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Genetics

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

Published: December 12, 2017
doi:
10.3791/56085
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Summary

선물이 nucleosome 밀도 칩 seq 분석 프레임 워크를 통합 하는 micrococcal nuclease (MNase) 접근에 대 한 적합 한 시퀀스 데이터 집합의 세대에 대 한 (칩 seq) 방법론을 시퀀싱 수정된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 측량와.

Abstract

선물이 시퀀싱 (칩 seq) 실험 프로토콜 호환 가우스 혼합물 배급 기반 분석 방법론 (nucleosome 밀도 칩 seq; ndChIP-seq)의 생성을 가능 하 게 수정 된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 게놈 넓은 micrococcal nuclease (MNase) 접근의 결합 된 측량. Nucleosome 위치 및 로컬 밀도, 그리고 그들의 히스톤 subunits posttranslational 수정 로컬 전송 상태를 조절 하는 콘서트에서 행동. NdChIP-seq에 의해 생성 된 히스톤 수정 nucleosome 접근의 조합 측정 이러한 기능의 동시 심문 수 있습니다. NdChIP-seq 방법론 1 차 셀 기반된 칩 seq 프로토콜 cross-linking에 액세스할 수의 작은 숫자에 적용 됩니다. 함께 찍은, ndChIP-seq 드문 1 차 셀 인구 내에서 RNA 전사 조절 공유 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻기 위해 로컬 nucleosome 밀도와 히스톤 수정 조합에서의 측정을 수 있습니다.

Introduction

진 핵 게놈 DNA1,2의 146의 기본적인 쌍에 의해 circumscribed 4 개의 히스톤 단백질 (예를 들어, H2A, H2B, H3, H4)의 두 개의 복사본으로 구성 하는 nucleosome 구조 반복을 통해 chromatin에 패키지 됩니다. Chromatin 개장 단지 유전자 발기인 경계 내 nucleosome 위치 제어 및 유전자 발현의 규칙에 참여 하는 전사 인자와 RNA 중 합 효소 기계3, DNA의 액세스 가능성을 변경 하 여 4.

nucleosome 내 히스톤의 아미노 맨끝 꼬리 acetylation, 메 틸 화, 인 산화, ubiquitylation, sumoylation, formylation, 및 특정 아미노산5 의 hydroxylation를 포함 하 여 다양 한 화학식 수정 대상이 되는 , 6 , 7 , 8. 위치 및 이러한 변경의 영향 전사7의 정품 인증을 허용 하는 분자 복합물의 염색 질 구조 및 제어 액세스 chromatin 상태 지시. 그 두 nucleosome 밀도 히스톤 수정 유전자 전사의 로컬 컨트롤에서 역할을 할 우리 네이티브 칩 접근 nucleosome 밀도 히스톤 수정9의 동시 측정을 가능 하 게 개발 10.

기본 칩 seq endonuclease micrococci nuclease 핵11,12, nucleosome13 위치를 지도에 활용 되는 속성 내에서 기본 상태에서 그대로 chromatin 소화 (MNase)의 활용 , 14 , 15. nucleosome 밀도 칩 seq (ndChIP-seq) 히스톤 수정10MNase 접근을 결합 하는 측정을 생성 하는 chromatin의 영역을 열려면 MNase의 특혜 접근의 속성 활용. ndChIP-seq는 히스톤 수정 드문 1 차 셀, 조직 및 배양된 세포에서의 프로 파일링 적합 합니다. 여기, 선물이 적합 조각 크기 게시물 immunoprecipitation, 쌍 간 경계, 읽기에 의해 결정을 통합 하는 앞에서 설명한 분석 프레임 작업10 시퀀스 데이터 집합 생성을 가능 하 게 상세한 프로토콜 동시에 히스톤 수정 측정 MNase 접근성 조사. 이전에, 10000 기본 인간 코드 혈액이 프로토콜의 응용 프로그램 파생 CD34+ 세포와 인간 배아 줄기 세포 염색 질 구조와 히스톤 수정이 내 간의 독특한 관계 셀 유형10 공개 . NdChIP-seq 단일 nucleosome 수준에서 세포 인구에서 epigenomic 기능을 공개 하 고 다른 유형의 서명으로 해결은 nucleosome 접근성 및 히스톤 수정 동시에 측정 하는 능력을 감안할 때, 그들의 구성 요소입니다. NdChIP-seq에 의해 다른 유형의 세포 인구의 탐험의 예는 어디 H3K4me3, 적극적인 마크와 H3K27me3, 억압 적인 마크는 현재10가 발기인의 조사입니다.

Protocol

참고:이 프로토콜에 대 한 최소 입력 단일 면역-강 수 (IP) 반응 당 10, 000 셀입니다. 제공 된 실험적인 워크시트 인쇄 및 실험을 계획 하는 지침으로 활용. 실 온에서 외피 ~ 22 ° c.에 것으로 간주 버퍼 조리법의 모든 표 1에 제공 됩니다. 버퍼의 모든 4 ° C에서 저장 한다 고 명시 되지 않는 한 절차 동안 얼음에 보관.

1. 세포 준비

  1. 배양된 세포
    1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 세포 세척 하 고 정확 하 게는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 농도 결정. 1 백만 개 이상의 셀이, PBS의 볼륨을 증가.
    2. 살 균 1.5 mL 튜브, 4 ° c.에 6 분 x 500g에 다운 스핀으로 70000-100000 셀의 해당 셀 카운트, aliquot에 따라 피 펫을 사용 하 여, 천천히 제거 (셀 펠 렛을 방해) 하지 않고는 상쾌한 삭제 그리고 얼음 세포의 용 해 버퍼 + 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (PIC) 1000 세포의 농도를 x 1에서 펠 릿 resuspend / µ L. 20-30 아래로 pipetting으로 잘 믹스 번입니다. 그것은 중요 한 세포 덩어리 혼란 된다입니다. 거품을 생성 하지 마세요.
    3. NdChIP-seq 프로토콜의 하루 1 (제 2)에 직접 진행 또는 플래시 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결
  2. 정렬된 셀
    1. 행 크의 버퍼링 된 소금물 (HBSS), 또는 PBS + 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 350 µ L 1.5 mL 튜브에 70000-100000 정렬된16 셀을 수집 합니다.
    2. 각 셀은 4 ° c.에 6 분 500g x에서 aliquot 아래로 회전 천천히 (셀 펠 렛을 방해) 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 얼음 세포의 용 해 버퍼 + 1 resuspend는 피 펫을 사용 하 여, 1000 셀의 최종 농도에 PIC x / µ L.를 위아래로 pipetting으로 세포의 용 해 버퍼에서 잘 믹스 20-30 시간. 셀 덩어리 중단 됩니다 있는지 확인 합니다. 거품을 생성 하지 마세요.
    3. NdChIP-seq 프로토콜의 하루 1 (제 2)에 직접 진행 또는 플래시 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결

2. 제 1 일: ndChIP-seq

  1. 항 체-비드 복합물의 준비
    1. 37 ° C 물 목욕과 얼음 양동이 준비. 얼음에서 작업, PIC x 1 x IP 버퍼/1과 항 체 (Ab) 희석 버퍼, x 1을 준비 하 고 얼음에 그들을 유지. 부드러운 펄스-vortexing에 의해 잘 4 ° C 저장 및 혼합에서 단백질 A (또는 G) 자석 구슬 (선택 기준에 대 한 토론 을 참조 하십시오)를 검색 합니다. 얼음에 그것을 유지.
      참고: 펄스-vortexing vortexing 전체와 동 튜브에 형성 된다 때마다 중지 의미 합니다.
    2. 새로운 2 mL 튜브에 IP 반응 당 24 µ L 단백질 A (또는 G)의 자석 구슬을 전송 합니다. 구슬의 볼륨을 기록 하 고 얼음에 튜브를 유지. 예를 들어, 7의 ips 사용 7 x 24 µ L = 168 µ L.
    3. 튜브를 튜브 자석에 놓고 나타내는 비드 분리 될 솔루션에 대 한 대기 합니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 삭제. 튜브 자석에서 튜브를가지고 고 얼음에 그것을 배치.
    4. 얼음 처럼 차가운 IP 버퍼의 한 동일한 볼륨 (즉, 구슬의 초기 볼륨) + 1 x 그림 믹스를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 와 동 하지 마십시오.
    5. IP 버퍼 + 1 x 그림 + 튜브 자석에 다시 구슬을 놓고 나타내는 비드 분리 될 솔루션에 대 한 기다려야 합니다. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 삭제. 반복 차가운 IP 버퍼 + PIC 세척 2 X 1 번 총 3 세척 합니다.
    6. 최종 세척 후 차가운 IP 버퍼는 동일한 볼륨 (즉, 구슬의 초기 볼륨) + 1 x 그림 혼합에 구슬 resuspend. 아래로 pipetting으로 혼합. 와 동 하지 마십시오. 얼음에 튜브를 유지.
    7. 얼음, 25 mL V 모양의 저수지로 IP 버퍼 + 그림의 10 mL를 붓는 다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 추가 차가운 IP 버퍼의 130 µ L + 깨끗 한 V-하단 96-잘의 개별 우물에 그림 혼합 x 1 판. IP 당 하나의 잘을 작성 합니다. 라벨로 접시 “Ab-비드 복합물”.
    8. 12 µ L 세척 단백질 A (또는 G)의 자석 구슬 잘 IP 버퍼 + 그림, 포함 된 각 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 나머지 씻어 구슬 유지.
    9. 검증 된 항 체에서 얻을 그들의 냉동과 해 동, 얼음에 필요한 경우. 얼음에 working 희석 농도 표 2에 표시 된 1 x Ab 희석 버퍼와 항 체.
    10. Ab-비드 복잡 한 플레이트의 각 음에 적절 한, 희석 항 체 (표 1)의 1 µ L를 추가 합니다. 항 체 키에 잘 기록. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 20 번 위아래로 pipetting으로 각 행을 믹스. 팁 행 사이 변경 합니다. 알루미늄 플레이트 커버 Ab 비드 복잡 한 접시를 아주 잘 밀봉 하 고 2 시간 이상 회전 하는 플랫폼에 4 ° C에서 품 어.
      참고:이 인큐베이션 단계 2.4를 시작할 준비가 될 때까지 진행할 수 있습니다.
  2. 세포 세포의 용 해와 염색 질 소화
    1. 세포의 용 해 버퍼 x 1 + PIC x 1과 MNase의 1 mL 준비 얼음 작업, 난 희석 (표 3)를 버퍼링 하 고 얼음에 그들을 유지.
    2. 검색할 셀 알 약-80 ° C 저장 (또는 얼음, 신선 하 게 준비 하는 경우). 각 셀 펠 렛 10 s, 다음 얼음을 전송에 대 한 37 ° C 물 탕에 녹여
    3. 각 셀 펠 릿 즉시 차가운 1 x 세포의 용 해 버퍼 + 1 x 10000 셀/20 µ L, 그리고 10 번 pipetting으로 믹스의 최종 농도에 그림 고 거품을 만들지 않고 아래 추가 합니다. 예를 들어, 70000 셀에 대 한 최종 볼륨 140 µ L입니다.
    4. 얼음, aliquot 20 µ L/잘 96 잘 접시에 결과 lysates의 작업. 플라스틱 도장 플레이트 커버 하 고 20 분 라벨 플레이트 “MNase 소화” ice에 품 어 서식 파일 키에 웰 스를 기록. 염색 질 소화 반응의 정확한 타이밍을 보장 하기 위해 한 번에 샘플 2 개 이상의 행으로 소화를 진행 하지 마십시오.
    5. 방금 전에 20 분 세포 완료 되 면 희석 된 MNase 나 MNase와 효소 나 희석 20 U / µ L의 최종 농도를 버퍼링 하 고 얼음에 그것을 유지.
    6. MNase을 준비 얼음 작업, 내가 소화 저수지 96 잘 접시의 한 행에 표 4 와 샘플 플러스 5 µ L 죽은 볼륨의 각 행 마다 믹스의 aliquot 20 µ L 믹스 마스터와 얼음에 그것을 유지. 두 개의 행에 대 한 볼륨 이어야 한다: (20 µ L x 2) + 5 µ L = 45 µ L.
    7. lysates 잠복기 후, 얼음에서 MNase 소화 플레이트를 제거 합니다. 20 µ L MNase의 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 내가 소화 샘플의 각 행에는 믹스 마스터와 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 정확히 5 분 동안 실 온에서 품 어.
    8. 5 분 후 반응을 중지, 250 µ M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 6 µ L을 추가 하는 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플의 각 행에 아래로 혼합을 몇 번. 팁 행 사이 변경 합니다. EDTA 추가 후 전환 피펫으로의 설정을 20 µ L을 혼합 10 번 소화 반응의 완전 한 정지를 보장 하기 위해서 여기저기 pipetting으로. 팁 행 사이 변경 합니다.
    9. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 소화 하는 MNase 샘플의 각 행에 추가 세포의 용 해 버퍼와 혼합 x 10의 6 µ L 10 번 위아래로 pipetting으로 잘. 플라스틱 물개로 커버 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.
  3. 입력된 분리 및 전 개간
    1. 모든 우물 같은 살 균, 하나로 펠 릿/서식 파일 셀에 대 한 미리 냉장 얼음, 1.5 mL 튜브 (미리 서식 파일 id 표시) 및 혼합에 수영장, 얼음에 15 분 부 화를 철저 하 게 따라 있지만 천천히 세제 거품을 방지 하는 피 펫을 사용 하 여.
    2. 각 셀 펠 릿/서식 파일에 대 한 살 균으로 새로운 소화 chromatin, 0.5 mL 튜브 (미리 서식 파일 id 표시), 및 4 ° C에서 저장소의 8 µ L를 하룻밤으로 전송 합니다. 이 입력된 컨트롤 될 것입니다.
    3. 새로운 96 잘 접시에 48 µ L aliquots에 소화 chromatin의 나머지 볼륨을 배포 합니다. 웰 스 A01-A06 들어가는 셀 펠 릿/템플릿 1, 셀 펠 릿/템플릿 2 우물 A07-A12, 등등으로. 서식 파일의 키에 웰 스를 기록 합니다. “전 개간” 접시를 레이블을 지정 합니다.
    4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 추가 IP 버퍼 x 1 + 1 PIC x 120 µ L 및 세척된 단백질 A (또는 G) 자석 구슬의 12 µ L 전 개간 플레이트의 각 음에 단계 2.3.3에서. 10 번 위아래로 pipetting으로 각 행을 믹스. 팁 행 사이 변경 합니다. 알루미늄 플레이트 커버와 함께 접시를 잘 밀봉 하 고 최소 2 h 4 ° C에서 회전 플랫폼에서 품 어.
  4. Immunoprecipitation 반응
    1. Ab-비드 복잡 한 접시 (단계 2.1.10)와 전 개간 플레이트 (단계 2.3.4) 적어도 2 h. 빠른 10 centrifuging 여 두 접시를 회전 하는 동안 incubated가지고 있는지 확인 하십시오이 단계를 시작 하기 전에 200 x g에서 s.
    2. (에서 단계 2.1.10) Ab 비드 복잡 한 접시 접시 자석에 놓고 15 기다려 분명 될 솔루션에 대 한 s. 조심 스럽게 제거 하 고 상쾌한 구슬 방해 하지 않고 한 피 펫을 사용 하 여 삭제. 플레이트 자석에서 접시를 제거 하 고 얼음에 그것을 유지.
    3. (단계 2.3.4)에서 전 개간 반응 접시 접시 자석에 놓고 15 기다려 분명 될 솔루션에 대 한 별도의 구슬에 대 한 s. 방해 없이 구슬, 신중 하 게 상쾌한 복잡 한 접시 보관 얼음과 혼합에 부드럽게 15 배 아래로 pipetting Ab 구슬의 해당 우물에는 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다. 물개는 알루미늄으로 잘 플레이트 커버 플레이트와 품 어 회전 하는 플랫폼에 4 ° C에서 (12 월 18 일 h) 하룻밤. 다시 접시 “IP 반응” 레이블을.

3. 주 2: ndCHIP-seq

  1. 세척 및 차입
    1. 65 ° c 난방 믹서 설정 얼음에는 낮은 소금 워시 버퍼 및 높은 소금 워시 버퍼를 준비 합니다. 빠른 회전 10 단계의 2.4.3 IP 반응 판 200 x g에서 s.
    2. IP 반응 접시 접시 자석에 놓고 15 기다려 분명 될 솔루션에 대 한 s. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 구슬을 방해 하지 않고, 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 플레이트 자석에서 판 하 고 얼음에 그것을 배치.
    3. IP 반응 판에 샘플의 각 행에 얼음 처럼 차가운 낮은 소금의 150 µ L 세척 버퍼와 혼합 천천히 10 번 아래로 완전히 구슬 resuspend을 추가 합니다.
    4. IP 반응 접시 접시 자석에 다시, 별도로 구슬 대기 장소와 구슬 방해 하지 않고 제거 하 고 삭제는 상쾌한 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 얼음에 다시 접시를 놓고 2 세척 총 3.1.3, 3.1.4 단계를 반복 합니다.
    5. 얼음, IP 반응 판에 샘플의 각 행에 추가 높은 소금의 150 µ L 워시 버퍼와 혼합 천천히 10 번 아래로 완전히 구슬 resuspend를 pipetting으로 합니다.
    6. IP 반응 접시 접시 자석에 다시, 별도로 구슬 대기 장소와 구슬 방해 하지 않고 제거 하 고 삭제는 상쾌한 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 얼음에 IP 반응 접시를 놓고 미리 옆에 새로운 96 잘 접시를 진정.
    7. IP 반응 판에 샘플의 각 행에 높은 소금의 150 µ L 세척 버퍼와 혼합 천천히 10 번 아래로 완전히 구슬 resuspend를 pipetting으로 추가 합니다. 물의 resuspension, 후 새, 미리 냉장, 96 잘 접시의 해당 하는 행을 샘플의 각 행을 전송 합니다. 레이블을 접시 “IP 반응”. 오래 된 접시를 삭제 합니다.
    8. 판 자석에 새로운 IP 반응 접시를 놓고 구분 하는 구슬에 대 한 대기. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 구슬을 방해 하지 않고, 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 실 온에서 접시를 유지.
    9. IP 반응 판에 샘플의 각 행에 칩 차입 버퍼 (EB)의 30 µ L을 추가 하 고 천천히 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 거품 형성을 방지 있는지 확인 합니다.
    10. PCR 덮개로 잘 접시를 봉인 하 고 1350 rpm의 혼합 속도와 1.5 h 65 ° C에서 난방 믹서에서 품 어.
    11. 1.5 h 부 화 후 4 ° c.에 1 분 동안 200 x g에서 IP 반응 판 아래로 회전 50 ° c.의 난방 믹서 설정을 변경합니다
    12. 스핀, 후 IP 반응 접시 접시 자석에 놓고 취소 솔루션에 대 한 대기 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 구슬, 방해 하지 않고 신중 하 게 전송 30 µ L는 상쾌한의 새로운 96 잘 접시에. 각 행에 대 한 신선한 팁을 사용 합니다. 레이블을 접시 “IP 반응” 하 고 실내 온도에서 보관.
  2. 단백질 소화
    1. 4 ℃ 냉장고에서 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬17 (버퍼 구성 테이블) 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 중요 한에 대 한 실내 온도 유지: 비드 솔루션 완전히 진행 하기 전에 실내 온도 도달 하는 확인 하십시오.
    2. 4 ° C 저장 (2.3.2 단계)와 빠른 회전 급강하에서 입력된 컨트롤 샘플을 검색 합니다. 피 펫을 사용 하 여 볼륨을 측정 하 고 초순 각 입력된 컨트롤에 대 한 추가 30 µ L. 마지막 볼륨 미리 선택 된 입력된 웰 스 (빈 우물)에 입력된 컨트롤 샘플 전송 IP 반응 플레이트 (3.1.12 단계)에서. 예제 키에 잘 기록.
    3. 얼음, 저수지 96 잘 접시의 한 행에 표 5 와 aliquot 같은 볼륨에서와 같이 단백질 소화 마스터 믹스를 준비 합니다.
    4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, IP 반응 판에 샘플의 각 행에 추가 40 µ L의 단백질 소화 마스터 믹스 하 고 위아래로 천천히 10 번을 혼합. PCR 덮개로 잘 접시를 봉인 하 고 1 분, 200 x g에서 스핀 다운 650 rpm에서 설정 하는 30 분 동안 50 ° C에서 난방 믹서에서 품 어. 접시 잠복기 동안 신선한 70% 에탄올 (EtOH)를 준비 하 고 실내 온도에서 보관.
    5. 30 분 부 화 완료 후 회전 1 분, 4 ° c.에 대 한 200 x g에서 IP 반응 판 실 온에서 접시를 유지.
      참고: 총 볼륨 이어야 한다 지금 ~ 70 µ L/잘.
  3. 비드 정리 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션을 사용 하 여
    1. Aliquot 실내 온도 30% 못/1 M NaCl 자석의 저수지 깨끗 한 96 잘 접시의 한 행으로 솔루션 구슬 (샘플 당 75 µ L x 행의 #).
    2. 실내 온도에, 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 working IP 반응 판에 샘플의 각 행에 30% 못/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 70 µ L (1:1 비율)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 실 온에서 15 분 동안 접시를 품 어.
    3. 플레이트 자석에 접시를 놓고 별도의 구슬 수 있도록 5 분 동안 품 어.
    4. 피 펫를 사용 하 여 구슬을 방해 하지 않고, 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 구슬 유지.
    5. IP 반응 접시 접시 자석에 여전히 동안 실내 온도 70%의 150 µ L 추가 샘플의 각 행에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 EtOH 30 품 어 및 s. 30 후 s, 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 한 번 더 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
    6. 두 번째 EtOH 세척 후 3 분 시각적으로 모든 EtOH 증발 되도록 판 검사에 대 한 ‘건조’ 접시 접시 자석에의 품 어. 그렇지 않은 경우에 1 분 이상 건조 낮은 수율에 구슬 결과 대 한 접시를 품 어.
    7. 플레이트 자석 및 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 접시를 받아 35 µ L EB (자료 테이블)를 추가 합니다. 10 배를 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 팁 행 사이 변경 합니다. 3 분 elute 실 온에서 품 어.
    8. 부 화, 후 IP 반응 접시 접시 자석에 다시 놓고 2 분 동안 품 어. 구슬 분리 해야 하 고 솔루션 명확 하 게 될 것 이다.
    9. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 구슬, 방해 하지 않고 신중 하 게 전송는 상쾌한 새로운 96 잘 접시의 해당 우물에.
    10. 알루미늄 플레이트 커버 플레이트를 봉인, 라벨 “IPed + 입력 DNA”, 그리고 하룻밤, 4 ° C 또는-20 ° C에서 장기 저장 (> 48 h) 저장.

4. 주 3: 도서관 건축

  1. 최종 수리 및 인 산화
    1. 결국 수리/인 산화 반응에 대 한 입력은는 IPed + 입력 단계 3.3.10 접시. 녹고, 후 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에서 내려 접시를 회전 하 고 얼음에 그것을 유지 합니다.
    2. -20 ° C 냉장고 (효소)를 제외 하 고 시 약의 모든 최종 수리/인 산화 반응 (표 6)에 필요한 그들을 실 온에서 해 동 후 즉시 얼음 전송에서 검색 합니다.
    3. 얼음에 working, 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 관에서 최종 수리/인 산화 마스터 믹스를 설정 하려면 표 6 따릅니다. 모든 비-효소 구성 요소 추가 후 펄스 vortexing에 의해 잘 혼합 하 고 얼음에 다시 튜브를 놓습니다.
    4. 그들의 저온 저장 및 전송에서 냉장된 튜브 멋진 랙에서 벤치 관련 효소를 검색 합니다. 튜브, 빠른 스핀을 터치 하 여 각 효소를 혼합 하 고 냉장된 튜브 멋진 선반에 다시. 효소를 pipetting 때 정확한 볼륨 전송을 보장 하기 위해서 천천히 발음. 또한, 후 아래로 pipetting으로 마스터 믹스에 팁을 세척.
    5. 효소는 추가 부드럽게 펄스-소용돌이 마스터 믹스 5 번을 모든 구성 요소, 다음 빠른 스핀의 동등한 배급을 보장 즉시 튜브 얼음에 다시.
    6. 얼음, 약 새로운 저수지 96 잘 접시;의 한 행으로 최종 수리/인 산화 마스터 믹스의 적절 한 볼륨 수 aliquoted 수 양: (15 µ L 행의 # x) + 5 µ L 죽은 볼륨. 두 개의 행에 대 한 예제 계산: (15 µ L x 2) + 5 µ L = 35 µ L/잘.
    7. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 샘플의 각 행에 최종 수리/인 산화 마스터 믹스의 15 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 플라스틱 커버와 함께 접시를 봉인, 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에 아래로 회전 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
  2. 비드 정리 후 최종 수리 및 인 산화
    1. 4 ℃ 냉장고에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 및 30% 못/1 M NaCl 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어.
      참고: 30% 못/1 M NaCl 솔루션 하지 않습니다 자석 구슬 포함.
    2. 두 솔루션 모두 실내 온도 도달, 후 각 샘플에 대 한 30% 못/1 M NaCl 및 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 1:2 혼합의 80 µ L를 준비 합니다. 24 샘플 예: 24 = 1920 x 80 µ L µ L (640 µ L 30%의 말뚝/1 M NaCl 및 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 1,288 µ L).
    3. Aliquot 구슬 솔루션 혼합, 같은 볼륨, 저수지 96 잘 접시의 한 행으로 하 고 실내 온도에서 보관. Aliquot EB 버퍼 (40 µ L 샘플 당 행의 # x) 저수지 깨끗 한 96 잘 접시의 한 행에. 두 개의 행에 대 한 예: 40 µ L x 2 = 80 µ L/잘.
    4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 추가 준비 구슬 믹스의 75 µ L 단계의 4.1.7 4.2.2 샘플의 각 행에 단계 10 번 아래로 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 3.3.3-3.3.10 단계에에서 설명 된 대로 15 분 계속 구슬 정리 절차에 대 한 실 온에서 품 어. 플라스틱 도장, 빠른 회전 플레이트 커버 하 고 얼음에 그것을 배치. 4.3 단계로 진행 합니다.
  3. A-미행 반응
    1. A 미행 반응 (표 7)에 필요한 모든 시 약 (효소)를 제외 하 고는-20 ° C 냉동 고에서 가져옵니다, 그리고 실 온에서 녹여 다음 얼음을 즉시 전송 합니다.
    2. 얼음에 working, 표 7 살 균, 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 A 미행 마스터 믹스를 설정 하려면 따릅니다. 4.1.4-4.1.6 단계에에서 설명 된 대로 일반 효소 brew 설치 지침을 따릅니다.
    3. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 샘플의 각 행에 A-미행 마스터 믹스의 15 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 10 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. PCR 커버 플레이트를 봉인, 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에 아래로 회전 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 thermocycler에서 품 어. 부 화 후 1 분 동안 200 x g에서 내려 접시를 회전 하 고 실 온에서 보관 합니다.
  4. 비드 정리 후 A-미행
    1. 4.2 단계에서 설명 하는 단계를 수행 합니다. 플라스틱 도장, 라벨 “A 꼬리 + BC”, 빠른 회전, 플레이트 커버 하 고 얼음에 그것을 배치. 4.5 단계로 진행 합니다.
  5. 어댑터 결 찰
    1. 어댑터 결 찰 반응 (표 8)에 대 한 필요한 모든 시 약 (효소)를 제외 하 고는-20 ° C 냉동 고에서 가져옵니다, 그리고 실 온에서 녹여 다음 얼음을 즉시 전송 합니다.
    2. 10 µ M PE 어댑터 (보충 표 1) 재고 솔루션을 검색 하 고 희석 0.5 µ M EB를 사용 하 여. 펄스 vortexing에 의해 잘 혼합. 필요한 볼륨은 3 µ L의 샘플 # x. 작업을 얼음, aliquot 0.5 µ M PE 어댑터, 같은 볼륨, 96-잘 깨끗 한 저수지 판의 12 우물에. 얼음에 그것을 유지.
    3. 얼음에 working, 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 어댑터 결 찰 마스터 믹스를 설정 하려면 테이블 8 따릅니다. 4.1.4-4.1.6 단계에에서 설명 된 대로 일반 효소 brew 설치 지침을 따릅니다. 5 X 빠른 결 찰 버퍼는 완전히 해 동 하 고 아주 잘 사용 하기 전에 혼합 다는 것을 확인 하십시오.
    4. 에 얼음, 약 수는 적절 한 양의 새로운 저수지 96 잘 접시의 한 행으로 어댑터 결 찰 마스터 믹스. 예를 들어 두 개의 행에 대 한 계산: (23 µ L x 2) + 5 µ L = 51 µ L/잘. 얼음에 플레이트를 유지.
    5. 0.5 µ M의 2 µ L 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 단계 4.4.1 믹스에서의 각 행에 끝 결합 (PE) 어댑터. 팁 행 사이 변경 합니다.
    6. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 샘플의 각 행에 어댑터 결 찰 마스터 믹스의 23 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 15 번을 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 레이블 “결 찰”, 4 ° C에서 1 분 동안 200 x g에 아래로 회전 금속 덮개를 가진 격판덮개를 봉인 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어.
  6. 제 4 일: 비드 정리 #1 어댑터 결 찰 후
    1. 4 ℃ 냉장고에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션을 검색 하 고 적어도 30 분 동안 실 온에서 품 어. 솔루션 평형 하는 동안 준비 신선한 70 %EtOH.
    2. 약 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션 수, 96-잘 저수지의 한 행으로 샘플 당 55 µ L 플레이트 및 실내 온도에서 보관. 두 개의 행에 대 한 예: 2 = 110 x 55 µ L µ L/잘.
    3. Aliquot EB 버퍼, 96-잘 깨끗 한 저수지 접시의 한 행으로 샘플 당 50 µ L. 두 개의 행에 대 한 예: 50 µ L x 2 = 100 µ L/잘.
    4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 단계의 4.5.6 결 찰 판에 샘플의 각 행에 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 48 µ L을 추가 하 고 10 배 아래로 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 3.3.3-3.3.7 단계에에서 설명 된 대로 15 분 계속 구슬 정리 절차에 대 한 실 온에서 품 어.
    5. 플레이트 자석 및 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 접시를 받아 45 µ L EB (자료 테이블)를 추가 합니다. 10 배를 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 팁 행 사이 변경 합니다. 3 분 elute 실내 온도에 대 한 품 어.
    6. 부 화, 후 IP 반응 접시 접시 자석에 다시 배치 구슬 방해 없이 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 2 분에 대 한 품 어, 신중 하 게 새로운 96 잘 접시의 해당 우물에는 상쾌한 전송. “결 찰 + 1 BC” 접시를 레이블을 지정 합니다.
    7. 각 잘 하 10 x PCR 고화질 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 잘 혼합. 팁 행 사이 변경 합니다. 플라스틱 도장, 빠른 회전, 플레이트 커버 하 고 실내 온도에서 보관.
  7. 비드 정리 #2 어댑터 결 찰 후
    1. 다음 변경 4.6 섹션에 설명 된 대로 비드 정리 수행: 각 활성 잘 결 찰 + 1 기원전 플레이트 (단계 4.6.7)에서 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 60 µ L을 추가 하 고 EB 버퍼의 35 µ L를 사용 하 여 구슬에서 elute. “결 찰 + 2 BC” 접시를 레이블 하 고 얼음에 그것을 유지.
  8. PCR 증폭
    1. -20 ° C 냉동 고에서 모든 고 시 약 (효소)를 제외 하 고 PCR 반응 (표 9)에 필요한를 가져옵니다, 그리고 그들을 실 온에서 해 동 후 즉시 얼음에 그들을 배치.
    2. 얼음에 working, 불 임, 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 PCR 마스터 믹스를 설정 하려면 테이블 9 따릅니다. 4.1.4-4.1.5 단계에에서 설명 된 대로 일반 brew 설정 지침을 따르십시오. 에 얼음, 약 수는 적절 한 양의 새로운 저수지 96 잘 접시의 한 행으로 PCR 주인 혼합. 얼음에 그것을 유지. 4.5.4 샘플 계산에 대 한 단계를 참조 하십시오.
    3. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 얼음에서 작업 각 고유 12.5 µ M PCR 뇌관 (보충 표 2)에 결 찰에 각 잘 + 2 BC 플레이트 (단계 4.7.1) 인덱싱 역방향의 2 µ L을 추가 하 고 위아래로 천천히 섞어. 팁 행 사이 변경 합니다. 얼음에 플레이트를 유지.
    4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 얼음에 작업 추가 샘플의 각 행에 마스터 PCR 혼합의 23 µ L 단계 4.8.3 믹스에서 10 배 아래로 pipetting으로. PCR 커버 플레이트를 봉인, 1 분, 200 x g에서 스핀 다운 및는 thermocycler에서 품 어 (PCR 순환 조건 표 10 참조).
  9. 비드 정리 PCR 증폭 후
    1. PCR 확대 후 1 분, 4 ° c.에 대 한 200 x g에서 접시를 회전 다음 변경 4.6 섹션에 설명 된 대로 구슬 정리 수행: 각 PCR 반응에 20% 말뚝/1 M NaCl 자석 구슬 솔루션의 51 µ L을 추가 하 고 EB 버퍼의 25 µ L를 사용 하 여 구슬에서 elute. 알루미늄 커버 플레이트 및 스핀 다운 200 x g에서 1 분 저장소-20 ° c.에 샘플
    2. 생성 된 라이브러리의 유효성을 검사 하려면 형광 기반 분석 결과 사용 하 여 DNA 정량화를 수행, 칩-기반 모 세관 전기 이동 법 분석기 (높은 감도 분석 결과)를 사용 하 여 최종 제품을 시각화 하 고 농축을 실행 정량 PCR (정량) (참조 대표 결과, ndChIP-seq 라이브러리 품질 정량 유효성 검사).

Representative Results

Discussion

Chromatin 수정 및 transcriptional 규칙에서 위치 하는 nucleosome의 조합 성격을 감안할 때, 이러한 기능의 동시 측정 하는 방법 후 성적인 규정에 새로운 통찰력을 제공 것입니다. 여기에 제시 된 ndChIP-seq 프로토콜은 히스톤 수정 및 드문 1 차 셀9,10nucleosome 밀도 동시 심문 수 있도록 최적화 된 네이티브 칩 seq 프로토콜이입니다. ndChIP-seq 활용 chromatin의 효소 소화, 쌍 간 대규모 병렬 시퀀싱 및 가우스 혼합 배포 모델을 사용할 경우, 단일 nucleosome 수준 조사 히스톤 수정에 대 한 수 고는 deconvolution epigenomic 프로필 인구 내에서 성분에 의해 구동. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 이전 면역을 시 켰 던 조각 크기, 쌍 간 경계, ChromHMM10,24에 의해 정의 된 특정 chromatin 상태와 관련 된 읽기에 의해 결정의 독특한 분포를 보고 있다.

NdChIP-seq 도서관의 질 항 체 특이성, 감도, 최적의 MNase 소화 조건, 및는 chromatin의 품질 등 여러 요인에 따라 달라 집니다. 사용 하는 항 체의 특이성은 성공적인 ndChIP-seq 라이브러리 생성에서 결정적 이다. 이상적인 항 체 다른 epitopes와 작은 교차 반응성으로 관심의 피토 프에 대 한 높은 선호도 보여줍니다. 그것은 동등 하 게 자석 구슬 선택의 항 체에 대 한 높은 선호도 선택 하는 것이 중요입니다.

MNase 소화가이 프로토콜에 중요 하 고 시간 및 농도 민감한 반응입니다. 따라서, 여러 개의 샘플을 처리할 때 그것은 중요 한 시간의 상응 하는 금액에 대 한 각 반응에 대 한 알을 품는 (단계 2.2 참조). chromatin의 품질이 크게 ndChIP이 Fragmented chromatin 리드 낮은 신호 대 잡음 비와 최적의 MNase 소화 프로필 및 라이브러리에서 결과의 결과 초래 하는 또 다른 요인은. 낮은 기본 샘플 세포 생존 능력 또는 염색 질, 타락 한 같은 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직이이 프로토콜에 대 한 권장 하지 않습니다.

Chromatin 추출 하는 동안 그림의 추가 감소 (즉, 무작위) chromatin 조각화 및 보존의 무결성 히스톤 꼬리를 바라지 않는. 따라서, 그림 사용 하 여 세포의 용 해 버퍼와 그냥 이전 immunoprecipitation 버퍼에 추가 해야 합니다. Cytometry 통해 선택 셀 가능한 셀을 선택 하 고 확인 하는 동안 셀 셀 번호 추정의 정확성과 세포의 생존 능력을 증가 하는 낮은 흐름 율에 정렬 됩니다. 세포 세포의 용 해 버퍼에 직접 정렬 하지 마십시오. 칼 집 버퍼 세포의 용 해 버퍼를 희석 하 고 세포 막의 효과적인 permeabilization MNase를 방지. 셀 또는 유기 체의 종류에 따라 적정 MNase의 최적의 소화를 얻기 위해 필요할 수 있습니다.

ndChIP-seq 포유류 세포에 광범위 한 표시 및 입력에 대 한 좁은 표시 및 100 백만 쌍 읽기 (50 백만 조각) 50 백만 쌍 읽기 (25 백만 조각)의 최소 시퀀싱 깊이 필요합니다. 가우스 혼합물 분배 알고리즘 라이브러리가이 추천 아래 크게 깊이 시퀀스에 최적으로 수행 되지 않습니다. ndChIP-seq는 모노 또는 디 nucleosome 지배 발기인으로 모노 및 디 nucleosome 조각 길이 대 한 가중치 분포 값 간의 구분이 약간 발기인 분류 하지 것입니다. 따라서, 이러한 발기인 이후 분석에서 제거 되어야 합니다. 생물 복제 예측된 배포판에 대 한 자신감을 증가 하 고 MNase 소화 및 도서관 건설에서 기술 변화를 식별을 생성할 수 있습니다.

네이티브 칩 seq 프로토콜의 이전 반복, 달리 ndChIP-seq nucleosome 밀도, 통합 조각 크기 게시물 immunoprecipitation를 이용 하 여 염색 질 구조와 히스톤 수정의 조합 효과 조사 하는 수단 제공 MNase 접근성, 히스톤 수정 측정에 의해 결정. NdChIP-seq의 응용 프로그램 기본 세포와 조직에 epigenetic 규제의 통합 특성에 새로운 통찰력을 제공 하 고 인구 내의 성분으로 인해 후 서명 식별을 허용.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

1M Tris-HCl –pH 7.5Thermo Scientific15567-027
1M Tris-HCl –pH 8Thermo Scientific15568-025
0.5M EDTAThermo ScientificAM9260G
5M NaClSigma1001385276
Triton X-100Sigma1001412354
Sodium-DeoxycholateSigma1001437582
SDSThermo Scientific15525-017
Sodium-BicarbonateFisher ScientificS233-500
100% EtOHNANA
V-bottom 96 well plate (AB 1400)Thermo ScientificAB-1400-L
Gilson P2 pipetmanMandelF144801
Gilson P10 pipetmanMandelF144802
Gilson P20 pipetmanMandelF123600
Gilson P100 pipetmanMandelF123615
Gilson P200 pipetmanMandelF123601
Gilson P1000 pipetmanMandelF123603
Micrococcal Nuclease NEBM0247S
Thermo Mixer C (Heating block mixer)Eppendorf5382000023
Multi 12-channel Pippet P20Rainin17013803
Multi 12-channel Pippet P200Rainin17013805
1.5 ml LoBind tubeEppendorf22431021
0.5 ml LoBind tubeEppendorf22431005
Plastic Plate CoverEdge Bio48461
PCR coverBio RadMSD-1001
Aluminum Plate CoverBio RadMSF-1001
Elution buffer (EB buffer)Qiagen19086
1M DTTSigma646563
Eppendorf 5810R centrifuge Eppendorf22625004
Ultrapure waterThermo Scientific10977-015
Protein G dynabeadsThermo Scientific10001D
Protein A dynabeadsThermo Scientific10001D
Protease inhibitor CocktailCalbiochem539134
Rotating platformMandel1b109-12052010
Plate magnetAlpaqua2523
Domed 12-cap stripBio RadTCS1201
Buffer G2Qiagen1014636
ProteaseQiagen19155
Tube Magnet (DynaMag-2)Thermo Scientific12321D
Tube Magnet (DynaMag-2)LabCore730-006
V shape Plastic reservoirMandelS0100A
VortexMandelC1801
Mini FugeMettler ToledoXS2035
Analytical scaleMandelLB109-12052010
Quick Ligation Reaction Buffer, 5XNEBB6058S
DNA Polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBM0210S
Klenow Fragment (3'-5' exo)NEBM0212S
T4 DNA PolymeraseNEBM0203S
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201S
Deoxynucleotide Solution mix, 10mMNEBN0447S
dATP Solution 10mMNEBN0440S
Quick T4 DNA LigaseNEBM0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP), 25mMNEBP0756S
DNA PolymeraseThermo ScientificF549L
NEBuffer 2NEBB7002S
Hank's buffered salt solutionThermo Scientific14025076
Fetal bovine serum Thermo ScientificA3160702
phosphate buffer saline Thermo Scientific10010023
H3K4me3Cell Signaling9751S
H3K4me1DiagenodeC15410037
H3K27me3DiagenodepAb-069-050
H3K36me3Abcamab9050
H3K9me3DiagenodeC15410056
SeraMag  super-paramagnetic beads
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Lorzadeh, A., Lopez Gutierrez, R., Jackson, L., Moksa, M., Hirst, M. Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis. J. Vis. Exp. (130), e56085, doi:10.3791/56085 (2017).
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