방법 논문

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

DOI:

10.3791/56063

⸱

2017년 8월 9일

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대뇌 피 질 개발, 조상 세포 새로운 창시자 또는 postmitotic 신경 생성 하 대칭 및 비대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다. 나중에, 일부 창시자 gliogenic 운명에 사이토와 oligodendrocyte 인구에 추가 전환 합니다. 기본 대뇌 피 질 세포 배양의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 세포 분열의 모드와 조상 세포의 세포 주기 매개 변수 제어 세포 및 분자 메커니즘 연구 가능 하다. 마찬가지로, postmitotic 세포의 운명은 셀 전용 형광 기자 단백질을 사용 하 여 또는 포스트 immunocytochemistry 이미징 시험 될 수 있다. 더 중요 한 것은, 이러한 기능을 모든 종류의 특정 세포 생성 하기 위해 노력 하는 창시자의 식별 수 있도록 단일 세포 수준에서 분석할 수 있습니다. 유전자 발현의 조작 또한 바이러스 중재 transfection, 세포 자치 및 셀을 자치 현상의 연구를 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 퓨전 형광 단백질의 사용 부문 및 딸 세포 운명과 상관 하는 동안 선택 된 단백질의 대칭 및 비대칭 분포의 연구를 수 있습니다. 여기, 우리는 며칠에 대 한 기본 대뇌 피 질 murine 셀을 이미지 하 여 세포 분열, 세포 주기 길이 및 새로 생성 된 셀의 운명의 모드 분석 시간 경과 비디오 현미경 방법 설명. 우리는 또한 transfect 조상 세포의 유전자를 조작 하거나 단순히 기자 단백질 셀 라벨에 적용할 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 줄기 세포 (NSC)는 대뇌 피 질 개발 중 신경 및 macroglial 셀을 생성합니다. 초기-corticogenesis, NSCs 대칭 세포 분열의 여러 라운드를 받 다 고 뿌리 풀 확장. 다음, NSCs 나누기 비대칭 중간체1를 통해 직접 또는 간접적으로 뉴런을 생성 합니다. 에 중반-에 늦은-corticogenesis, 창시자 이다 및 oligodendrocytes2,,34생성 하 전환 합니다. 그러나, 운명 제한 창시자 독특한 종류의 신경 또는 macroglial 세포의 생성에 기여 뿐만 아니라 세포 증식 및 분화, 제어 하는 완전 한 메커니즘 강렬한 토론4,,56의 문제가 남아 있습니다. 광범위 하 게 공부 생체 외에서 그리고 vivo에서 와 같은 수많은 기법을 사용 하 여 신경, 이다 oligodendrocytes를 생성 하기 위해 개별 외피 NSCs의 잠재력 되었습니다: 단일 셀 문화7,8,9,10,11,,1213; 이미징 라이브 고밀도 문화 문화3,,1415; 이미징 라이브 라이브 이미징 슬라이스 문화16,,1718; 바이러스 성 벡터 중재 유전 라벨 고밀도 문화14,15,19,,2021;를 사용 하 여 클론 분석 클론 분석에 비보에 레트로 바이러스22,23,,2425,26,27,28,29,30,31,32,33;를 사용 하 여 그리고 클론 분석에 vivo에서 유전자 변형 동물34를 사용 하 여.

이러한 기술을 각각 장점과 단점을 제공합니다. 예를 들어, 혈통 추적 vivo에서 총괄 한 그리고 분할 오류3, 개별 외피 창시자의 잠재력에 대 한 상반 된 결론을 이끌어을 받기 쉽습니다. 또한, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문 초기 시간 포인트에서 조상 세포의 라벨에 따라 그리고 후부 분석 세포 계보의 혈통-진행35동안 세포 죽음의 들 키 지 않고 발생에 의해 영향을 수 있습니다. 따라서, 단일 NSCs의 잠재력 분석 하기 적합 한 시스템 생성 하는 모든 셀의 식별 뿐만 아니라 혈통 내에서 세포 운명의 적절 한 묘사를 허용 해야 합니다. 1 차 세포 배양 및 라이브 이미징의 조합에는이 설정을 제공합니다. 단일 세포 배양 및 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여, 사원 외. 스위치에에서 나타났습니다 gliogenesis11성체에서 개별 대뇌 피 질 창시자의 계보. 나중에, 그들은 뉴런의 종류는 단일 외피 조상12에서 생성 됩니다 보여 동일한 시스템을 사용. 그러나,이 시스템 중요 한 경고 표시: 4 이상의 자손9의 클론을 생성 하는 이른 corticogenesis에서 절연 외피 창시자의 1%만. FGF2 추가 후 4 명 이상 세포 생성 세포의 주파수 8-109증가 합니다. 그럼에도 불구 하 고,이 숫자는 너무 작은이 단계에서 거의 모든 대뇌 피 질의 창시자는 증식을 고려. 또한, 운명 사양에 FGF2의 잠재적인 효과36배제할 수 없다. 고밀도 세포 배양 (Pax6 표현) 심 실 둘 다의 확산을 지 원하는 사용이 한계를 우회 하 고 subventricular (Tbr2 표현) 대뇌 피 질의 창시자15. 또한, 이러한 문화의 실시간 관찰 NSC 혈통 진행의 여러 가지 기능 세포 분열, 세포 주기 길어, 잠재력 단일 셀의 신경 및 명과, 다른 사람의 사이에서 생성 하는 모드 등이 조건 하에서3,15재현은 보이고 있다. 최근에, 우리는 또한 사용이 시스템 그 쥐37에서 미 성숙한 대뇌 피 질 뉴런의 세포 생존에 영향을 미치는 CREB 신호 보여. 따라서, 우리가 믿는 그 시간 경과 비디오 현미경 기본 murine 대뇌 피 질의 고밀도에 성장 하는 세포는 세포 주기 진행의 세포 및 분자 메커니즘, 세포 분열, 세포 생존 및 세포 운명 명세 모드를 공부 하는 강력 하 고 액세스할 수 도구. 후자는 수행할 수 있습니다 실시간38,,3940 에 특정 세포 운명의 식별 또는 immunocytochemistry3,38,,4142후 이미징의 사용을 허용 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여.

여기, 우리는 기본 대뇌 피 질 세포 배양 지원 NSCs의 확산 및 신경 및 macroglial 세포의 다음 세대를 준비 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 우리는 또한 식별 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 단일 셀 수준에서 추적 될 수 있는 개별 세포의 유전자 발현 조작 transfection retroviral 중재의 사용 설명. 설치류에 corticogenesis의 끝에 처음부터 격리 기본 대뇌 피 질 세포를 공부 하이 프로토콜을 사용할 수 있지만 몇 가지 조정 단계14에 따라 필요할 수 있습니다. 다른 소스에서 분리 하는 NSCs 또한 공부 될 수 있다 2D 문화의 시간 경과 비디오 현미경을 사용 하 여 하지만 적절 한 자란 시스템 셀 동작 생체 외에서 그리고 vivo에서38,43를 비교 하 여 결정 되어야 한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에 설명된 살아있는 동물을 대상으로 하는 모든 실험은 국내 및 국제 법률에 따라 수행되며 라이선스 009/2014에 따라 지역 대학 동물 관리 및 사용 위원회(CEUA/UFRN)의 승인을 받았습니다. 다음 프로토콜은 무균 환경에서 수행됩니다. 기본 세포 배양에 대한 지식이 있어야 합니다.

1. 배외측 Telencephalon Microdissection

  1. 해부 배지(100mL) 준비: 98.5mL Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 0.5mL 5M HEPES pH 7.4, 1mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL).
  2. 해부 매체를 필터 살균합니다.
  3. 임신한 마우스 C57/Bl6(Mus musculus)에서 이소플루란으로 마취한 배아 14일(E14) 배아를 제거합니다.
    참고: E0를 질 마개 감지의 날로 간주하십시오. 해부는 임신한 쥐에서 제거한 후 1시간 이내에 완료해야 합니다. 이 프로토콜은 배아 E11-E17에도 적용됩니다.
  4. 무균 상태에서 자궁절제술로 배아를 제거합니다.
  5. 배아를 냉박부 매체(4°C)가 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
  6. 세로 균열을 따라 절단하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 배아의 수는 보통 5개에서 10개까지 다양하다. 각 E14 뇌는 전구 세포와 유사 분열 후 뉴런을 포함하여 약 2 x 106 세포를 생성합니다 (1 : 1 비율)
    알림: 다음 단계를 위해 실체 현미경을 사용하십시오.
  7. 해부 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 반구를 분리하기 위해 중간에 텔렌스팔론을 분할합니다. 배외측 텔뇌팔론을 분리하려면 해부 겸자를 사용하여 배측 곡선과 구골-팔하경계 경계를 따라 자릅니다. 모든 뇌가 절개될 때까지 배외측 텔뇌팔론을 냉박부 매체(4°C)가 있는 2mL 튜브로 옮깁니다.

2. 세포 해리 및 도금

  1. 증식 배지 준비(DMEM+10% FCS 50mL): 44mL Dulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM), 5mL 태아 송아지 혈청(FCS), 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 증식 매체를 필터 살균합니다.
  2. 분화 배지 준비(DMEM 50mL+2% B27): 48mL DMEM, 1mL B27, 0.5mL 40% 포도당, 0.5mL 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units/mL 및 10,000 μg/mL). 분화 매체를 필터 멸균합니다.
  3. E14 마우스에서 배외측 텔렌스팔론을 미세 해부한 후, 수집된 조직과 냉 해부 배지가 있는 튜브를 원심분리하여(4°C에서 5분, 340 x g) 조직을 침전시킵니다.
  4. 피펫으로 상등액을 제거하고 화학적 분해를 위해 예열된(37°C) 트립신-EDTA(0.05%) 1mL를 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.트립신 활성을 중지하기 위해 2mL의 증식 배지를 추가합니다.
  5. 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 가스 버너 또는 분젠 버너에 몇 초 동안 연마하여 조리개를 약간 좁힙니다. 팁을 코팅하기 위해 FCS를 흡인하여 피펫을 세척합니다. 기포를 피하고 불로 연마되고 FCS로 코팅 된 파스퇴르 피펫으로 세포를 기계적으로 해리하십시오.
  6. 세포를 원심분리합니다(4°C, 340 x g에서 5분 동안). 피펫으로 상층액을 제거합니다. 1mL의 증식 배지를 추가하고 피펫을 사용하여 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
  7. 0.4% Trypan Blue 용액을 사용하여 세포 현탁액을 1:1 희석합니다. 생존 불가능한 세포는 파란색입니다. Neubauer 챔버를 사용하여 생존 가능한 세포(염색되지 않은)의 수를 계산합니다.
  8. 증식 배지에서 세포를 희석하여 106 cells/mL를 얻습니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 500μL의 세포 현탁액을 추가합니다(약 2.5 ×10 5 cells/cm2). 37 °C 및 5% CO2.
    에서 세포 배양 알림: 유리 커버 슬립은 실험 중에 움직이고 관찰 영역을 변경할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 또는 유리 바닥 조직 배양 플레이트를 사용합니다.
    참고: 세포 배양 처리된 다품종을 사용하지 않는 경우 37°C에서 Poly-D-Lysin(50μg/ml)으로 플레이트를 2시간 전처리하는 것이 중요합니다. PDL 처리된 플레이트는 증류수로 세척한 후 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 레트로바이러스 매개 형질주입(Retroviral-mediated Transfection)

참고: 이 방법은 전구 세포만 transfection하는 간단한 방법입니다. 그러나 다른 바이러스 벡터 또는 화학적/전기적 transfection을 사용하여 배양된 세포에 관심 유전자를 삽입할 수 있습니다.

  1. 유전자 발현을 조작하고 형광 리포터 단백질로 세포를 라벨링하려면 세포 도금 2시간 후 관심 유전자를 가진 플라스미드를 운반하는 레트로바이러스를 추가합니다.
    참고: 레트로바이러스 벡터는 분열하는 세포의 게놈에만 통합됩니다. 따라서 증식이 높을 때 세포를 감염시키는 것이 중요합니다.
    참고: 베타-액틴/CMV 융합 서열(CAG)과 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 플라스미드를 사용한 후 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 암호화 서열(pCAG-IRES-GFP44)을 사용했습니다. CAG promoter와 IRES sequence37 사이에서 관심 유전자를 복제할 수 있습니다.
  2. 레트로바이러스를 분화 배지에서 희석하여 mL당 원하는 입자 수를 얻습니다. 각 웰에 레트로바이러스가 포함된 분화 배지 500μL를 추가합니다.
    참고: 사용되는 레트로바이러스의 양은 역가에 따라 다르며 웰당 50-100개의 감염된 세포를 얻을 수 있도록 계산해야 합니다. 이 역가는 분리된 GFP 발현 클론을 식별할 수 있게 하며, 그 관계는 위상 대비 이미지를 추적하여 추가로 확인할 수 있습니다(섹션 6 참조). 레트로바이러스의 적정은 동일한 세포 population45를 사용하여 수행해야 합니다.

4. 타임랩스 비디오 현미경 검사

참고: 이 단계에는 배양 챔버가 있는 도립 형광 현미경이 필요합니다(재료 표 참조).

  1. 레트로바이러스 감염 후 조직 배양 플레이트를 온도 및 CO2 컨트롤러에 연결된 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: 이미징을 시작하기 3시간 전에 챔버를 예열하면 획득 중 드리프트 및 아웃포커스를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    참고: 챔버는 37°C 및 5% CO2의 일정한 조건에서 셀을 유지해야 합니다.
  2. XY축에서 0점(XY = 0)으로 사용할 위치를 선택합니다. 이를 통해 참조는 예를 들어 이미징 후 면역세포화학(섹션 5 참조) 후에 나중에 위치를 다시 찾을 수 있습니다.
    알림: 영점을 결정하기 위한 참조로 사용할 수 있는 기호를 플레이트에 그리는 것이 좋습니다.
  3. 10X 배율로 이미징할 위치를 선택합니다.
    참고: 웰당 10-15개의 위치를 선택하여 레트로바이러스 형질 주입된 세포를 관찰할 가능성을 높입니다.
    참고: 장거리 고배율 대물렌즈(20X 또는 40X)를 사용하여 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 대물렌즈의 작동 거리에 따라 유리 바닥 플레이트가 필요할 수 있습니다.
  4. 5분마다 위상차 이미지를 획득하고 3시간마다 형광 이미지를 획득하여 광독성을 줄입니다. 온도가 평형을 이루는 동안 변경될 수 있으므로 실험의 처음 3시간 동안 초점을 확인하고 조정하십시오. 매일 초점을 확인하고 조정하십시오.
    참고: 처음 24시간 후에 초점이 안정되는 것을 관찰합니다. 그러나 초점을 모니터링하는 것이 좋습니다.또는 소프트웨어 기반 자동 초점 시스템을 사용하십시오.
  5. 7일 후, 획득을 중지하고 이미징 후 면역세포화학을 진행합니다(섹션 5 참조).
  6. 면역세포화학(immunocytochemistry) 후 현미경 인큐베이터의 플레이트를 교체하고, 영점을 찾고, XYZ = 0을 재설정하고, 저장된 위치로 실험을 다시 로드합니다. 적절한 형광 필터를 사용하여 각 위치의 형광 이미지를 획득합니다.

5. 이미징 후 면역세포화학

  1. 배양 7일 후 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정액으로 세포 배양을 고정합니다.
    주의 : PFA는 독성이 있으므로 화학 흄 후드에서 취급해야 합니다.
  2. 0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.
  3. 4°C에서 0.5% 트리톤과 10%의 PBS 0.1 M.
    에서 일반 염소 혈청을 하룻밤 동안 1차 항체에서 배양합니다. 참고: 항 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 항체를 사용하여 신경 표현형(마우스 IgG1, 1:1,000)을 확인하고 항 GFP를 사용하여 형질도입된 세포(닭 항체, 1:500)를 표시합니다. 다른 항체를 사용하여 전구 세포 또는 신경교세포를 검출할 수 있습니다.
  4. 0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.
  5. PBS 0.1M에 0.5% 트리톤과 10%의 일반 염소 혈청에 2차 항체를 희석하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 권장 희석량: 1:1,000.
  6. 0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.
  7. 핵 염색의 경우 PBS 0.1M에서 0.1μg/mL 4'6'-디아미노-2-페닐린돈(DAPI)으로 5분 동안 세포를 배양합니다.
  8. 0.5mL PBS 0.1M로 5분 동안 헹굽니다. 3회 반복합니다.
  9. 세포를 PBS 0.1M로 유지하고 빛으로부터 보호하십시오(예: 호일로 플레이트 포장).

6. 세포 추적

참고: 여기에서는 재료 표에 제공된 링크에서 사용할 수 있는 tTt(The Tracking Tool) 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 비디오 현미경 데이터를 분석하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다.

참고: 다른 소프트웨어로 이미지 획득을 수행하는 경우 tTt 설치 프로그램에서 사용할 수 있는 tTt Converter를 사용하여 이미지 데이터를 가져옵니다(자료 표에 제공된 링크). png, tif 또는 jpg 이미지 형식만 허용됩니다. tTt 변환기를 시작한 후 그림 1 A - B에 표시된 단계를 따릅니다.

  1. 소프트웨어 tTt를 시작하고 사용자 이름을 선택합니다. "사용자 추가" 및 "계속" 버튼을 클릭합니다(그림 2A). "TTTWorkFolder"(그림 2B)를 찾아 선택합니다. 계보, 나무, 통계 및 내보낸 이미지가 이 폴더에 저장됩니다. 다음으로, 분석할 실험을 선택하고 로드합니다(그림 2B).
  2. 이미지가 이전에 tTt Converter에 의해 변환된 경우 "LogFileConverter"(그림 3A)를 클릭하고 LogFileConverter 창에서 연속된 두 시점 사이의 시간(초)을 지정합니다. "Convert log files for whole experiment"(그림 1C)를 클릭합니다.
  3. tTt 창에 나타나는 이미지 목록에서 수동으로로드하거나 프로그램에 표시된 옵션을 사용하여 원하는 이미지를 선택하십시오. 이미지를 로드합니다(그림 3).
  4. 파일 > 새 콜로니 열기> 선택합니다. "추적"을 클릭한 다음 "추적 시작"을 클릭하여 선택한 위치에서 추적을 시작합니다.
  5. 동영상 창이 나타납니다(그림 4). 추적 원을 사용하여 셀을 선택하고 키 0을 누릅니다. 소프트웨어는 다음 프레임으로 이동합니다. 마우스를 사용하여 추적된 셀 주위에 추적 원을 계속 배치하고 각 프레임에서 0을 클릭하여 셀에 추적 표시를 추가합니다.
  6. 키 1과 3을 사용하여 각각 이전 또는 다음 프레임으로 이동합니다. 트랙 마크를 삭제하려면 표시할 올바른 위치를 클릭하고 0을 누르기만 하면 됩니다.
  7. 셀이 분할된 경우 "분할" 버튼을 선택합니다(그림 4). Shift+D를 눌러 하나의 딸 셀을 계속 추적합니다. 두 번째 딸 셀을 추적하려면 셀 편집기에서 해당 셀을 선택하고 F2 키를 누릅니다.
  8. 비디오 현미경 검사 중에 세포가 사멸한 경우 "apoptosis"(그림 4)에서 파란색 사각형)을 선택합니다.
    참고: 소프트웨어에서는 이 사건을 "세포사멸(apoptosis)"이라고 표시하지만, 다른 메커니즘이 세포 사멸의 원인이 될 수 있습니다.
  9. 세포가 관찰 영역을 벗어나거나 인접 세포와 섞여 추적을 방해하는 경우 "lost"(그림 4)를 선택합니다.
  10. 추적을 중지하고 나중에 계속하려면 "인터럽트"(그림 4).
    를 클릭합니다. 참고: 셀 편집기 창에서 추적하는 동안 트리가 생성됩니다. 계보 트리를 저장하려면 파일 > 현재 트리> 저장(셀 편집기 창)을 선택합니다.
  11. 다른 셀 추적을 시작하려면 마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 셀을 클릭하거나 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 셀을 선택하고 추적 > 추적 시작을 클릭합니다.
  12. 추적 데이터가 있는 동영상을 내보내려면 소프트웨어가 "추적 모드"에 있지 않아야 합니다. 추적 모드를 끄려면 6.10단계를 실행합니다. 영화 창에서 > 동영상 내보내기를 선택합니다. 형식, 프레임 범위, 초당 프레임 수 및 비트 전송률을 설정합니다. "내보내기 시작"을 클릭합니다.

7. 수량화

참고: 비디오 현미경 data46을 사용하여 여러 측정을 수행할 수 있습니다. 여기에서는 나중에 "대표적인 결과" 섹션에서 예시되는 세 가지 가능성에 대해 설명합니다.

  1. 서로 다른 시점에 살아 있는 세포의 수를 개별 클론 내에서 이러한 시점에 도달하기 전에 생성된 총 세포 수로 나누어 각 세포 계통에 대한 세포 생존을 정량화합니다.37.
  2. 대칭 전구 세포(SP, 두 딸 세포가 모두 증식하는 경우), 비대칭(A, 한 딸 세포는 계속 증식하고 다른 하나는 유사분열 후가 됨) 또는 대칭 말단(ST, 두 딸 세포가 모두 유사분열 후 전환)의 비율을 정량화합니다.15,38.
  3. 세포의 생성과 분열 사이의 증식 세포의 시간 범위를 계산하여 세포주기의 길이를 측정합니다15.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

배아 E14에서 분리된 대뇌 피질 세포의 1차 배양에는 전구 세포와 신경 세포가 모두 포함되어 있습니다. 이미징 기간 동안 전구 세포는 여러 차례의 세포 분열을 거쳐 세포 수를 증가시킵니다(그림 5 및 비디오 그림 1).

몇 개의 전구 세포의 레트로바이러스 매개 transfection은 세포 클론의 식별을 용이하게 합니다(그림 6). GFP 발현은 24시간 후에 검출할 수 있습니다. 이 시점에서는 위상차 이미지에서 GFP 발현 세포를 식별하고 이를 추적하여 계통을 완성할 수 있습니다. 여기에 포함된 GFP 이미지는 다음과 같은 이유로 좋은 대비를 갖지 않습니다: 1) 레트로바이러스 형질도입 후 며칠 후에 내인성 GFP 발현이 관...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실시간으로 관찰 기본 대뇌 피 질 세포의 세포 증식의 분석, 세포 분열, 세포 주기 길이, 세포 분화 및 세포 생존3,14,,1537의 모드 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 신경3NSCs에서 진행 하는 동안 제정 중간 단계의 식별으로 이어지는 단일 세포 계보의 연구 허용. 마지막으로, 공학 도구를 조작 유전자 발현이 문화 시스템의 조합 선택된 대상5셀 자치 효과 연구에 강력한 기술입니다. 여기 설명 하는 방법은 공부 NSCs 다른 소스38,42에서 고립 뿐 아니라 다른 발달 단계

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 CNPq (게 나시오날 드 Desenvolvimento Científico e Tecnológico), 망 (Coordenação de Aperfeiçoamento 데 피해 드 높이 등)에 의해 지원 되었다, FAPERN (Fundação de Amparo 검색 할 리오 그란데 노르 테 할).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco12400-024
Fetal Calf Serum (FCS)Gibco10437028
포도당GibcoA2494001
B27Gibco17504044
트립신-EDTA (0.05%), Gibco25300054
파라포름알데히드시그마16005
염소 혈청시그마-알드리치69023
트리톤 X-100VWR International Ltd.306324N
이소플루란시그마792632
안티 MAP2, 마우스시그마M4403
안티 GFP 치킨Aves0511FP12
DAPI시그마D9542
염소 안티 마우스 알렉사 594인비트로젠A11005
염소 안티 닭 알렉사 488인비트로젠A11039
ImageJNIH
tTtETH 취리히
세포 관찰자 현미경Zeiss
파스퇴르 피펫
PBS
추적 도구(tTt) 소프트웨어https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html다운로드 링크
: , , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문