Method Article

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미래 세대에 액세스할 수 있는 생물 학적 정보의 인코딩 변화 DNA 시퀀스를 통해 일반적으로 달성 된다. 수명이 긴 상속 단백질 구조 (보다는 오히려 순서)으로 인코딩된는 오래 패러다임 변화 하지만 드문으로 간주 되었습니다. 최고의 특징이 같은 후 성적인 요소는 prions, 새로운 고기의 상속 징후를 구동할 수 자가 조립 동작을가지고 있습니다. 많은 archetypal prions는 눈에 띄는 N/Q-풍부한 시퀀스 바이어스를 표시 하 고 녹말 체 접이식으로 조립. 이러한 비정상적인 기능 대부분 심사 노력 새로운 프리온 단백질 식별을 통보 했다. 그러나, 적어도 3 개의 알려진된 prions (를 포함 하 여 창립 프리온, PrPSc)이 생 화 확 적인 특성 항구 하지 않습니다. 우리는 따라서 대량 작업의 속성에 따라 단백질 기반 상속의 범위를 조사 하는 대체 방법 개발: 프리온 단백질의 과도 overexpression 증가 주파수는 그들은 자체 템플릿 구조 확보. 이 문서에서는 단백질 기반 상속을 유도 하는 효 모 ORFeome의 용량을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 이 전략을 사용 하 여, 우리가 이전에 발견 하는 > 1% 효 모 단백질의 수명이 긴, 안정, 그리고 유전자 변이 보다는 더 빈번 하 게 발생 생물학 특성의 출현을 연료 수. 이 방법은 전체 ORFeomes 또는 특정 유전자 네트워크 또는 환경 자극에 대 한 대상된 심사 패러다임으로 높은 처리량에 사용할 수 있습니다. 앞으로 유전 스크린 수많은 발달 및 신호 경로 정의 하는 것 처럼 이러한 기술을 생물학 과정에서 단백질 기반 상속의 영향을 조사 하는 방법을 제공 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생물 학적 시스템 자주 단백질 풍부에 일시적인 동요를 경험 한다. 이러한 표현 형 유기 체 또는 미래 세대의 형성에 지속적인 영향을 미칠 여부 불분명 남아 있습니다. 이 생물학의 가장 잘 알려진 인스턴스 단백질, prions, 게놈 수정 없이 상속 특성의 출현을 드라이브의 드문 클래스를 포함 합니다. 대신, 이러한 프로teinaceous 그리고 에fectious 입자 고기 자기 영속적인 변화 단백질 구조1,2를 통해 전송합니다. 상속의이 유형은 치명적인 신경 퇴행 성 질병의 특이 한 상속 패턴의 원인으로 발견 되었다. 그러나, 유기 체 균 류에서 포유류3,4,5,6,7,8,,910 에 이르기까지 연구 이후 프리온 같은 요소 적응 값을 부여 수 있습니다 밝혀 있다. 그럼에도 불구 하 고, prions는 희귀 생물 이상한 하지만 매혹적인로 간주 되었습니다.

이 통용 지혜는 단백질 기반 상속의 특성 오래 예의 작은 세트에 의해 제한 되어 있기 때문에 부분에서 개최 됩니다. 최근 체계적인 심사 노력 식별 하 여 여러 가지 새로운 진실 fide prions11 명의 거의 단백질 도메인12 연료 프리온 같은 구조적 변환 용량이 사진을 크게 확대 했습니다. 그러나, 이러한 방식을 일반적으로 강한 아미노산 시퀀스 편견에 초점을 맞춘, 때문에 발견 되었습니다 prions 창립 효 모 prions [PSI+]13,14,15, [URE3] 및 [RNQ+]11,16의 생 화 확 적인 속성을 공유 합니다. 이러한 포함: 1) 모듈형 도메인을 아스파라긴 (N)과 글루타민 (Q), 2) 어셈블리는 녹말 체 [프리온+] 나 란17,,1819로 긴 고분자 뻗어 풍부 하 고 3) disaggregase 어머니 딸13,,2021에서 충실 한 전파에 대 한 Hsp104 함수에 대 한 의존도 완료. 실제로, 많은 진실 fide prions, 포함 한 [르+], [한-s], 그리고 원래 프리온 PrP (Sc), 이러한 엄격한 조건에서 놓친 것 이다. 아마도 더 중요 한 것은, 그들은 것입니다 수 없습니다 단백질 기반 상속22의 새로운 메커니즘을 캡처. 따라서, 이러한 현상의 진정한 생물학적 폭 자연 이전 생각 보다 훨씬 더 일반적인 수 있습니다.

이 문제를 조사, 높은 처리량, 프로테옴 전체 전략 고용 되었다. PrPSc, [르+]를 포함 하 여 모든 prions의 특징 [한-s]은 인과 단백질의 과도 overexpression 강하게 프리온 수집15,23,,2425,26의 비율을 증가. 우리는 뚜렷이 개별 단백질의 overexpression를 유도 하 여 안정적인 단백질 기반, 후 상태를 시작할 수 경우 체계적으로, 전체에 걸쳐 ORFeome, 효 모에이 기능을 이용을 했다. 잘 알려진 그 단백질 overexpression 고기27를 변경할 수 있습니다. 그러나 그들의 임시 과잉 생산 초기 overexpression 후 세대의 많은 수백에 대 한 상속을 표현 형에서 변화 하기 때문에, 프리온 단백질 평소 되지 않습니다. 우리는 이전 단백질 기반 유전 요소, heritably phenotypic 풍경 게놈28변경 하지 않고 다시 배선 수 있는 단백질의 수십을 식별 하기 위해 특이 한 상속 패턴 뿐만 아니라이 기능을 이용 했다. 비록 일부 확인 된 단백질 이전로 알려져 있었다 prions, 대부분, 새로운 형태의 단백질 기반 상속을 밝히기 위해이 접근의 힘을 강조 했다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 초기 과식

  1. 이전에 YPD 액체(효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 포도당 20g)에서 이전에 성장한 효모 세포(이 경우 BY4741 MAT 반수체)를 FLEXGene ORFeome 라이브러리의 원하는 후보 구성물로 형질전환(URA3 표시 중심체플라스미드 백본에서 갈락토스 유도 프로모터의 제어 하에 있는 효모 ORF), pBY01129)를 사용합니다.
  2. 오토클레이브 이쑤시개를 사용하여 이러한 변형에서 4개의 개별 콜로니를 선택하여 생물학적 복제물 역할을 합니다. 96웰 플레이트에서 150μL의 SRaffinose-URA(0.74g의 CSM-URA, 6.7g의 아미노산이 없는 효모 질소 염기, 1L당 20g의 라피노스)에서 48-72시간 동안 성장합니다. 모든 플레이트의 A1 웰에 있는 첫 번째 ORF의 콜로니, 모든 플레이트의 A2에 있는 두 번째 ORF의 콜로니를 접종합니다.
    참고: 모든 성장 단계는 달리 명시되지 않는 한 30°C 및 대기 중 CO2(407.05ppm)에서 수행됩니다.
  3. 배양액이 포화 상태(각 웰의 바닥에서 눈으로 볼 수 있는 세포)를 확인하고 액체 취급 로봇을 사용하여 각 96웰 플레이트 웰에서 1μL의 1μL 어레이를 45μL의 SGal-URA(0.74g의 CSM-URA, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 웰당 1L당 갈락토오스 20g).
    참고: 이것은 각 ORF의 4개의 생물학적 복제물이 정사각형 패턴으로 배열된 복합 플레이트를 생성합니다.
  4. 동시에 웰당 관심 스트레스 요인(예: 20mM의 염화망간)과 함께 45μL의 SGal-URA를 포함하는 별도의 384웰 플레이트를 준비합니다. 1.3.
    단계와 동일한 방법으로 이 플레이트를 접종합니다. 참고: 표현형 검출을 위한 가장 큰 동적 범위를 달성하려면 주어진 스트레스 요인의 LD50 농도 주위에서 2배 희석 시리즈를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 증가된 성장과 감소된 성장을 모두 관찰할 수 있는 최적의 농도를 결정하기 위해 미리 수행할 수 있습니다.
  5. 최종 병렬 대조군으로, 플라스미드 발현을 유도하지 않는 배지에 동일한 스트레스 요인을 포함하여 동일한 방식으로 세 번째 384웰 플레이트를 접종합니다. 플레이트에 웰당 45μL의 SD-URA(CSM-URA 0.74g, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 1L당 포도당 20g)가 포함되어 있는지 확인하고 1.3단계 및 1.4단계와 같이 접종합니다.
  6. 즉시 셀이 있는 플레이트를 마이크로플레이트 스태커에 놓고 72시간 연속 루프에 대한 프로토콜을 설정하고 실온 및 대기 중 CO2(407.05ppm)에서 스태커가 장착된 마이크로플레이트 리더로 OD600을 측정합니다.
    참고: 성장 측정 빈도는 실행에 사용된 플레이트의 수(궁극적으로 연구자가 조사하고자 하는 유전자 및 조건의 수에 따라 결정됨)에 따라 달라집니다. 더 많은 플레이트를 사용할수록 플레이트 리더가 루프를 완료하는 데 더 오래 걸리므로 측정 사이의 시간이 길어집니다(플레이트당 측정 시간은 사용된 기기에 따라 ~45초임).
  7. 성장 측정 후 동일한 액체 처리 로봇을 사용하여 SGal-URA 유도 배양물(즉, 단백질 과발현이 발생한 배양물)의 웰당 1μL를 웰당 45μL의 SD-URA를 포함하는 새로운 384웰 플레이트(플라스미드의 단백질 발현을 허용하지 않는 배지)로 이동합니다.
    1. 이와 병행하여, 스트레스 요인이 있는 상태에서 SD-URA에서 성장한 배양물(즉, 1.5단계)에서 웰당 45μL의 SD-URA를 포함하는 두 번째 384웰 플레이트 세트에 대한 유사한 접종을 수행합니다.
    2. 플레이트를 30°C에서 48시간 동안 가습 챔버(즉, 내부에 젖은 종이 타월이 있는 밀봉 가능한 플라스틱 통)에서 포화되도록 성장시킵니다.
  8. 이전 단계의 플레이트를 취하여 45μL의 SD-URA를 포함하는 384웰 플레이트에 웰당 1μL를 재접종합니다. 그런 다음 동일한 소스 플레이트에서 45μL의 SD-URA가 포함된 별도의 384웰 플레이트에 stressor와 함께 웰당 1μL의 별도 재접종을 수행합니다.
    참고: 이것은 단백질 과발현이 중단된 후에도 스트레스 요인에 대한 민감도/저항 표현형이 지속되는지 여부를 결정합니다.
  9. 즉시 세포가 있는 플레이트를 마이크로플레이트 스태커에 놓고 실온 및 대기 중 CO2(407.05ppm)에서 마이크로플레이트 리더로 OD600을 측정하는 48시간 연속 루프에 대한 프로토콜을 설정합니다.
  10. 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 OD600 측정값과 시간 측정값을 XY 테이블로 내보냅니다. 각 생물학적 복제에 대한 OD600의 열을 그룹화하고 평균을 계산합니다. OD600에 대한 XY 시간 플롯을 생성하여 성장 곡선을 생성합니다.
    1. 과거에 과발현된 배양물(즉, SD-URA에서 재접종 전에 갈락토오스 함유 배지에서 원래 유도된 배양물)과 그렇지 않은 배양물(즉, 포도당에서 증식된 배양)의 성장률을 비교하십시오. 앞에서 설명한 바와 같이 30.
  11. 조상 단백질 과발현에 따라 주어진 스트레스 요인에 대한 반응에서 상당한 성장 차이를 보이는 배양액의 경우, 각 생물학적 복제물에서 1μL를 취하여 물 10mL에 희석한 다음 5-FOA(CSM-URA 0.74g, 5-FOA 1g, 우라실 50mg, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 포도당 20g, 리터당 한천 20g). 30 °C에서 3 일 동안 자랍니다.
    1. 이로 인해 플레이트당 콜로니가 너무 많거나 너무 적으면 그에 따라 희석 계수를 조정하십시오.
      참고: 5-FOA는 우라실 생합성 경로에 의해 독성 중간체로 전환됩니다. 이로 인해 첫 번째 단계에서 변형된 URA3 표시 발현 플라스미드의 손실이 발생합니다.
  12. 오토클레이브 이쑤시개로 8-32개의 단일 콜로니를 선택하고 150μL의 SD-CSM을 포함하는 96웰 플레이트에 고정합니다. 30°C의 가습 챔버에서 48-72시간 동안 포화 상태로 성장합니다. 이러한 배양물을 사용하여 1.11단계의 스트레스 요인이 있거나 없는 150μL의 SD-CSM을 포함하는 두 개의 새로운 96웰 플레이트 세트를 접종합니다.
  13. 플레이트를 마이크로플레이트 스태커에 놓고 48시간 연속 루프에서 OD600을 측정하도록 프로토콜을 설정합니다.
  14. 1.10단계와 같이 데이터를 분석하고 1.10단계에서 나타난 유의미한 성장 차이가 플라스미드 손실 후에도 유지되는지 확인합니다.
    참고: 이 세포는 단백질 기반 유전을 나타낼 수 있는 안정적인 표현형 상태를 가지고 있습니다.
  15. 단백질 기반 유전의 고전적인 특징에 대해 유도된 표현형을 유지하는 세포를 테스트합니다(아래 참조).

2. 프리온과 같은 상속 테스트

  1. 보호자 매개 "치료"
    1. Hsp104 샤프롱 의존성을 테스트합니다.
      1. 안정적인 표현형 상태를 가진 효모 균주의 군체를 선택하고 3mM GdnHCl을 함유한 YPD 플레이트(효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 포도당 20g, 한천 20g)에서 단일 군체로 줄무늬를 만들고 30°C에서 3일 동안 성장합니다. 동시에, 동일한 방식으로 YPD+ 3mM GdnHCl에서 순진한 균주에서 단일 군체로 군체를 줄무늬 아웃합니다.
      2. 3mM GdnHCl을 포함하는 새로운 YPD 플레이트에서 2회 더 반복합니다.
      3. GdnHCl에 노출되면 몸집이 작은 세포가 발생하는 빈도가 증가할 수 있으므로 GdnHCl에서 3번의 계대를 거친 여러 콜로니를 선택하고 7일 후 YP-글리세롤 플레이트(효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 글리세롤 20mL, 한천 20g)에서 눈에 보이는 콜로니로 성장하는 능력을 검사하여 기능적 미토콘드리아 호흡을 확인합니다.
      4. YP-글리세롤 플레이트에서 여러 콜로니를 선택하고 1.13단계에서 설명한 것과 유사한 방식으로 "경화된" 및 나이브(즉, BY4741 MAT, 반수체와 같은 표현형 상태를 보유하지 않는 동종 세포) 대조군과 비교하여 스트레스 요인의 존재 하에서 성장을 사용하여 안정적인 표현형 상태의 유지를 테스트합니다.
    2. Hsp70 샤프롱 의존성을 테스트합니다.
      1. 플라스미드를 통한 "치료".
        1. 강력한 구성적 프로모터(GPD)로부터 Hsp70 (K69M)25,31의 우성 음성 대립유전자를 발현하는 URA3 표시 플라스미드를 사용하여 naive 세포와 안정적인 표현형 상태를 가진 세포를 모두 형질전환시킵니다.
        2. 각각에 대해 단일 형질전환체를 선택하고, SD-URA 플레이트(CSM-URA 0.74g, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 포도당 20g 및 1L당 한천 20g)의 단일 콜로니로 줄무늬를 만들고, 30°C 및 대기 CO2에서 3일 동안 성장합니다.
        3. SD-URA 플레이트에서 이 패시징을 2회 더 반복합니다.
        4. 여러 colony를 선택하고 5-FOA plate에서 단일 colony로 줄무늬를 만들어 plasmid를 제거합니다.
        5. 각 분리체에 대해 여러 개의 단일 콜로니를 선택하고 1.13단계에서 설명한 것과 유사한 방식으로 안정적인 표현형 상태의 유지(또는 손실)를 테스트합니다.
      2. 유전자 교차를 통한 "치료".
        1. Cross BY4741 MAT는 안정적인 표현형 상태를 가진 반수체 균주와 4개의 효모 Hsp70 paralog (ssa1Δ, ssa2Δ) 중 2개에 유전적 결실을 품고 있는 반대 짝짓기 유형(이 경우 BY4742 MATα)의 순진한 균주입니다.
          참고: 이 균주는 Hsp70 샤프론 기능이 부족합니다.
        2. SD-LYS-MET(1L당 0.74g의 CSM-LYS-MET, 6.7g의 아미노산이 없는 효모 질소 염기, 20g의 포도당, 20g의 한천)에서 단일 콜로니로 줄무늬를 만들어 이배체의 성장을 위해 선택합니다.
        3. 단일 이배체 콜로니를 선택하고 8mL의 포자 형성 전 배지(0.8% 효모 추출물, 0.3% 펩톤, 10% 포도당 및 100mg/L 아데닌 설페이트)에서 30°C에서 24시간 동안 성장합니다.
        4. 3,000 xg에서 3분 동안 배양물을 스핀다운하고, pre-sporulation(pre-SPO) 배지를 흡인하고, 펠릿을 멸균수로 한 번 세척합니다.
        5. 포자 형성 배지 2mL(초산 칼륨 1개, 효모 추출물 0.1%, 포도당 0.05%, 아미노산 추가 혼합물 0.01%(히스티딘 2g, 류신 10g, 라이신 2g, 우라실 2g))에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 25°C에서 5일 동안 자랍니다.
        6. 배양물을 30°C로 옮기고 추가로 48시간 동안 배양합니다.
        7. 광학 현미경을 사용하여 테트라드의 존재를 찾아 포자 형성의 효율성을 평가합니다32.
        8. 40μL의 배양액을 취하고 1.5mL 튜브에서 3,000xg로 1분 동안 스핀다운한 후 동일한 부피의 자이몰리아제 효소 혼합물(1M 솔비톨, 0.1M EDTA 및 10mg/mL 자이몰리아제 100T)으로 다시 현탁합니다.
        9. 25 °C에서 5 분 동안 배양합니다.
        10. 매우 건조하고 매우 평평한 YPD 한천 플레이트에 10μL의 소화된 배양액을 적용하고 배양액이 플레이트를 직선으로 천천히 퍼뜨리도록 합니다.
        11. 층류 후드에서 플레이트를 최소 30분 동안 건조시키십시오.
        12. 해부 현미경을 사용하여 포자를 테트라드로 분리하고 플레이트에 배열합니다.
        13. 개별 반수체 포자가 군체로 자라도록 하고 SD-HIS-LEU(0.67g의 CSM-HIS-LEU, 6.7g의 아미노산이 없는 효모 질소 염기, 20g의 포도당, 1L당 20g의 한천) 플레이트에서 자랄 수 있는 능력을 테스트하여 두 유전자 결실(ssa1Δ ssa2Δ)을 모두 보유하고 있음을 나타냅니다.
        14. 1.13.
          단계에 설명된 것과 유사한 방식으로 Hsp70 결핍 백그라운드에서 표현형 상태의 유지를 위해 각각을 테스트합니다. 참고: 이러한 포자를 Hsp70 기능이 복원된 야생형 균주로 다시 교차시켜도 프리온 표현형이 복원되지 않습니다.
  2. 멘델이 아닌 상속에 대한 테스트.
    1. BY4741 MAT는 안정적인 표현형 상태와 동종 순진한 대조군을 가진 반수체 균주를 반대 짝짓기 유형의 동생성 순진한 균주(이 경우 BY4742 MATα)로 교차합니다.
    2. SD-LYS-MET 이중 드롭아웃 배지에서 단일 콜로니로 줄무늬를 만들어 이배체의 성장을 위해 선택합니다.
    3. 단일 이배체 집락을 선택하고 8mL의 포자 형성 전 배지에서 30°C에서 24시간 동안 성장합니다.
    4. 위에서 설명한 대로 2.2.2.3-2.2.2.12단계를 반복합니다.
    5. 개별 반수체 포자가 군체로 성장하도록 하고 1.13.
      단계와 같이 성장 분석을 사용하여 감수분열을 통해 표현형 상태가 유지되는지 각각 테스트합니다. 참고: 프리온의 또 다른 특징은 원래의 캐주얼 단백질을 제거함으로써 유전적으로 제거될 수 있다는 것입니다. 따라서, 유사하게, 프리온 균주와 원래 유도 단백질의 유전적 결실을 가지고 있는 균주를 교배하면 결실을 유전하는 포자에서 프리온 표현형이 폐지됩니다. 또한, 삭제된 유전자가 프리온 표현형을 발현하는 데 필요하지만 프리온 자체를 전파하지 않는 경우 이러한 돌연변이에서 프리온이 "비밀스러운" 상태로 유지될 수 있습니다. 이 두 가지 가능성을 구별하기 위해 포자를 다시 순진한 야생형 균주로 교차시키고 유전자의 기능이 회복된 이배체 유전적 배경에서 프리온 표현형이 다시 나타나는지 테스트합니다.
  3. 세포유도.
    1. 초기 BY4742 수신자 균주를 생성합니다.
      1. 형질전환을 통해 짝짓기 중 핵융합을 방지하는 결함이 있는 KAR 대립유전자(kar1-15)를 도입합니다23.
      2. 이 균주를 "몸집이 작은"(즉, 미토콘드리아 호흡에 무능한) YPD 육체의 단일 콜로니에 0.25% 브롬화 에티듐을 접종하여 만듭니다.
      3. 30 °C에서 늦은 지수/고정상(OD600 ~1)까지 배양물을 성장시킵니다.
      4. 신선한 YPD에 1:1,000을 0.25% 브롬화 에티듐으로 희석하고 두 번 반복합니다.
      5. 배양액이 후기 지수상/초기 고정상(OD600 0.8-1.2)에 도달하면 멸균수에 1:10,000을 희석하고 YPD 플레이트에 50μL를 도금하여 단일 콜로니로 플레이트합니다. 30°C에서 3일 동안 성장한 후 여러 군체를 선택하고 7일 후 YP-글리세롤 플레이트에서 눈에 보이는 군체로 자랄 수 있는 능력을 검사하여 각각의 호흡 무능 여부를 테스트합니다.
    2. BY4742에 초기 세포유도를 수행합니다.
      1. 안정적인 표현형 상태를 가진 공여자 BY4741 균주의 세포를 YPD 한천 플레이트의 표면에 나이브 BY4742 kar1-15 수용 균주의 세포와 혼합합니다.
      2. 30°C 및 대기 중 CO2(407.05ppm)에서 24시간 동안 성장한 후 글리세롤(SGly-MET: 1L당 CSM-MET 0.74g, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 글리세롤 20mL 및 한천 20g)을 포함하는 메티오닌 드롭아웃 배지로 옮깁니다.
        참고: 이것은 세포질 교환을 통해 기능적 미토콘드리아를 복원할 수 있도록 하는 것과 함께 BY4742 핵 마커 모두에 대해 선택됩니다.
      3. 3-5일 후, 여러 개의 단일 콜로니를 선택하고 SD-MET에서 한 번 더 선별합니다(1L당 CSM-MET 0.74g, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 포도당 20g, 한천 20g).
      4. 동시에 SD-LYS-MET 배지에서 통과하여 군체가 이배체가 아닌지 확인합니다.
    3. 역세포유도를 수행합니다.
      1. 새로운 공여자 균주(이번에는 성공적인 BY4742 kar1-15 세포유도체)를 YPD 한천에 몸집이 작은 순진한 BY4741 세포(위와 같이 생성됨)와 혼합합니다.
        2. 라이신이
      2. 결핍된 글리세롤 배지(SGly-LYS: 1L당 CSM-LYS 0.74g, 아미노산이 없는 효모 질소 염기 6.7g, 글리세롤 20mL 및 한천 20g)에서 BY4741 수용자 핵 마커를 선택하는 것을 제외하고 앞서 설명한 바와 같이 세포유도를 반복합니다(단계 2.3.2.1-2.3.2.4).
      3. 여러 세포유도체를 선택하고 1.13단계에서와 같이 성장 분석을 사용하여 안정적인 표현형 상태의 유지를 테스트합니다.
  4. 단백질 변환.
    1. 용해물을 준비합니다.
      1. 30°C에서 18시간 동안 YPD에서 안정적인 표현형 상태를 가진 세포 50mL를 성장시킵니다.
      2. 3,000 x g에서 4분 동안 배양물을 펠렛으로 만든 다음 오토클레이브 H2O에서 한 번, 1M 소르비톨에서 한 번, 이렇게 두 번 세척합니다.
      3. 200mL의 SCE 완충액(1M 소르비톨, 10mM EDTA, 10mM DTT, 100mM 구연산나트륨 및 50mL당 1개의 mini-EDTA-free 프로테아제 억제제 정제, pH 5.8)에 50U/mL의 효모 용해효소 100T로 세포를 재현탁합니다.
      4. 혼합물을 35°C에서 30분 동안 배양합니다.
      5. 음파 방출기를 사용하여 얼음 위에서 20초 동안 20kHz 및 20% 강도로 세포를 초음파 처리합니다.
      6. 10,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
      7. 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 RNase I과 biotinylated DNase를 3배 초과량(활성 단위에 따라 결정)으로 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
      8. 과량의 스트렙타비딘-아가로스 비드를 첨가하여 DNase I을 제거하고, 5분 동안 배양한 후 10,000 x g에서 1.5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
      9. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
    2. 수혜자 스페로플라스트를 준비합니다.
      1. YPD에서 중간 지수기(0.5-1 범위의 OD600)에서 5mL의 미성숙 수용 세포를 성장시킵니다.
      2. 원심분리(3,000 x g에서 4분)로 수확하고 4회 세척: H2O에서 2회, 1M 소르비톨에서 2회.
      3. 200 U/mL 효모 용해 효소를 함유한 1 M 소르비톨에 세포를 다시 현탁시키고 35 °C에서 15분 동안 배양하여 세포벽을 소화합니다.
      4. 생성된 스페로플라스트를 600 x g에서 5분 동안 부드러운 원심분리로 수확하고 1mL의 1M 소르비톨로 세척한 다음 1mL의 STC 완충액(1M 솔비톨, 10mM Tris pH 7.5 및 10mM CaCl2)으로 다시 세척합니다.
      5. 세척된 스페로플라스트를 50μL의 STC 완충액에 재현탁합니다.
        알림: 가위를 사용하여 피펫 팁의 마지막 ~0.7cm를 자릅니다. 이렇게 하면 입이 넓어지고 스페로플라스트의 용해를 방지할 수 있습니다.
    3. 단백질로 미접촉 세포를 변형시킵니다.
      1. 50 μL의 스페로플라스트 분취액을 50 μL의 공여 용해물, 20 μL의 연어 정자 DNA(2 mg/mL) 및 5 μL의 URA3 표시 선별 플라스미드(예: pAG426-GFP)로 형질전환28,33.
      2. 혼합물을 25°C에서 30분 동안 배양합니다.
      3. 600 x g에서 5분 동안 원심분리하여 스페로플라스트를 수집하고 150μL의 SOS 완충액(1M 솔비톨, 7mM CaCl2, 0.25% 효모 추출물 및 0.5% 펩톤)에 다시 현탁합니다.
      4. 30°C에서 30분 동안 회복합니다.
      5. SD-URA 플레이트에 전체 배양을 플레이트합니다.
      6. 0.8% 한천을 함유한 따뜻한(~45°C) SD-URA로 도금된 배양액을 빠르게 오버레이합니다.
        참고: 이렇게 하면 스페로플라스트가 파열되는 것을 방지할 수
        7. 있습니다
      7. 형질전환판을 30°C에서 2-3일 동안 배양합니다.
      8. 이쑤시개를 사용하여 오버레이된 플레이트에서 성공적으로 성장하는 세포를 선택하고 SD-URA 플레이트의 단일 콜로니로 줄무늬를 다시 만듭니다.
      9. 각각에 대해 수십 개의 콜로니를 선택하고 5-FOA 플레이트에 줄무늬를 만들어 URA3 표시 캐리어 플라스미드를 제거합니다.
      10. 5-FOA 플레이트에서 자라는 콜로니를 선택하고 이전과 같이 성장 분석을 사용하여 안정적인 표현형 상태의 전달을 테스트합니다(1.13단계).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 과발현은 세포 표현형을 극적으로 변화시키는 것으로 알려져 있습니다27. 실제로, 초기 스크리닝 접근법을 통해 단 10개의 스트레스 요인을 사용하여 효모 ORFeome의 클론 과발현에서 수백 개의 새로운 표현형을 재현 가능하게 회수했습니다. 그러나, 상기에 기술된 분석법은 세포가 이러한 과발현 후에 장기적으로 안정적인 표현형을 유지하는지 여부를 평가할 수 있게 한다. 이러한 상태를 암호화할 수 있는 단백질 중 하나는 Psp1입니다. Psp1은 복제 기계에서 돌연변이를 억제할 수 있는 기능을 알 수 없는 단백질입니다(예: pol alpha34). 다양한 스트레스 요인에서 PSP1 ORF 조절 세포 표현형의 과발현. 놀랍게도, 하나의 표현형(염화망간에 대한 내성)은 과발현이 중단된 후에도 오랜 시간 동안 세포에서 수백 세대 동안 유지되었습니다(즉...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

첫 번째 효 모 prions는 그들의 특이 한 고기 및 상속의 복잡 한 패턴에 의해 확인 되었다. 이러한 prions의 특성 다음 알고리즘 및 계산 도구 추가 프리온 단백질에 대 한 화면을 사용 했다. 여기서 설명 하는 방법을 반대로 실험 이며 지속적인 변화는 안정 상태 인코딩된 단백질 구조에서 만들 과도 overexpression에 의존. 그러나, "시드" 어떤 주어진된 단백질에 대 한 overexpression에 의해 프리온 어셈블리의 효율성 매우 낮은 경우에, 그 단백질이 유형의 overexpression 화면에서 거짓으로 지속적으로 나타날 것입니다. 이 문제를 해결 하려면 같은 한 수정 단백질 overexpression 미래에 대 한 2-미크론 플라스 미드를 사용 하 여 실험 것입니다. 마지막으로, 각 유발된 프리온에는 그것의 자신의 독특한 성장 고기 고 것입니다 하지 될 모든 조건에서 분석. 따라서, 다른 조건과 테스트 복용량 수 안타의 수를 제한 합니다.

중요 한 것은...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리가 그들의 도움으로 그들의 사려깊은 의견에 대 한 검토자가이 문서에서 사용 되는 분석 실험 개발에 대 한 Sohini Chakrabortee, 산드라 존스, 데이비드 가르시아, Bhupinder Bhullar, 아멜리아 장, 리처드 그녀와 Susan Lindquist 감사 합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
구아니딘 염산염시그마Cat#G3272-25G화학
망간 클로라이드시그마Cat#M8054-100G화학
에티듐 브로마이드시그마E1510화학
5-플루오로로트산시그마Cat#F5013-50MG화학
BY4741 MATa (his3Δ 1 leu2Δ 0 LYS2 met15Δ 0 ura3&델타; 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/A효모 균주
BY4741 MATα (his3Δ 1 leu2Δ 0 lys2&델타; 0 MET15 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/A효모 균주
Hsp70 (K69M) Jarosz et al., 2014bN/A플라스미드
FLEXGene 라이브러리Hu et al., 2007N/A플라스미드 라이브러리
포도당(포도당)Fisher ScientificD16-3미디어 구성 요소
RaffinoseSigmaR0250-25G미디어 구성
요소 갈락토스Fisher ScientificBP656-500미디어 구성
요소 CSMSunrise Science1001-100미디어 구성 요소
: CSM-URASunrise Science1004-100미디어 구성
요소: CSM-LYSSunrise Science1032-100미디어 구성
요소: CSM-METSunrise Science1019-100미디어 구성
요소: CSM-LYS-METSunrise Science1035-100미디어 구성
요소: 효모 추출물Fisher ScientificBP1422-2미디어 구성 요소
펩톤연구 제품 국제P20240-5000미디어 구성 요소
bacto-peptoneBD211677미디어 구성 요소
글리세롤EMD MilliporeGX0185-2미디어 구성
요소 효모 질소 염기 (아미노산 제외)BD291920미디어 구성 요소
한천IBI ScientificIB49172매체 성분
아데닌 설페이트시그마A3159-25G매체 성분
아세트산 칼시그마P1190-500G매체 성분
우라실시그마U0750-100G매체 성분
히스티딘시그마H8000-100G매체 성분
류신시그마L8000-25G미디어 구성 요소
LysineSigmaL5501-25G미디어 구성 요소
RNase I Thermo Fisher ScientificEN0601Enzyme
biotinylated DNaseThermo Fisher ScientificAM1906Enzyme
zymolyase 100T (yeast lytic enzyme)Sunrise ScienceN0766555Enzyme
Microplate readerBioTekSynergy H1Equipment
Microplate stackerBioTekBioStack3Equipment
Plate 필러BiotTekEL406장비
액체 취급 로봇Beckman CoulterBiomek FX장비
, 륨

References

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