마 조건 에서도 충분 청소 장치 채권 하지 것입니다.
    2. 5 손가락으로 아래로 장치 및 보도 채널 쪽으로 커버 유리를 반전 미

2. 준비를 버퍼

1. Dilute 1 살 균 10 배 재고에서 S 기초 (100 m m NaCl 및 0.05 M KPO ₄, pH 6.0) x.
2. 모든 버퍼 솔루션에 대 한 1 M 1 m m S 기초 x 1에서의 최종 농도 tetramisole 재고 희석.
3. Fluorescein 둘 다 추가 " 흐름 제어 "와 " 버퍼 " 저수지.
   1. S 기초 x 1에 100 mg/mL 재고 fluorescein 만들기.
   2. 흐름 제어에 1 µ g/mL 및 버퍼에서 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 재고 희석.
4. 자극을 만듭니다.
   1. 1 M S 기초 X 1에서의 최종 농도에 희석 글리세롤.
   2. S 기초 X 1으로 1 µ M의 최종 농도를 희석 ascaroside #3 (ascr #3).

3. 장치 설치

참고: ¹ 참조.

그림 1. 미세 장치 설치. (A) 저수지 및 튜브 30 mL 주사기 플런저 역할 수 없이 " 저수지. "이 세 가지 흐름 옵션 Luer 밸브에 연결. 다른 미세 장치에 연결 하는 튜브에 삽입 된 바늘 (오렌지)에 연결 하는 동안 1 개의 출구 3 mL 주사기 플런저와 연결 된다. (B) 전체 이미징 실험 미세의 설정. 소자 대물 렌즈 위에 거꾸로 epifluorescence 현미경의 단계에 배치 됩니다. " 흐름 제어 " 버퍼 설정 위의 선반에 장치에 의해 제어 되는 3 방향 밸브를 통해 여행. 라인 버퍼를 포함 하는 다음 적절 한 장치 포트에 삽입 됩니다. (C) 미세 소자의 포트. " 흐름 제어 " 포트 측면 다른 입구 포트:는 " 자극 " 및 " 버퍼 " 포트. " 콘센트 "는 가장 오른쪽 포트. 웜 로드 경기장의 위치는 " 웜 로드 " 포트는 장치에서 중앙 대부분 포트입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1. 준비 3 3 mL 주사기 및 바늘 ( 그림 1A)에서 뿐만 아니라 루어 밸브에 연결 된 3 방향 Luer 밸브, 30 또는 60 mL 주사기를 연결 하 여 유체 저수지. 미세 장치 확장 튜브에 바늘을 연결 ( 그림 1A에서 -B).
2. 저수지와 배관에서 공기 방울을 제거.
3. S 기초 x 1과 연결 된 튜빙 3 mL 주사기를 콘센트에 삽입 포트
4. 버퍼 입구 구멍의 상단에 표시 될 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.
5. 적절 한 입구 구멍에 흐름 제어, 버퍼 및 자극 튜브를 연결 ( 그림 1B에서 -C), 액체 방울 로드 포트에 있는 지를 확인 구멍과 첨부 버퍼 튜브.
6. 방울 벌레 로드 포트 입구에에서 나타날 때까지 출구 포트에 연결 된 주사기를 다시 부드럽게 압력을 적용.
7. 포트 로드 벌레에 단단한 차단 핀을 삽입
8. 출구 포트에서 주사기를 제거 하 고 집 진공 (-670 Torr)에 연결 하는 콘센트 라인 연결.
9. 검사 흐름에 어떤 거품에 대 한 장치 채널, 시각 및 카메라와 호환 하는 소프트웨어를 통해 비디오 확인을 통해 사용, 오픈-소스 소프트웨어 마이크로 유 등. 마이크로-Manager를 사용 하 여에 대 한 도움말 6 단계를 참조 하십시오.
   1. 어떤 거품이 있으면 기다리는 그들을 꺼내 려 하는 PDMS에 흡수 될 어떤 동물을 로드 하기 전에 벽, 거품의 존재는 장치를 통해 체액의 적절 한 흐름을 방해 합니다.
10. 장치 내에서 적절 한 흐름 역학 확인 GFP 필터를 사용 하 여 웜 3-방향 밸브를 움직이는 버퍼의 관찰을 로드 하기 전에.
    1. 결정 적절 한 흐름 역학: 흐름 제어 및 버퍼 솔루션에 fluorescein 관찰 ( 그림 2D -2E) 컨트롤을 눌러 흐름 제어 값이 변경 될 때 변경 3-방향 밸브 밸브 링크 ( 그림 1B)에 해당 하는 버튼.
    2. 마이크로 관리자를 연 후에 클릭 " 라이브 " 소자의 라이브 이미지를 관찰 하는 것. 장치에서 버퍼의 흐름을 관찰 하는 형광 광원 설정 ( 그림 2D -2E).

그림 2: 한 남자 적응 미세 후 각 칩 했다. 장치는 벌레는 노출 될 경우의 (A) 흐름 패턴 버퍼를. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. 포트 로드 웜 웜 오리엔테이션의 더 나은 제어 곡선을 포함 적응 되었습니다. (B) 흐름 벌레 자극에 노출 되 면 소자의 패턴. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. (C) 조작으로 적응된 장치의 측량. 포트 로드 웜 남성 폭을 위한 50 µ m 채널 여 42 µ m에 끝납니다. 채널의 측정된 높이 디자인 25 µ m의 목표에도 불구 하 고 32 µ m입니다. (D-E) A 갇혀 남성 표현 p sra-6:: GCaMP3. Sra 6 발기인 재 관련, 그리고 비록 아무 칼슘 과도 ASI에 관찰 했다 일부 식 ASI 신경에서 관찰 될 수 있습니다. 반면 (E) 형광 이미지 (D) 밝은 분야 및 형광 조명의 조합입니다. 스케일 바는 강력한 신경 활동 42 µ m. (F)는 재 신경 응답을 1 M 글리세롤 자극을 나타냅니다. 파란색 영역 1 M 글리세롤 자극의 시간을 나타냅니다. 음영 처리 된 영역 나타냅니다 표준 오차, n = 7 벌레에서 20 펄스. 붉은 흔적이 depolarizing 응답을 나타냅니다. y 축의 δ/F ₀을 표시합니다. 눈금 막대를 5 나타냅니다 s. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 동물 준비

참고: 참조 참조 ²³.

1. 이미징 재 응답 1 M 글리세롤. P sra-6에 대 한 긍정적인
2. 장소 약 20 C. 선 충
   남성:: 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 접시에 GCaMP3 배열 식 OP50 대장균의 잔디와 시드. 형광 GECI의 표현 및 공동 주입 마커를 사용 하 여 배열-긍정적인 동물의 식별에 대 한.
   참고: 배열 긍정적인 동물 사용 GECI에 따르면 형광 것입니다 (즉, 동물을 표현 하는 GCaMP 것입니다 형광 블루 빛 자극, 아래 녹색 RCaMP 동물 그린 빛 자극 아래에 빨간색 형광 것입니다 하는 동안). 공동 주입 마커 phenotypic 마커, rol-6, 같은 다른 형광 단백질, GFP와 RFP, 등에서 배열할 수 있다 또는 pha-1 돌연변이 ²⁸ 같은 지배적인 표현 형을 구출 하실 수 있습니다.
   1. 따기 직전 분석 결과, 젊은 성인 남성을 선택 하는 경우
      . 만약 전날 분석 결과, L4 애벌레 남성 선택.

이미징 CEM 응답 1 µ M ascr #3.

1. 선택 약 20 L4 C. 선 충 수 컷 (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1 (e2123ts); 그-5 (e1490); 라이트-1 (ce314)) 그는 dsRed 공동 주입 식 표식에 대 한 긍정적.
   참고: 남자 이야기의 광선 신경 내 dsRed 식을 관찰 하 고 4 개의 CEM 뉴런 내에서 GCaMP 식 보다 확인 쉽습니다.
2. 이미징 실험을 수행 하기 전에 5-14 h OP50 대장균의 잔디와 시드 NGM agar 접시에 광고에 나온 것에서이 남성 분리.
   참고: 남성 5 h의 최소 절연 하지 행동 ascr # 3에 응답 하지 않는 및 따라서 여기 관찰 보다는 ascaroside에도 적은 칼슘 과도 전시 수 있습니다.

5. 동물 로드

참고: refefence ¹.

1. 표준 웜 유지 관리 기술을 사용 하 여 한 unseeded NGM 천 배지 위에 한 웜 선택.
2. 선택
   벌레는 (병합 된 백 금 철사로 만든), 선택, 선택에 박테리아를 따기 불타는 여 고 " dabbing " 그것을 데리 러 벌레. 부드럽게 장소 자체에서 크롤링할 수 있도록 하는 새로운 접시에 웜.

접시가 홍수 같은 unseeded 접시에 S 기초 x 1의 약 5 mL을 추가.

S 기초 x 1 미리 채워진 된 로드 주사기 (즉, 연결 된 튜빙 3 mL 주사기)에 벌레를 그립니다.

1. 웜 튜브로 서만, 아니라 모든 방법으로 주사기를 빨 아 해야.
   참고: 경우 벌레 주사기에 여행, 그것은 가까이 튜브에 그것을 다시 얻을 불가능.

콘센트 Luer 밸브 선회 하 여 흐름을 중지 하려면 진공 해제.

포트 로드 웜 차단 고체 핀 제거

설정 Luer 밸브 배기는 출구 포트 ( 그림 1B)에 연결.
참고: 사용 하 여 라이브 비디오 피드는 벌레를 로드 하는 동안 위치와 동물 (단계 5.8-5.13)의 방향을 확인.

삽입 튜브 웜 포트 로드에 로드 하는 웜

웜 로드 채널에 나타날 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.

벌레 꼬리 1 채널 입력을 시작, 경우 입력 채널에서 벌레를 방지 하기 위해 주사기 플런저 당겨.

적용 하 고 머리 먼저 채널 입력 될 때까지 압력을 반전 전환.

3 방향 Luer 밸브 선회 하 여 진공 분위기 대신 진공 하 여 출구 포트에 연결 하는 오픈.

수동으로 머리 자유롭게 이동할 수 우울을 동양 벌레 머리 버퍼 흐름 채널, 하지만 지금까지 노출 되는 주사기 플런저에 의해 압력을 적용 ( 그림 2 D-2E).

6. 자극 및 수집

1. 마이크로 매니저 등 10 프레임/s 블루 빛 여기를 사용 하 여 TIFF 스택으로 이미지를 캡처하여 기록 소프트웨어를 오픈-소스 현미경을 사용 하 여, (470 nm) 30 미
2. 1. 오픈 100 양 메인 메뉴에서 노출 설정 " 멀티 D Acq. " 소프트웨어의 메인 메뉴에서. 설정는 " 번호 "를 " 300, " 및 " 간격 "을 " 0. " 클릭 " 취득! " 비디오를 얻으려고.
3. 적용 수집을 시작한 후 자극 5 s의 10 s 펄스. 원하는 대로 응용 프로그램 자극의 기간 조정.
   1. 5 인수 후 s 비디오의 변경 제어 흐름 제어 버퍼 테스트 중인 동물을 자극을 적용 하는 3 방향 밸브. 밸브 연결 ( 그림 1B)에 가장 왼쪽 단추를 클릭 하십시오.
   2. 자극 노출 후 10 s (이 시간을 조정할 수 있습니다 사용자가 원하는대로), 다시 밸브 링크 맨 왼쪽 버튼을 누르면 버퍼의 흐름을 변경.
4. 버퍼 30의 창 GECI 형광 기준선으로 돌아갑니다 있도록 완료 될 때까지 아래 기록.
5. 원하는 대로 반복합니다. 수집의 끝과 다음 재판의 개시 사이 대기 30 s.

7. 분석 이미지

1. ImageJ 창에 파일을 드래그 하 여 TIFF 스택 ImageJ, 오픈 소스 소프트웨어와 함께 엽니다.
2. 커서를 사용 하 여 클릭 하 고 끌어 관심 (ROI)의 신경 주변 영역을 설정. ( 그림 3A)와 같이 관심의 신경의 soma를 포함 하도록 영역 설정.
3. 열기 클릭 하 여 투자 수익의 형광 강도의 z 스택 스택 전체 플롯-> 이미지-> 스택-> z 축 프로필 플롯.
4. 클릭 " 목록 " 열리는 창에서. 편집-> 값을 복사 하려면 복사. 값을 붙여 스프레드시트 프로그램으로.
5. 웜 GCaMP 식을 포함 하지 않는 영역에 투자 수익을 드래그 하 여 각 펄스에 대 한 배경 형광 분석.
6. 신경 형광 강도 값에서 배경 형광 값을 빼서 각 펄스에 대 한 배경 빼기 수행.
7. 계산 각 펄스의 각 프레임에 대 한 δ/F ₀.
   1. 첫 번째 1 대 한 투자 수익의 평균 휘도 값으로 계산 F ₀ 수집 (예: 프레임 1-10)의 s.
   2. 계산된 F ₀ 값으로 관심의 프레임에 대 한 배경 뺀 값을 분할 하 여 δ/F ₀를 계산.
8. 군데 모든 신경 및 모든 자극 펄스 반복.
9. 일관 된 응답 프로필, 화산재, 등 신경 각 뉴런에 대 한 모든 펄스를 평균 하 고 ( 그림 2F)에서 SEM을 계산.
10. 각 뉴런에 대 한 시간이 지남에 SEM와 평균 δ/F ₀ 플롯.
    참고:이 경우에, 그것은 뿐만 아니라 각 재판의 개별 신경 응답의 heatmaps를 포함 하 일반적인 관행입니다. 그것은 개별 펄스 트레이스 (로 표시에 더 적용 수 반복된 stimulations 걸쳐 자극에 노출 되 면 칼슘 과도 일관 된 변화를 전시 하지 않는 신경 또는 다른 개인 ²³ 그림 4)입니다. 결정 하는 데이터를 표시 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.

Results

그림 1A-B에서 전체 장치 설치의 예를 볼 수 있습니다. 그림 1A 는 적절 한 저수지 건설 및 설치를 보여 줍니다. 그림 1B 미세 장치에 저수지의 연결을 보여 줍니다. 그림 1C 는 개별 포트 선명도 대 한 분류와 미세 장치를 묘사 한다.

남성 적응 미세 장치 디자인 로드 포트에 곡선을 포함 되어 있지만 흐름 역학은 Chronis에 의해 설계 된 장치에 동일 외.¹⁹(-2 C그림 2A

Discussion

남성 적응 후 각 칩 좁은 로드 포트 방향 제어 및 남성 C. 선 충의 효율적인 트래핑 수 있는 회전을 채택 하고있다. Z-스태킹에 대 한 필요 없이 신경 양자 쌍의 왼쪽 및 오른쪽 회원의 시각화에 대 한 수 있습니다. 이 곡선 벌레에 시간의 수직 100% 떨어져 방향을 하나의 양자 쌍 재 (그림 2D-E)^29,30같은 형광 표시와 함께 대상으로 리드. 그러나, CEM, 같은 4 개의 광선으로 대칭 신경 세포와 신경 클래스에서 모든 4 개의 신경 세포는 볼 수 단지 1 / 3의 시간. 또 다른 3 분 테스트 벌레의 표시, 4 개의 뉴런의 고 나머지 3만 3만 구별할 수 차이 등 쪽과 복 부 셀 시체, 좌우 비대칭 (데이터 표시 되지 않음) 하지 사이. 좁은 포트는 z 축에 걸쳐 웜 동요를 방지 하기 위해 낮은 채널 높이와 결합...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
실리콘 웨이퍼	대학 웨이퍼	452
SU-8 2035	MicroChem	Y111070-0500L1GL
개발자	MicroChem	Y020100-4000L1PE
웨이퍼 마스크	Cad/Art Services	-	맞춤 주문. 25,000dpi로 인쇄됩니다.
Sylgard-184	Ellsworth 접착제	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0mm 피부 펀치	Acuderm Inc.	P150
소프트 튜빙	콜-팔머	EW-06419-01
하드 튜빙	IDEX 건강 & 과학	1622
핀	뉴잉글랜드 소형 튜브	NE-1027-12
차단 핀	뉴잉글랜드 소형 튜브	0.415/0.425" OD x .500 롱	배치 PB07027
3mL 주사기	BD	309657
30mL 주사기	바이탈리티 의료	302832	완충 저장소로 사용됩니다.
스테인레스 스틸 블런트 니들 23 게이지, 폴리프로필렌 루어	구성 요소 공급 회사	NE-231PL-50
루어 연결이 있는 스톱콕; 3-방향; 남성 잠금; 5 플로우 패턴; 비멸균	Cole-Palmer	EW-30600-07
Fisherfinest 프리미엄 커버 유리	Fisher Scientific	12-548-5M
메르카토르 제어 시스템 LF-5 플라즈마 시스템	메르카토르	LF-5
스카치 테이프	스카치	BSN43575
시리즈 20 챔버	워너 인스트루먼트	P-2
진공 건조제	Bel-Art Scienceware	420250000	내경 24cm
무게 보트	Cole-Palmer	EW-01017-27
Classic Plus Balance	Mettler Toledo	PB1501-S/FACT
유리 파스퇴르 피펫	Cole-Palmer	EW-25554-06
트랜스퍼 피펫	Genesee Scientific	30-202
Oven	Sheldon Manufacturing Inc	9120993	모델 번호: 1500E.
60mm, 비통풍식, 날카로운 모서리 페트리 접시	TriTech Research	T3308
Zeiss Axio Observer.A1		Zeiss-Hammamatsu
Orca Flash 4.0 Digital CMOS	Hammamatsu	C11440-22CU
Blue Fluorescent	Lumencor	SOLA SM6-LCR-SA	24-30V/7.9A DC.
조명 어댑터	Zeiss	423302-0000
시리즈 1 및 2 소형 불활성 PTFE 차단 밸브	Parker	001-0017-900	유량 제어용 3방향 밸브.
ValveLink8.2®	AutoMate Scientific	01-18	유량 스위치 컨트롤러
Micro Manager	Micro-Manager-Free		소프트웨어, 다운로드 위치: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ	ImageJ-Free		소프트웨어, 다운로드 위치: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological Grade	Apex	9012-36-6
펩톤	에이펙스	20-260
CaCl2	VWR	BDH0224-1KG
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-1kg
콜레스테롤	Alfa Aesar	A11470
에탄올	Sigma-Aldrich	270741-4L
테트라미솔	Sigma-Aldrich	L9756-10(G)	4 °C.에 보관하십시오.
플루오레세인	시그마-알드리치	FD2000S-250mg	감광성. 광보호용 바이알에 보관하십시오.
글리세롤	시그마-알드리치	G6279-1L
아스카로사이드 #3	-	-	슈뢰더 연구실(코넬 대학교)에서 합성.
NaCl	Genesee Scientific	18-215
KH2PO4	BDH	BDH9268.25
K2HPO4	J.T. Baker	3252-025
ASH GCaMP3 line	-	-	CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Bargmann 실험실에서 개발. 알브레히트 연구소 도서관에서 제공.
CEM GCaMP6 라인	-	-	JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Robyn Lints가 개발했습니다. Srinivasan Lab 라이브러리에서 제공했습니다.
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
"Reservoir"			--To create a Reservoir: "30 mL syringe"는 "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile"에 연결되며, 이는 "3 mL syringe" 및 "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge"에 연결됩니다. 폴리프로필렌 루어". 그런 다음 "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer"를 바늘 아래의 약 1/3 지점에서 "Soft Tubing"에 삽입합니다.