Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

요약

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

초록

대동맥은 신체에서 가장 큰 동맥 이다. 대동맥 벽 내 피 세포의 내부 계층, 탄성 lamellae 그리고 부드러운 근육 세포 (SMCs)의 중간 층 및 외부 층의 섬유 아 세포와 세포 외 매트릭스의 구성 됩니다. 성인 대동맥에 병 적인 모델 (예: 동맥 경화 증)의 광범위 한 연구와 달리 훨씬 덜 배아 및 perinatal 대동맥에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리가 초점을 SMCs는 morphogenesis의 분석 및 배아와 perinatal 대동맥 SMCs 정상적인 개발 및 질병의 병 인에 대 한 프로토콜을 제공. 특히, 포함 하는 4 개의 프로토콜은: 나) 배아 운명 매핑 vivo에서 및 클론 분석; ii) explant 배아 대동맥 문화; iii) SMC 별개로 perinatal 대동맥; 그리고 iv) 임신 (비 임신) 쥐에 피하 삼 투 미니 펌프 배치. 따라서, 이러한 접근 origin(s), 운명, 그리고 대동맥 vivo에서 SMCs의 클론 아키텍처의 조사를 촉진 한다. 약리학 대리인에 지속적인 노출에 의해 배아 대동맥 morphogenesis에서 utero에서 변조에 대 한 수 있습니다. 또한, 고립 된 대동맥 조직 explants 또는 대동맥 SMCs muscularization, 확산, 마이그레이션 등 기본적인 프로세스 동안 특정 유전자 목표의 역할에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 될 수 있습니다. 격리 된 SMCs explanted 대동맥에 이러한 가설 생성 실험 다음 약리 및 유전 접근을 통해 생체 내에 컨텍스트에서 평가 수 있습니다.

서론

세포에 영양분과 산소를 제공 하는 다세포 생물 기능의 순환 시스템에 있으며 하지 외부 환경 접촉이 세포에서 폐기물 및 이산화탄소 제거 하. 척추 동물, 심장, 혈관의 시리즈를 통해 혈액을 펌프 기본 순환 시스템에 의하여 이루어져 있다. 동맥과 정 맥, 같은 큰 혈관의 벽 3 계층 구성: 나) intima, 또는 내부 층의 내 피 세포; 2) 미디어, 또는 원주 교류의 중간 층 길쭉한 SMCs 부드러운 근육 세포 및 탄성 lamellae; 그리고 iii) adventitia, 또는 결합 조직과 섬유 아 세포의 바깥 레이어. 혈관 생물학에서 연구의 대부분 신생 통해 새로운 내 피 세포 늘어선 관의 형성을 조사 하 고, 내 피 세포에 초점. 비교에서는, SMCs 상대적으로 작은 관심을 받을. 그러나, SMCs는 정상적인 동맥 벽의 건축에서 및 혈관 병 리에 중요 한 세포 유형입니다.

대동맥에서 심장의 좌 심 실 심장 출력을 받는 본문에 큰 구경 동맥입니다. 그것은 아 테 롬, 동맥, 및 해 부를 포함 하 여 다양 한 인간 질병에 의해 시달리 다. 성인 유기 체, 대동맥 및 그 주요 분 지는 심각 하 게 공부 하지 혈관 질환의 모델. 예를 들어, 인코딩 apolipoprotein E, 또는 저밀도 지 단백질 수용 체 유전자에 대 한 null이 쥐를 먹이 하는 고 지방 규정식 아 테 롬, 개발 하 고 최근 운명 매핑 연구 나타냅니다 기존의 SMCs에 여러 세포 유형을 일으키는 동맥 경 화성 플 라크¹. 대동맥 동맥 류, 병 적인 변경 SMC apoptosis와 세포 외 매트릭스^2,3개조를 포함.

실질적으로 더 적은 배아 및 perinatal 기간 동안 SMC morphogenesis 및 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리는 배아 및 perinatal 대동맥 SMCs에 vivo에서, 고립 된 세포와 조직 explants에서 공부에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 프로토콜의 첫 번째 섹션 구분 운명 매핑 및 미 발달 쥐에 클론 분석. 특정 셀의 표시 및 그들의 자손^4,,56; Cre recombinase 셀 전용 모터의 제어 아래 표현 용이 그러나, 휴대 전용 라벨의 일시적인 제어에 쥐에 배아 개발 하는 동안 전하실 수 있습니다. 이러한 맥락에서 SMCs (e.g.,Myh11 또는 Acta2)와 Cre 기자 활성 발기인에서 조건부 있다 표현 하는 배아 우리 tamoxifen 또는 그 활성 대사 산물 4-오-tamoxifen 임신 댐에서 주입 방법 제공 태아 나 산 후 자손에 레이블이 지정 된 셀을 분석을 위한. 또한, 운명 매핑 연구, 어느 주로 단일 기자 fluorophore^1,7Cre 기자 활용, 달리 클론 분석은 실질적으로 향상 된 멀티 컬러 Cre 기자.

프로토콜의 두 번째 및 세 번째 섹션 분리 하 고 배양 배아 대동맥 explants 및 신생아에서 대동맥 SMCs 각각에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 접근 허용 신호 경로, 특히 대동맥 explants 또는, SMCs의 조작에 대 한 분석을 위한 약리학 대리인의 직접 효과. 따라서, 관심의 조직에 있는 특정 한 유전자의 역할 쥐에서 전통적인 유전자 조작을 통해 보다 훨씬 더 빠른 방식에서 상영 될 수 있습니다. 또한, 고립 된 SMC 연구 세포 이동의 분석을 촉진 하 고 기술적으로 접착 제한 에 비보.

마지막으로, 네 번째 프로토콜 섹션 구분 (또는 비 임신) 임신한 쥐에 약리 에이전트와 함께 로드 피하 삼 투 미니 펌프의 배치. 이 방법은 빠른 대사 때문에 지속적인 주입을 요구 하는 에이전트에 의해 발생 하는 배아 발달에 미치는 영향의 분석을 촉진 한다. 잦은 주사의 대안 많은 에이전트에 대 한 실용적 이며 피해 야 한다, 그것은 임신 댐에서 상당한 불편을 발생할 수 있습니다.

프로토콜

모든 마우스 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 예일 대학에 의해 승인 됩니다.

1. Vivo에서 배아 운명 매핑 및 클론 분석

참고: 우리는 이러한 접근 널리 평가 하 사용 셀과 그들의 클론 아키텍처 개발 및 질병 모델에서의 유래 ^{7 , 8 , 9 , 10}.

1. 는 크리스챤와 쥐와 쥐 Cre 기자와 사이 짝짓기 설정.
   참고:는 있다 SMC 표시; 사용 됩니다. Myh11-CreERT2 또는 Acta2 CreERT2 마우스 ^{11 , 12} 주로이 목적을 위해 사용 됩니다. 우리는 광범위 하 게 배아 조직 표시 ROSA26R CreERT2 마우스 ¹³를 이용 했다.
   1. 클론 분석에 대 한 멀티 컬러 Cre 기자 (예를 들어, 색종이 또는 무지개 [Rb] 쥐) ^{8 , , 14 15}를 사용 하 여 운명 매핑의 사용 하는 단색 Cre 기자 (예를 들어, ROSA26R-YFP 마우스 ¹⁶) 또는 두 배 색깔 Cre 기자 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) ¹⁷.
      참고:이 번 식 체계를 사용 하 여 성인 쥐를 2-6 개월 (일반적으로 30 ~ g)는 크리스챤과 Cre 기자 배아를 생성 합니다.
2. 금속을 사용 하 여 아침에 질 플러그 프로브 및 배아 일 (E) 0.5로 플러그 감지 당일 정오 고려 검사.
3. 플러그 감지 되 면 남성에서 여성을 분리.
4. 준비 4-오-tamoxifen 고 tamoxifen 작업 솔루션.
   1. 4-오-타 목 시 펜에 대 한 100% 에탄올, 소용돌이 2 분의 50 µ L에 5 mg을 녹이 고 옥수수 기름의 450 µ L를 추가 합니다. 얼음, 샘플 냉각 될 때까지 주기 사이 휴식 10 s 사이클에 대 한 출력 레벨 2에서 sonicate. 샘플은 완전히 용 해 후 (보통 ~ 쥡니다의 4-5 주기), sonicated 솔루션의 200 µ L 고 1800 µ L의 최종 작업 솔루션 (4-오-tamoxifen, 1 mg/mL) 옥수수 기름에 용 해.
   2. 그것 해산 때까지 tamoxifen에 대 한 100% 에탄올과 소용돌이에 50 mg/mL로 희석. 최종 작업 솔루션 (tamoxifen, 10 mg/mL)을 그것 완전히 용 해 되도록 45 ° C에서 저를 옥수수 기름에 희석.
5. 초기 배아 유도 주입 4-오-tamoxifen intraperitoneally 임신 댐.
   1. 4-오-tamoxifen 주사 (임신 마우스, 또는 대략 5 mg/kg 체중 당 최대 ~ 150 µ g)를 사용 하 여 E5.5 및 이후 그들은 항복 가능한 댐, 배아, 그리고 새끼.
   2. 0.5-1.5 m g (또는 17-50 mg/kg) 댐에서 태아와 임신에 대 한 복용량에서 사용 tamoxifen ~ E9 이후. 30g 바늘을 사용 하 여 모든 주사.
      참고: 0.22 μ m 필터를 통해 여과 주입 전에 모든 혼합물을 소독을 일반적으로 사용 된다.
6. 클론 분석을 위한 사용 4-오-tamoxifen (예를 들어, 5 mg/kg) 또는 (예를 들어, 50 mg/kg) 여러 셀을 표시 하려면 tamoxifen의 고용량의 복 주사.
   1. 개별 셀, 같은 (즉, 대동맥)의 조직에서 거의 모든 배아 (아래와 같이이 섹션의 끝에) 분석 없음 표시 하는 셀 또는 셀만 4 오 타 목 시 펜 이나 tamoxifen 복용 아래로 적정 하 단일 색상; 이것은 임계값 복용량.
7. 중앙 늦게 임신 기간에 셀을 표시 하 고 추적 그들의 운명 또는 출생 후 마우스에서 clonality를 주입 호르몬 임신 댐의 복 강에 수반 1:2 (황 체 호르몬: tamoxifen) tamoxifen을 복용량 비율.
   참고: 타 목 시 펜 복용은 17-50 mg/kg 및 황 체 호르몬 투여는 8.5-25 mg/kg (즉, tamoxifen 복용량의 절반). 황 체 호르몬 주사는 1 ~ 2 일에 의해 노동 지연 될 수 있습니다.
8. Euthanize 댐 댐 솜 또는 거 즈를 포함 하는 소켓에 배치 됩니다 오픈 놓기 방법을 사용 하 여 원하는 나이의 태아와 임신 undiluted isoflurane와 젖 었. 흉 강 매를 유도 하 여, 중요 한 장기를 제거 하 여 또는 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 죽음을 확인 하십시오.
9. 정화 70% 에탄올과 복 부. 가 위를 사용 하 여 자르면 복 부와 자 궁 밖으로 해 부. 자 궁에서 태아를 제거 하 고 신중 하 게 태 반 및 노른자위 sac 집게를 사용 하 여에서 배아를 분리.
10. E15 이상 배아를 자 궁 경관 탈 구 또는 잘린 수술가 위 또는 날카로운 칼 날을 수행 하 여 안락사.
    참고: 배아 E15 보다 빠르게 죽는 어머니의 안락사 또는 어머니에서 배아의 제거 다음.
11. 얼음 처럼 차가운 PBS에 배아를 놓고 있다 고 Cre 기자에 대 한 유전자 형을가 위를 사용 하 여 꼬리의 작은 조각을 잘라.
12. PBS에 세 번 배아 2 h. 워시 4 ° C에서 4 %paraformaldehyde 배아를 수정 하 고 15 mL 튜브에, 그들은 싱크대까지 기다리고 이틀까지 걸릴 수 있습니다는 PBS에서 30% 자당에 태아를 품 어.
13. 채우기 플라스틱 동결 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 최대 레벨의 2/3를 주조한 다. 형, 상 온 (RT) 거품을 최소화 하기 위해 10 분 동안 10 월 품에 완전히 빠져들에 각 배아를 세로로 배치.
14. 조직 블록을 드라이 아이스, 70% 에탄올 목욕 동결에 똑바로 고정 하는 장소. -80에서 블록 저장 ° c.
15. 는 Cryostat 온도-22 ° C를 설정 하 고 전체 대동맥, 10-20 µ m 두께 통해 가로 섹션을 생성 하는 블록을 잘라. -80에서 그들을 저장 하기 전에 30 분 동안 RT에서 슬라이드 건조 ° c.
16. 녹여 fluorophores의 표백 피하기 위해 빛에서 보호 하는 RT에 슬라이드. 워시와 PBS Tween20 슬라이드 0.1%.
    1. 클론 분석, 핵 (DAPI, 5 mg/mL)에 대 한 슬라이드를 얼룩 및 직접 레인 보우 Cre 기자에 다른 fluorophores 이미지 (하늘색: 433-nm 여기 최대, 475 nm 방출 최대; mOrange: 548 nm, 562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm).
       1. Fluorophores 직 립 형광 현미경으로 감지에 대 한 다음 필터 사용: DAPI (여기 맥스/대역폭 350/50 nm, 방출 최대/대역폭 460/50 nm), 리안 (여기 436/20 nm, 방출 480/40 nm), 텍사스 레드 (여기 560 / 40 nm, 방출 630/75 nm) 및 mOrange (여기 577/10 nm, 방출 630/50 nm)에서 mCherry를 별도의 사용자 지정 필터.
    2. MTmG Cre 기자와 운명 매핑, GFP를 감지 (484 nm, 510 nm), 직접 이미징 하거나 immunostaining를 사용 하 여. (여기 470/40 nm, 방출 525/50 nm) GFP 필터를 사용 하는 직 립 형광 현미경으로 이미징.
    3. Immunostaining에 대 한 섹션 4 ° C에서 하룻밤 1 차 항 체를 품 어 0.1% 트라이 톤 X-100 PBS에 세척 하 고 다음 1 h. 안티 CD31 사용에 대 한 2 차 항 체로 품 어 (최종 농도 0.0016 mg/mL), 안티-GFP (0.006 mg/mL)와 Cy3-직접 활용된 안티-SMA (최종 희석 1: 500) 주 항 체 및 사용 보조 antibodie직접 fluorophores (최종 희석 1: 500) (테이블의 자료를 참조)를 활용 하는 s.
17. 직 립 형광 현미경으로 슬라이드 이미지 (확대: X-20 X 4) 또는 confocal 현미경 (10 X-63 X). 높은 확대에 대 한 사용 하 여 오일 목표 x confocal 영상 63 1.4-0.6의 숫자 조리개와 1024 x 1024 픽셀의 프레임 크기.

2. 배아 대동맥 문화 explant

참고:이 접근은 이전 integrin beta3 explanted는의 협에서의 역할을 평가 하는 데 사용 됩니다 Eln ^(-/-) 배아 대동맥 ^{9 , 18}.

1. 위의 단계 1.8에 의하여 초과 isoflurane 흡입에 의해 E15.5에 초과 임신 댐 안락사.
2. 수확 및 위에 1.9-1.10, 단계에 따라 배아를 안락사.
3. 태아 supinely 놓고 해 부 보드 확장된 사지를 고정 합니다. 해 부 stereoscope와 시각화 및 위 가슴에 흉 골을 통해 복 부 로부터 수직 절 개를 잘라가 위를 사용 하 여 있습니다. Thymus, 멀리 해 부 기관지, 폐, 식도, 간, 그리고 대 장.
4. 부드럽게 ventrally 집게를 사용 하 여 심장 내과 흉부 및 복 부 구멍의 지 측면에서 대동맥 해 부를 위를 사용 하 여. 대동맥을 출시, 근 위 루트와 원심 복 부 위치에서 잘라.
5. 셀 문화 후드에 얼음 처럼 차가운 살 균 PBS에 대동맥을 놓습니다. 24-잘 접시에 대동맥을 전송 하 고 0.5 %DMEM 문화 FBS 37에서 최대 24 h에 대 한 ° C.
   참고: 문화 매체는 차단 항 체 (0.02 mg/mL ⁹ 예를 들어, 안티 integrin αvβ3 항 체, 참조 테이블의 재료) 또는 약리 에이전트와 함께 보완 될 수 있습니다.
6. 대동맥 PBS로 두번 세척 하 고 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 수정
7. 세척 3 회 PBS 및 대동맥 30 %1.5 mL 튜브에 PBS에 자당. 대동맥 싱크 후 만들고 냉동된 조직 블록, 컷된 섹션, immunostain, 위에 1.13-1.15, 단계에서 설명한 대로.

3. Perinatal 대동맥에서 SMC 격리

참고:이 방법은 현재 사용 되 고 Eln ^(-/-)와 wildtype perinatal 쥐에서 분리 대동맥 SMCs의 생물학 비교.

1. 는 murine pup 출생 후 하루 (P)에 0.5, 자 궁 경관 탈 구 또는 수술가 위로 잘린 또는 1.10, 단계에서 설명한 대로 날카로운 칼 날 위에 Euthanize.
2. 는 2.3 단계를 수행 하 고, 흉부와 복 부를 연 후 23 G 바늘 왼쪽된 심 실 펑크. PBS는 중력에 의해 좌 심 실으로 흐르고 그렇게 PBS 포함 된 무 균 주사기 바늘 연결을 사용 하 여 플라스틱 튜브 높은 위치에서 수직으로 개최. 간 blanches 때까지 좌 심 실에 살 균 PBS의 주입을 허용 합니다.
   1. 집게를 사용 하 여 대동맥의 외부에 adventitial 조직을 제거 하 여 2.4 단계에서 설명한 대로 대동맥 해 부.
3. DMEM의 단일 솔루션에 대동맥을 소화 (500 µ L) 보충 225 U/mL 콜라, 2.25 U/mL elastase, 및 1 x 37 ° C. 수동으로 쉐이크에서 45 분에 대 한 항생제 antimycotic 튜브 5-10 분 마다
4. 멸 균 셀 문화 후드, titurate 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 200 µ L 피 펫으로 아래로 pipetting으로 소화 조직. 단일 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 전송 DMEM의 2 개 mL를 추가 하 고 25에서 5 분 동안 920 x g에서 원심 ° c.
5. 폐기는 상쾌한. SMC 문화 매체 (DMEM 10% FBS 1 µ g/mL rhFGF, 10 µ g/mL rhEGF, 100 U/mL 페니실린/스와 2.5 µ g/mL 암포 B 보완 포함) 3 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 35 m m 문화 접시에 전송.
   참고: 초기 격리 시 ~ 400000 셀에서에서 얻을 수 있습니다 단일 P0.5 wildtype 대동맥; ~ 이러한 세포의 300000은 SMCs.
6. 37 ° C에서 세포를 배양 하 고 신선한 SMC 문화 매체 3 일 마다 변경 합니다. 트립 신으로 표준 기술을 사용 하 여, 셀 때 confluent 통로. 실험, 구절 3-7에서에서 셀 사용.

4. 피하 임신 (또는 비 임신)에 삼 투 미니 펌프 배치 마우스

참고:이 접근은 이전 약리 에이전트 (예: integrin β3 및 β5 억제제를 지속적으로 제공 하는 데 사용 됩니다 cilengitide) 배아 utero에서 ⁹. 펌프 E13.5에서 임신 댐에 삽입 하 고 출산 때까지 유지 되었다.

1. Anesthetize 유도 및 유지 보수에 대 한 1-3% 산소 (1 L/min의 유량)에 2-5 %isoflurane 쥐. 발가락-핀치 반사를 사용 하 여 마 취의 수준을 모니터링 하 고 필요에 따라 마 취 에이전트를 조정 합니다. 무 통을 위한 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg) 관리.
2. 는 클리퍼 스와 함께 허리를 면도. 무 균 커튼, 장갑, 그리고 악기를 사용 하 고 수술 하는 동안 난방 외과 접시에 쥐 유지.
3. 경향이 위치에 각 마우스를 배치 하 고 뒷면 betadine 이소프로필 알콜 다음 스크럽. Rostral 허리에서 꼬리의 기초에 대략 3-5 cm 가로 피부 절 개를 0.5-1.0 c m 기본 근육 부상 없이 길이 메스를 사용 하 여.
4. Hemostat 턱을 개폐 하 여 펌프 주입에 대 한 rostrally 피하 주머니 만들고 절 개 한 hemostat 삽입.
5. 채우기 선택, 제조자에 의하여의 에이전트와 함께 삼 투 미니 펌프 ' s 지침 (재료의 표 참조). 주머니에 가득된 펌프를 삽입 하 고 클립 또는 6-0 비 흡수 봉합 절 개를 닫습니다. 총 수술 시간은 10 분 미만 인지 확인
6. 는 post-operatively, 그들 sternal recumbency에서 복구 될 때까지 15 분 마다 마우스를 모니터링 합니다. 48 h에 대 한 모든 6-12 h 피하 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)를 관리 합니다. 쥐 완전히 전신 마 취에서 회복 때 그들을 매일 모니터링 합니다. 클립을 제거 하거나 봉합 수술 후 7-10 일.

결과

대표 클론 분석에서 SMCs의 Eln (세포 외 기질 단백질 엘라 스 틴을 인코딩 하는 유전자)에 돌연변이 체 배아에에서, Eln⁽⁺⁾, Acta2-크리스챤^T2 쥐 Eln⁽⁺⁾ 쥐도 들고 성관계 했다는 멀티 컬러 ROSA26R^(Rb/Rb) 기자. 1 단계에서 설명한 대로 플러그 했다 확인 하 고 임신 댐 했다 E12.5에 단일 tamoxifen 주입 (1.5 mg)으로 유도 한 그들은 E18.5에 희생 했다. 배아는 수확, 고정, 고정 및 genotyped 했다. 하강 대동맥 cryosections 가로 절단 했다. Eln⁽⁺⁾, Acta2-있다^T2에서 섹션 ROSA26R^{(Rb / +)} 배아 나타냅니다 초과 내부 레이어 SMCs는 Eln

토론

Murine 대동맥과 동맥 경화 증의 모델 등의 성인 병 적인 조건에 그것의 주요 분 지의 광범위 한 조사와 달리 덜는 morphogenesis와 배아와 perinatal 대동맥의 병 인에 대 한 알려져 있다. 여기, 우리 배아 perinatal 대동맥, 특히 SMCs에 집중 하 고 제공 하는 프로토콜을 vivo에서, 조직 explant 통해 대동맥 공부와 SMC 격리 접근. 이러한 무료 방법 제공 배아 perinatal 대동맥 공부를 다양 한 방법으로 조사 합니다.

클론 분석은 개별 셀의 동작을 조사할 수 있도록 하는 매우 강력한 방법입니다. 최근 폐 맥 관 구조¹⁰전문된 SMCs를 식별 하는 데이 방법을 사용 했습니다. 그것은, 멀티 컬러 Cre 기자를 들고는 개별 마우스에는 같은 색의 세포 수 이상의 재조합 이벤트에서 파생 되는 기회를 인식 하는 중요 한. 따라서, 멀티 컬러 기자와 클론 분석 수많은 쥐의 평가 필요...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
타목시펜	시그마	T5648
옥수수 기름	시그마	C-8267	타목시펜
4-OH-타목	펜 시그마	H7904	의 활성 대사 산물
	시그마	P8783-5G	의 절반 농도에서 사용
			cryoblocks 만들기 위해
Cryomolds	Polysciences inc	18986
DAPI	Sigma	D9542	핵의 IHC 염색, 최종 농도 5 mg/mL
Cy3 직접 접합 항-SMA 항체	Sigma	A2547	IHC 염색, 최종 희석 1:500
Anti-CD31 항체	BD Pharmingen	550274	GFP의 IHC 염색, 최종 농도 0.006 mg/mL
CD31의 Anti-GFP 항체	Thermo Fisher Scientific	A-11121	IHC 염색, 최종 농도 0.0016 mg/mL
2차 항체 염소 항토끼, Alexa 647	Life Technologies	a21244	IHC 염색, 최종 농도 0.004 mg/mL
2차 항체 염소 항토끼, Alexa 488	Life Technologies	a11008	IHC 염색, 최종 농도 0.004 mg/mL
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10567-014	세포 배양용
FBS	Thermo Fisher Scientific	10437028
안티 인테그린 베타3 차단 항체	BD Biosciences	553343	Clone 2C9. G2, 최종 농도 0.02 mg/mL
콜라겐 분해 효소	Worthington Biochemical Corp	44H14977A	대동맥 소화용
엘라스타제	Worthington Biochemical Corp	34K15139	대동맥 소화용
항생제-항진균제(100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
재조합 인간 FGF	Promega	G5071
재조합 human EGF	Promega	G5021
페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
조직 배양 플레이트	Corning	CLS430165
Alzet 삼투압 미니 펌프	Durect Corporation	2001
ECLIPSE 80i Upright 형광 현미경	Nikon
TCS  SP5	Leica
Branson Sonifier 450	VWR
Myh11-CreERT2 마우스	The Jackson Laboratory	19079
Acta2-CreERT2 마우스			Pierre Chambon 박사와 Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 마우스	The Jackson Laboratory	8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) 생쥐	잭슨 연구소
ROSA26R(EYFP/EYFP) 마우스	The Jackson Laboratory	006148
ROSA26R(색종이/색종이) 마우스	The Jackson Laboratory	13731
ROSA26R(Rb/Rb)	Irv Weissman		Irv Weissman 박사 연구실에서 입수