생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

요약

IκB 키 1/α (IKK1/α CHUK)는 Ser/Thr 단백질 키 니 아 NF κB 녹음 방송 요인의 활성화를 통해 주로 세포 활동의 무수 한에 관련 된 이다. 여기, 우리가 생산 및이 단백질의 크리스탈 구조 결정에 필요한 주요 단계를 설명합니다.

초록

세포 외 자극의 클래스는 NF-κB 소 단위, p52의 선구자 p100의 처리를 통해의 생성을 유도 하 IKK1/α의 활성화를 필요 합니다. p52는 homodimer 또는 heterodimer 다른 NF-κB 소 단위, RelB와 함께 작동합니다. 이러한 이합체 차례로 염증, 세포 생존, 및 세포 주기 관련된 유전자의 수백의 표정을 통제 한다. IKK1/α 주로 삼항 복합물으로 니 모 IKK2/β와 관련 된 남아 있습니다. 그러나, 그것의 작은 수영장은 또한 낮은 분자량 complex(es)로 관찰 된다. 그것은 p100 처리 작업 내의 더 큰 IKK1/α의 활성화 또는 작은 복잡 한 수영장에 의해 트리거되는 경우 불명 하다. IKK1/α의 제정 활동 여러 암 및 염증 성 질환에서 발견 되었습니다. IKK1/α의 활성화의 메커니즘을 이해 하 고 약물 표적으로 그것의 사용을 가능 하 게, 우리는 대장균, 다른 호스트 시스템에 재조합 IKK1/α를 표현, 곤충 및 포유류 세포. 에 성공 하는 우리 곤충 세포, 밀리 그램 양의 매우 순수한 단백질을 얻기, 억제제, 존재 crystallizing 및 그것의 x 선 결정 구조를 결정 감염 성 IKK1/α 잠재에 표현. 여기, 우리는 재조합 단백질, 그것의 결정 화 및 그것의 x 선 결정 구조 결정 하는 자세한 단계를 설명 합니다.

서론

Dimeric 녹음 방송 요인 NF-κB 가족의 transcriptional 활동은 염증과 면역에서 생존과 죽음에 이르기까지 다양 한 세포 기능에 필요 합니다. 이러한 활동은 세포와 자가 면역 질환, 그리고 암^1,2,3를 포함 하 여 다양 한 병 적인 조건에 규제 리드의 손실에 엄격 하 게 제어 됩니다. 자극의 부재에서 NF-κB의 활동 저해 IκB (-κB의 억제제) 단백질⁴에 의해 유지 됩니다. IκB 단백질에 특정 Ser 잔류물 인 산화 ubiquitination 및 후속 proteasomal 저하 또는 선택적 처리⁵에 대 한 그들을 표시합니다. 두 개의 높은 동종 Ser/Thr kinases, IKK2/β와 IKK1/α, NF-κB 활동의 중앙 레 귤 레이 터가 인 산화 이벤트^6,7을 수행 하 여 역할.

ligand와 수용 체 간의 상호 작용 transduces NF κB 요인의 활성화를 선도 하는 중재자의 시리즈를 통해 신호. NF-κB 신호 과정은 광범위 하 게 두 가지 경로-정규 및 비정규 (대체)⁸로 나눌 수 있다. IKK2/β의 활동은 주로 염증 성 및 타고 난 면역 반응⁹필수적인 정식 통로의 NF-κB 신호 통제 한다. 이 통로의 뚜렷한 특징은 지금까지 화학적 새롭거나 IKK 복잡 한 내 IKK2/β¹⁰ 의 신속 하 고 단기 활성화-IKK1 및 IKK2, 뿐만 아니라 규제 구성 요소, 니 모를 찾아서 (NF κB 필수 변조기의 구성 될 것으로 추정 )^11,,1213. 2 개의 촉매 IKK subunits IKK 복합물의, 사이 IKK2는 주로 책임¹⁴ 원형 IκBs (α-β,-γ)의 특정 잔류물의 인 산화에 대 한 NF-κB, 그리고 또한 비정형 IκB 단백질에 바인딩된은 NF-κB1/p105는 NF-κB p50 소 단위⁵의 전조 인 산화 유도 ubiquitination 그리고 proteasomal IκB (또는 p105의 처리)의 저하 리드 릴리스 및 NF κB 이합체¹⁵의 특정 집합의 활성화. IKK2의 미 규제 기능 때문에 탈 선 NF κB 활동 면역 질환^2,,316에서 뿐만 아니라 많은 암에 관찰 되었습니다.

IKK2/β, 달리 IKK1/α의 활동 NF κB 개발 및 내성에 대 한 필수적입니다 정식이 아닌 통로의 신호 조절. IKK1 phosphorylates의 처리, p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 특정 잔류물. Transcriptionally 활성 p52:RelB heterodimer 형성 발달 신호^{7,17,18,,1920}느리고 지속적인 응답을 시작합니다. 흥미롭게도,이 통로의 중앙 NF κB 요소 p52의 세대는 또 다른 요인은, NF-κB 유도 니 (닉)^21,22에 IKK2 또는 니 비판적으로 의존 합니다. 휴식 셀에 닉의 수준 때문에 상수 프로테아좀 종속 저하^23,,2425낮은 남아 있습니다. ' 비정규 ' ligands에 의해 그리고 특정 악성 세포에서 세포의 자극, 시 닉 모집을 활성화 하 고 IKK1 안정 된다/α. 닉의 IKK1 키 니 아 제 활동 p52⁷에 p100의 효율적인 처리를 위해 필수적인. IKK1와 닉 phosphorylate 처리 및 p52의 세대의 C-터미널 IκBδ 세그먼트에 NF-κB2/p100의 3 serines (Ser866, 870, 872). 비정규 통로의 탈 선 활성화 여러 myeloma^26,,2728를 포함 하 여 많은 악성 종양에 연루 되었습니다.

비록 아무도 지금까지 것으로 밝혀졌다는 효과적인 약 IKK2/β에 대 한 몇 가지 매우 효율적이 고 구체적인 억제제 알려져 있습니다. 반면, IKK1/α-특정 억제제 스파스 있습니다. 이 일부 IKK1/α, 셀, 및 합리적인 약 디자인에 IKK1에 의해 NF-κB의 활성화의 기계 기초의 우리의 이해를 제한에 대 한 구조 및 생 화 확 적인 정보의 부족에서에서 줄기 수 있습니다. IKK2/β의 엑스레이 구조 IKK2/β²⁹;의 인증 메커니즘에 대 한 통찰력 제공 그러나, 이러한 구조는 어떻게 다른 업스트림 자극 공개 하지 수 IKK1/α 또는 IKK2/β NF κB 활동 ^30,31의 명료한 세트를 규제의 활성화를 방 아 쇠. 기계적으로 IKK1/α의 뚜렷한 신호 기능을 기본을 이해 하 고 합리적인 약 디자인을 위한 플랫폼을 구축, 우리 IKK1/α의 구조 결정에 집중 했다.

프로토콜

1. 재조합 형 바이러스 IKK1/α의 대규모 식 적합의 준비

1. P1 바이러스 준비 ³²
   1. 주: 1 격판덮개 Sf9 셀 (6 ~ 10 X⁵) (통로 번호 10 미만) 각 Sf900 III 곤충 세포 매체의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 잘와 27 ° c.에 품 어 6 ~ 10 X의 밀도에 신선한 미디어로 diluting 하 여 정지에 mL 당 2 ~ 3 × 10⁶ 셀의 밀도 도달할 때 셀 통로⁵.
   2. 주 2: 8 µ L 항생제 및 혈 청 하지 않고 Sf900 III 또는 그레이스의 곤충 매체의 100 µ L에서 Sf9 transfection 시 약의 희석. 짧게 소용돌이입니다.
   3. 1 µ g 키트 정화 재조합 bacmid (자세한 내용은 ' 대표 결과 '에서 제공 됩니다)의 희석으로 별도 튜브에서 같은 매체의 또 다른 100 µ L³² .
   4. 희석된 DNA와 transfection 시 약 (전체 볼륨 ~ 210-220 μ), 결합 하 고 15-30 분 동안 실 온에서 품 어.
   5. 우물에서 매체를 제거 합니다. 항생제 및 혈 청 하지 않고 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다.
   6. 셀에 dropwise 희석된 DNA transfection 시 혼합물을 추가 합니다. 부착 세포를 꺼내 하지 않습니다 같은 드롭 크기를 조정 합니다.
   7. 후 ~ 6 h 위에 1.5 mL 신선한 매체의 추가 또는 매체를 제거 하 고 2.5 mL 신선한 매체의 추가. 추가 하기 전에 25-27 ° C에 따뜻한 신선한 매체.
   8. 27 ° c.에 셀을 품 어 주기적으로 바이러스 성 감염의 징후에 대 한 모든 ~ 12 h 우물을 확인 하십시오. 모든 Sf9 유지 보수 및 27 ° c.에 식
   9. 제 5 일: 셀 60-72 h 포스트 감염을 포함 하는 매체를 꺼내. G와 4 ° C x 500에서 5 분 동안 원심 분리기 상쾌한; 저장 이것은 P1 바이러스 주식 이다. -80 ° c.에 작은 aliquots 고정
2. P1 바이러스 복제를 표현 하는 최고의 선택.
   1. 1.1 단계에 설명 된 대로 마찬가지로 플레이트 세포입니다.
   2. 다음 날 또는 ~ 6 h 포스트 도금, 다른 우물에서 20 µ L와 셀에 서로 다른 P1 바이러스 복제 주식 50 µ L를 추가 합니다.
   3. 부드러운 pipetting으로 부착 세포를 꺼내와 centrifuging g와 4 ° C x 500에서 5 분에 의해 감염 된 세포 60-72 h 포스트 감염을 수확 상쾌한을 저장 합니다. 이것은 P2 바이러스 주식 이다. -80 ° c.에 주식의 작은 aliquots를 저장
   4. 수확된 셀 펠 릿에 2 x Laemmli SDS 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 열 > 10 분 원심 분리기에 대 한 95 ° C (일반적으로 > 10000 g x) 5 분.
   5. 염료 전면 젤의 하단에 도달할 때까지 8-10 %SDS-120-160 V에서 페이지에 각 샘플의 10-15 µ L를 실행 합니다.
   6. 전기 전송 표준 세미 드라이 의해 확인 된 단백질 전송 프로토콜 (20 V, 30-45 분) 니트로/PVDF 막에.
   7. 안티-IKK1 항 체와 오 점 (희석 ~ 1:2, 000, 낙관 한다) 또는 안티-PentaHis 항 체 (희석 ~ 1:3, 000, 낙관 한다) 식에 대 한.
   8. 재조합 IKK1의 식을 비교 하 여 최고의 P1 바이러스 복제를 선택 합니다.
3. 대규모 P3 바이러스 주식 준비 합니다.
   1. 마찬가지로 Sf900 III 매체의 25-30 mL를 포함 하는 15 cm 접시에서 1.1 단계에 설명 된 대로 플레이트 세포.
   2. ~ 6 h 도금 게시물, 셀에 최고의 표현 P1 바이러스 주식의 150-300 µ L를 추가 합니다.
   3. 72 h 후 감염 게시, 발음 (살 균), 적당 한 튜브에 접시에서 신중 하 게 매체 및 원심 500-1000 X g 4 ° c.에서 10 분에 관 (하나는 형성) 하는 경우 셀 펠 릿을 무시 하 고는 상쾌한 저장 합니다. 이것은 P3 바이러스 주식 이다.
4. 대규모 단백질 표정에 대 한 최적의 바이러스 titre 결정
   1. 1.1 6-잘 접시에에 설명 된 대로 Sf900 III 매체의 2 mL에 플레이트 세포.
   2. 20, 30, 40, 그리고 별도의 바이러스 재고가 우물 게시물 도금 ~ 6 h p 3의 50 µ L를 추가 합니다. 감염 되지 않은 컨트롤을 포함 합니다.
   3. 각 잘 48-60 h 포스트 감염에서 세포를 수확.
   4. 2 X Laemmli SDS 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 열 > 10 분 분리기 (14000 x g)에서 일반적으로 5 분 동안 95 ° C.
   5. 8-10 %SDS-PAGE 젤에 각 샘플의 10-15 µ L를 해결.
   6. 1.2.6에서 언급 한 대로 해결된 단백질 니트로/PVDF 막에 전송.
   7. 안티-IKK1 항 체와 오 점 (희석 ~ 1: 2000, 낙관 되어야 한다) 또는 안티-PentaHis 항 체 (희석 ~ 1:3000, 낙관 되어야 한다).
   8. 바이러스를 사용 하 여 대규모 식 titre 표현 하는 최고의.

2. 대규모 표현의 6 x 그의 인간 IKK1^29,33 태그

1. 서 스 펜 션 문화에 대규모 식 실시 합니다. 배기 모자 2 L 삼각 플라스 크에 Sf900 III 매체의 1 L에 셀을 분할 합니다. 셀 밀도 ~⁵ 셀/10ml x 5 여야 합니다.
2. ~ 2 일 1-2 10⁶/mL x의 밀도 도달할 때까지 통에 27 ° C에서 ~ 100 rpm에이 세포를 성장. 셀 밀도 2 x 10⁶/mL을 초과 하지 않아야 합니다.
3. 1.4에서 평가 P3 바이러스의 원하는 금액을 추가 합니다.
4. 성장 통에 27 ° C에서 ~ 100 rpm에서 48-60 h에 대 한 감염 된 문화.
5. 원심 분리에 의해 세포를 수확 < 4 ° c.에 1500 x g
6. 셀 펠 렛을 저장 하 고 매체를 삭제.
7. 단백질 정화로 직접 이동 합니다. 플래시 액체 질소에 나중에 사용-80 ° C에 게 셀 펠 릿을 동결.

3. IKK1 그의³³ 의 정화

1. 하루에 1, 세포의 용 해 버퍼의 40 mL에 셀 펠 릿 resuspend (25mm Tris pH 8.0 0.2 %NP-40, 200 mM NaCl, 이미 10 m m, 10% 글리세롤, 5mm β-mercaptoethanol, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일).
   참고: 젖은 셀 펠 릿 대량 결정 하지 했다. 일반적으로, 문화의 ~ 2 L이이 단계에 대 한 사용 되었다.
2. 쥡니다 60-70% 듀티 사이클, 간격 30 s의 5-10 펄스에 의해 세포를 lyse > 세포 현 탁 액을 유지 하는 1 분 얼음에 냉장.
   참고:이 단계는 최적화를 sonicator의 각 모델 필요합니다. 샘플을 10 ° c.의 위 워밍업 하지 마십시오
3. 4 ° c.에 45 분 ≥ 28000 x g에서 원심 분리 하 여는 lysate 명확히
4. 4 mL의 Ni NTA Agarose 수 지 세포의 용 해 버퍼와 믹스는 명확히 lysate (상쾌한) 제조 업체의 프로토콜을 따르고 equilibrate
5. 단백질 2 h 4 ° C 방에 회전 믹서에 대 한 배양 하 여 수 지를 바인딩할 수 있습니다.
6. 30 mM 이미 포함 된 세포의 용 해 버퍼와 수 지를 철저히 씻으십시오. Bradford 분석 실험을 사용 하 여 주기적으로 세척 분수에서 단백질 농도 확인 합니다. 워시 워시 분수에이 단백질 농도 0.1 mg/mL에 도달할 때까지. 일반적으로 > 20 침대 양의 워시 버퍼는이 지점에 도달 해야 합니다.
7. 차입 버퍼 (250 m m 이미 포함 된 세포의 용 해 버퍼) 20 mL를 사용 하 여 중력 흐름에서 그의 태그 IKK1/α 단백질 elute 1-1.5 mL 분수를 수집 합니다.
8. 모든 분수 Laemmli 버퍼와 혼합에서 샘플의 5-10 μ를 로드 하 여 8 또는 10 %SDS 페이지 젤에 eluted 단백질의 순도 확인 합니다.
9. 피크 분수 (농도 ≥ 2 mg/mL), 수영장과 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 농도 측정.
10. (1시 30분-50 (TEV 프로 테아 제: IKK1)) TEV protease 하룻밤 (h ≥12) 4 ° c.에와 소화
    참고: 최적화 TEV 프로 테아 제에 필요한 금액의 6 X 그의 태그 선험적(≥ 95%) 소화를 완료. TEV 프로 테아 제는 집에서 순화 되었다.
11. 하루 2의 아침에 1mm ATP 20 m m MgCl₂의 존재, 20 m m β-glycerophosphate, 10 mM, NaF와 27 ° c.에 1 시간에 1mm 나트륨 orthovanadate 단백질을 품 어
12. 단백질 해결책 0.45 또는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
13. 자동된 액체 크로마토그래피 시스템에 연결 된 ~ 120 mL 대리점 크기 제외 열에 샘플의 6 mL 로드. Equilibrate 버퍼 A 열 (20 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 m m NaCl, 5mm DTT, 5% 글리세롤), 단백질 견본을 적용 하기 전에.
    참고: 작은 열 수 사용 단백질의 수익률에 따라 Ni NTA 선호도 정화 단계 후. 조정/열 량의 5% 부하 볼륨 계산).
14. 1 mL/min의 유량에서 크기 배제 크로마토그래피를 실행 하 고 280 및 254 nm에서 차입을 모니터링. 2 mL 크기의 분수를 수집 합니다.
15. 피크 분수의 순도 확인 (~ 60-70의 주위에 일반적으로 mL)에 8-10 %SDS-PAGE 젤.
16. Pool 순수한 분수 (이들 mg/mL의 농도와 순도 ≥95%) 하 고 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷오프 원심 단백질 집중 장치 제조업체의 지침에 따라에 집중.
17. 정기적으로 브래드 메서드에서 집중의 단백질 농도 확인 하 고 8-12 mg/mL까지 샘플을 집중.
18. 25 μ aliquots 및 액체 질소에 플래시 동결 분배. 이러한 플래시 냉동된 샘플-80 ° C 냉동 실에 저장 합니다.

4입니다. 화면 IKK1의 결정 화 조건에 대 한

1. 화면 아래에 설명 된 방법에 따라 결정 하는 데 필요한 단백질의 (볼륨)에 의해 총 금액을 계산 합니다.
2. 시도 다른 억제제 (일반 kinase 억제제: AMPPNP, 및 Staurosporine; IKK-specific 억제제: MLN120B, 화합물, 및 IKK 억제제 XII) 결정 화에 대 한 심사를 수행 하기 위해. 제조업체의 지침에 따라 이러한 화합물의 재고 솔루션을 확인 합니다. 재고 솔루션에 화합물의 최대 농도 20 μ M를 초과 하지 않는 확인 하십시오.
3. 200 μ M 억제제와 IKK1의 혼합 100 μ M에 의해 결정 화 화면에 대 한 복잡 한 IKK:inhibitor를 준비 하 고 30-40 분 원심이 혼합물에 대 한 18-20 ° C에서 품 어 > 실 온에서 2 분 동안 15000 x g. 결정 화 화면에 대 한 상쾌한을 저장 합니다.
4. 상업적으로 사용 가능한 결정 화면 ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.
5. 96 잘 접시의 저수지로 멀티 채널 피 펫 또는 로봇을 사용 하 여 각 결정 화 시 약 (저수지 솔루션)의 80-100 μ 플라스틱 접시 이제 상품을 설정할 준비가 되어 있습니다. 접시에 2 ~ 3 결정 화 방울 수용 2-3 억제제 단일 플레이트에서 상영 될 수 있도록 확인 하십시오.
6. 결정 화 로봇을 사용 하 여, 분배 하 고 혼합 0.2-0.25 μ 복잡 한 IKK1:inhibitor의 저수지 솔루션의 같은 볼륨.
   참고: 검사 실행 될 수 있다 큰 드롭 볼륨을 사용 하 여 수동으로 (0.5-1.0 저수지 솔루션의 같은 볼륨으로 복잡 한 IKK1:inhibitor의 μ). 그러나, 로봇의 사용은 중요 한 시 약 저장 도움이 될.
7. 광학 투명 필름으로 증발을 피하기 위해 방울을 설정한 후 즉시 접시를 봉인. 적절 한 주걱을 사용 하 여 제대로 봉인. 각 억제제 집합에 대 한 복제 번호판을 확인 합니다. 18 ° C, 그리고 차가운 방 (온도 범위 4 ~-6 ° C)에서 다른 한 접시를 품 어. Incubators 진동에 의해 영향을 받지 않습니다 것을 확인 하십시오.
8. 편광판은 stereomicroscope를 사용 하 여 모양을 결정 각 드롭의 매일 첫 번째 7 일 동안 그리고 더 긴 간격에 대 한 확인. 체계적으로 및 이러한 관찰 점수.
   참고: 사용 하 여 한 stereomicroscope는 편광판과 결정에서 성장 결함을 시각적으로 평가 될 수 있다. 여기, 크리스탈 등장 조건에 어디 저수지 솔루션 포함 3 %w / v Dextran 황산 나트륨 소금 M_r 5000, 0.1 m M BICINE pH 8.5, 15 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 20000. IKK1 크리스탈 IKK 억제제 XII 존재만 성장 했다.

5. 결정 성장 최적화^29,33

1. 재고 솔루션의 준비입니다.
   1. Dextran 황산 이온 H₂o. 필터 솔루션 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 다른 분자량 (평균 MW 5000, 8000, 15000, 40000 다)의 30 %w / v 솔루션을 준비 합니다.
   2. 6.5 9의 pH 범위에서 다른 버퍼의 1 개 M 또는 0.5 M 주식을 준비 합니다. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
   3. 25% 또는 50% (w/v) 다른 분자량의 PEG 솔루션 준비 (평균 MW:1000, 1500, 3,350, 4000, 6000, 8000, 10000, 12000, 20000 다). 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다.
   4. PH, 버퍼 유형, 농도, 및 말뚝 및 Dextran 황산의 유형을 체계적으로 변화 하 여 그리드 화면을 수행 합니다.
2. 18 ° C에서, 그리고 차가운 방 (온도 범위 4 ~-6 ° C)에서 심사를 최적화 합니다.
3. 잘 솔루션으로 복잡 한 IKK1:Inhibitor의 동일한 금액을 혼합 하 고 밀폐 된 환경에서 잘 솔루션에 품 어. 이 단계를 수동으로 수행할 수 또는 디스 펜스 로봇을 사용 하 여.
   참고: 여기, 크고 잘 정의 된 결정 (균일 한 성장을 표시 편광판에서 균일 한 색으로 평가)로 가져온 다음 조건: 100 mM BisTris pH 7.0, Dextran 황산 (평균 MW 15 kDa), 8.5-10% 말뚝 20의 2.8-3.5% 추운 방에 kDa입니다.

6. 성장 하는 다 수 결정

1. 다음 재고 솔루션을 준비 하 고 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
   1. 0.5 M BisTris pH 7.0, 및 BisTris 프로 판 pH 7.0 및 7.5를 준비 합니다.
   2. 30% (w/v) Dextran 황산 (평균 MW ~ 15 kDa)를 준비 합니다. 4 ° c.에 게
   3. 준비 하는 50% 말뚝 (평균 MW ~ 12 kDa).
2. 사용 24 잘 걸려 드롭 접시.
3. 각 잘 제기 반지에 실 란 트 윤활제를 적용 합니다.
4. (최종 농도) 다음과 같이 잘 솔루션 준비: 100 mM BisTris pH 7.0-7.5, 2.8-3.5 %Dextran 황산 ~ 15 kDa, 8.5-10% ~ 12 kDa 던지다. 1.5 mL 튜브에 1 mL 잘 솔루션을 준비 합니다.
   참고: 결정 화 조건에 사소한 변화는 단백질, Dextran 황산의 배치에 따라 관찰 되었다, 따라서 재판 좁은 범위의 것이 좋습니다. BisTris와 BisTris 둘 다 동일한 pH 범위의 프로 판 버퍼 단일 결정 얻을.
5. 적어도 1 시간에 대 한 차가운 방에 잘 솔루션와 기름칠된 접시를 유지.
6. 4.3에 설명 된 대로 복잡 한 IKK1:Inhibitor를 준비 합니다. 1.5 mL 튜브에서 24 잘 플레이트의 개별 우물 잘 솔루션을 전송.
7. 깨끗 한 시 (상업적 또는 사내 (siliconization/silanization)) 커버 전표 보풀 잎사귀를 사용 하 여 유리 고 지목 하는 높은 압력 공기 제트기는 상용에 어로 졸 살포 기를 사용 하 여 적용.
8. 깨끗 한 커버 슬립에 잘 솔루션의 1-1.5 μ를 놓습니다. 동일한 양의 IKK1:inhibitor 복잡 한 플라스틱, 아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합 3-4 회. 유리 커버 슬립을 설정 하 고 각각에 집게와 잘 놓고 기름에 눌러 잘 밀봉.
9. 24-잘 접시의 모든 방울을 설정한 후 어둠 속에서 차가운 방에 접시를 품 어. 때때로 모양 및 결정의 성장에 대 한 현미경 드랍 스 확인 합니다.
   참고: 그것은 테스트 되지 여부 빛 아래 크리스탈 접시 배양 결과 바꿀 것 이다. 그러나 그것은 중요 한,, 격판덮개는 최소/no 진동 환경에서 알을 품입니다.

7. Cryo 보호 결정의

1. 곳을 알아내는 솔루션의 준비입니다.
   1. 곳을 알아내는 A 준비 (Dextran 황산 염에 ~ 2% ~ 10% 말뚝 12000, 60 mM BisTris 프로 판 (의 의도 잘 솔루션으로 같은 pH), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 m m NaCl, 2.5% 글리세롤).
   2. 곳을 알아내는 B 준비 (~0.3% Dextran 황산, ~ 10% 말뚝 12000, 60 mM BisTris 프로 판 (의 의도 잘 솔루션으로 같은 pH), 5 mM Tris pH 7.5, 40-50 m m NaCl, 20 또는 25% 글리세롤 또는 20 또는 25% 에틸렌 글리콜).
      참고 사항: 글리세롤과 에틸렌 글리콜 (예를 들어, 목이 200, 말뚝 400, MME 550 던지다, 던지다 1000) 이외에 다른 곳을 알아내는-protectants 테스트 합니다.
2. 부드럽게 포함 하는 크리스털 유리 커버 슬립을 제거 하 고 위쪽으로 향하게 하는 크리스탈 드롭 고체 표면에 놓습니다. 부드럽게 드롭, 위에 Cryo A 솔루션의 10 μ를 추가 하 고 크리스탈을 터치 하지 있도록 pipetting으로 부드럽게 혼합.
   참고:이 크리스탈 표면의 파편을 청소 하 고 초기 cryo 버퍼와 크리스털을 equilibrate 하는 데 도움이. 크리스탈을 기계 및 열 스트레스를 하지 마십시오. 크리스탈에 손상을 피하기 위해 현미경 모든 후속 단계를 수행 합니다.
3. 천천히 크리스탈에서 일부 액체를 제거 하 고 유지에 대 한 솔루션의 5-8 μ. 크리스탈의 탈수를 하지 마십시오. 기계적 스트레스와 모든 후속 단계에서 크리스탈의 탈수를 피하기 위해 주의 걸릴.
4. 부드럽게 추가 하락에 Cryo B 솔루션의 2.5-4 μ, 매우 부드럽게 pipetting으로. 크리스털을 통해 직접 공기 흐름을 피하기 위해 작은 페 트리 접시 커버. 5 분 기다립니다 항상 조심 크리스탈 삼투성 압력 또는 탈수의 빠른 변화를 용납 하지 않습니다.
5. 반복 단계 7.4 4 천천히 cryo 솔루션으로 크리스탈을 순응 시간.
6. 곳을 알아내는 솔루션의 10-20 μ가이 단계에서 계속 (즉, 약 20-25%에서 목욕을 크리스탈 허용 cryo 막는 포함 솔루션). 다른 기간 (1 시간 5 분) 최종 cryo-솔루션에 담근 다.
7. 다른 시간 지점에서 여러 결정을 고정 합니다.
8. 신중 하 게 적절 한 자료와 식이-동결 액체 N₂에 장착 된 적절 한 곳을 알아내는-루프에서에서 단 결정을 선택 합니다. 원활 하 고 신속 하 게이 단계를 수행 크리스탈 얼음 형성을 피하기 위해.
   참고: 크리스탈 고급 광자 소스, 아르곤 국립 연구소에서에서 사용 하는 로봇 각도에 장착할 수 있도록 크리스털의 긴 축 보다 약간 더 큰 루프 직경을 사용 하 여 선택 합니다.
9. 곳을 알아내는-루프 키 액체 N₂에 포함 된 크리스탈을 저장 합니다. 그들에 싱크 로트 론 x-선 회절에 대 한 선적을 위한 준비가 될 때까지 액체 N₂ Dewar 플라스 크에에서이 키를 저장 합니다. X 선 회절 데이터 수집 및 처리 (섹션 8 및 9)를 진행 합니다.
   참고: 홈 x 선 소스의 IKK1 결정의 회절 데이터 되지 않았다 구조 결정 실험, 충분히 높은 해상도의 비록는 싱크 로트 론에서 상영 결정의 품질 표시. 모든 회절 데이터 사전 광자 소스, Argonne 국립 연구소, 미국의 다른 beamlines (주로 19ID)에서 수집 했다.

8. x 선 데이터 수집

1. 원격 데이터 수집 소프트웨어³⁴를 사용 하 여 APS 싱크 로트 론 근원의 ID19 beamline에 x 선 회절 데이터를 수집 합니다.
   참고: 100 크리스탈 위쪽으로 그들의 회절 속성에 대 한 테스트 되었습니다. 크리스탈 정기적으로 diffracted Å, 거의 7-11의 해상도를 결정 5 저쪽에 diffracted Å 했다 관찰, 그리고 하나의 큰 크리스탈 4.5 넘어 diffracted Å. 크리스탈 데이터 수집 중 급속 하 게 부패, 이후 데이터 집합 같은 크리스탈의 다른 부분에서 수집 했다. 이것은 때문에 결정 했다 큰 가능 했다 (400 µ m 보다 큰), 그리고 사용 하는 빔 직경 100 µ m.

9. x-선 데이터 처리

1. 동일한 크리스탈³⁴의 다른 부분에서 수집 된 모든 데이터 집합을 병합 합니다.
   참고: 최고의 크리스탈에서 7 데이터 집합 병합 하 고 결과 데이터는 93% 완료. 전체 난 / σ ~ 6.8) 및 Rmerge 높은 해상도 빈 (5.4-4.5 Å)에서 89% 이었다.
2. 프로세스 HKL2000³⁴ 공간 그룹, 단위 세포 크기, 용 매의 증기압 및 비대칭 단위의 그럴 듯 하 게 구성 된 데이터 집합.

10. 구조 솔루션

1. 검색 모델의 준비
   1. HIKK2의 사용 가능한 구조 모델에 따라 (pdb id 4E3C와 4KIK³⁵), N 맨끝 KD의 다른 방향으로 이합체의 일련을 생성 (하 30 그리고 62의 개방 렌더링 Å, P578는 이합체에 두 KD의 사이). 이러한 모델의 광범위 한 실험 후 분자 교체 검색 솔루션을 가져왔습니다.
   2. 단일 입자 cryo-EM 데이터³³에서 IKK1의 지도 생성 합니다.
   3. IKK2의 가장 높은 해결책 구조에서 인간 IKK1의 모델 생성 (pdb id 4KIK).
   4. 곳을 알아내는 EM 밀도 지도 인간 IKK1의 쿳³⁶을 사용 하 여에 인간 IKK1 모델의 개별 도메인을 도킹 합니다. 이 KD 방향 약 24도 회전 하 고 개방 ~ 58 Å N 맨끝 수정.
   5. 곳을 알아내는-EM 장착 모델 (단위체)의 KD 방향을 10.1.1에서 생성 된 모든 이합체에 적용 됩니다.
2. 분자 교체
   1. 10.1.1 10.1.5에서 이합체를 사용 하 여 프로그램 페이저³⁷MOLREP³⁸ , CNS^39,40검색 모델로.
      참고: 여기, a 검색 모델로 10.1.5 (52 Å 오프닝)에서 이합체 중 하나를 사용 하 여, 6 이합체 (2 개의 hexamers)은에 있는 비대칭 단위 MOLREP를 사용 하 여. 검색 모델에 여 52 Å 세련 된 구조에서 이합체 (모든 6 이합체)의 49-50 Å 열기와 비슷합니다.

11. 구조 상세

1. 구조 수정 절차
   1. CNS (cns_solve_1.3)^39,40에 강 체 구체화 하 여 방향과이 초기 모델의 위치를 수정.
   2. 더 최소화 하 고 최대 가능성 대상 기능 및 CNS 시스템^39,40을 사용 하 여 평면 대량 용 매 보정 시뮬레이션 어 닐 링을 사용 하 여 구조를 구체화 합니다.
   3. 2 층_OF_C 에 따라 모델을 구축 하 고 Fo Fc Xtalview⁴¹을 사용 하 여 지도.
      참고: 덴 지원 구체화⁴² 고 NCS는 모델의 정확도 높이기 위해 상세 동안 억제. 실제로, 덴 구체화 극적으로 개선 형상 및 구조의 R 요인 및 R 요인 22.2% 이었고 무료 R 요인은 최종 모델에 대 한 27.8% 이었다. 무료 R의 극적인 개선 때문에 IKK2 모델 (4KIK)에서 생성 된 IKK1 도메인의 높은 정확도 모델 이어야 합니다.

결과

복제 및 IKK1/α의 다른 구조 식
인간 IKK1/α는 N 맨끝 hexa-히스티딘을 자사의 EcoRI 및 노트 제한 사이트 내에서 잠재 식 벡터 pFastBacHTa로 복제 하는 전체 길이 IKK1 태그. 태그는 TEV 프로 테아 제 소화에 의해 제거 될 수 있습니다. 전체 길이 IKK1/α 양쪽 끝에 유연한 영역이 있기 때문에 유연한 영역 일반적으로 렌더링 단백질 구체화 하기 어려운, 우리 IKK1/α pFastBacHTa 벡터의 상술 사이트 내에서 다양 한 잘린된 조각 복제. IKK1/α의 다양 한 잘림 돌연변이 야생-타입 (wt)와 S176E, 180E 생성 된 (EE) 백본. IKK1/α EE phosphorylated 키의 constitutively 활성 폼의 모방을 말합니다. 단백질 표정과 재조합 잠재 생산 이전에 게시 프로토콜을 사용 하 여 약간 수정⁴³ (

토론

두 개의 관련된 IKK 단백질의 구조, 결정 화 및 생산 솔루션
우리 개념 그것은 비교적 간단한 운동 IKK2/β 단백질 생산, 결정 화, 및 구조 결정 우리의 경험을 주어진 것으로 IKK1/α의 x 선 결정 구조를 결정 하기 위해 밖으로 설정 합니다. 그러나, 우리가이 두 가지 관련된 단백질 결정의 용이성에 관한 매우 다르게 행동 매우 놀 랐 다. 여러 높은 프로 파일 실험실에서 노력에도 불구 하 고 IKK1 구조 결정 거의 2 년간 했다. 이 크게 몇 가지 주요 병목 현상에서 비롯 된.

첫 번째 어려움은 매우 순수 하 고 수용 성 단백질 양식을 했다. 곤충 세포 표현 시스템 밀리 그램 양의 합리적으로 수용 했다 순수 단백질을 얻기 위해 우리가 사용할 수 있습니다. 식의 수준에 관한 모든 IKK1/α 구문 IKK2/β 곤충 세포 식 시스템에서 구성 보다 훨씬 낮은 수준에서 표현. 어느 단백질은 가용성과 대장균에 표현 기능을 주...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cellfectin/Cellfectin II	Thermo Fisher Scientific	10362100	Cellfectin은 현재 단종되었으며 Cellfectin II
Sf900 III 곤충 세포 매체	Thermo Fisher Scientific	12658-027
SF9 세포	Thermo Fisher Scientific	12659017
anti-IKK1 항체	Novus Biologicals	NB100-56704	이전에 Imgenex에서 판매
anti-PentaHis 항체	Qiagen	34460
PVDF 멤브레인	Millipore	IPVH00010	니트로 셀룰로오스도 사용할 수 있습니다
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
Bradford 분석 시약	BioRad	500001
Superdex 200 열	GE Healthcare	28989335
Amicon 농축기	Millipore	UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
화합물 A	바이엘
Calbiochem IKK-억제제 XII	Calbiochem	401491
Staurosporine	SIGMA	S4400
MLN120B	Millenium	선물 품목
AMPPNP	SIGMA	A2647
덱스트런 설페이트	SIGMA	51227, 42867, 31404,
덱스트란 설페이트	Alfa Aesar	J62101
PEG	SIGMA	93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172	그들 중 일부는 SIGMA 카탈로그의 새로운 Cat #입니다. 우리가 가지고 있던 것은 원래 다른 Cat #을 가진 Fluka에서 온 것입니다.
결정화 스크린
크리스탈 스크린 I 및 II (크리스탈 스크린 HT)	Hampton Research	HR2-130
Index HT	Hampton Research	HR2-134
PEG/Ion 및 PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)	Hampton Research	HR2-139
PEGRX 1 및 PEGRx 2 (PEGRx HT)	Hampton Research	HR2-086
SaltRx 1 및 SaltRx 2 (SaltRx HT)	Hampton Research	HR2-136
Crystal mounts	Hampton Research	HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron	미국 에너지부의 APS(Advanced Photon Source) ' s Argonne National Laboratory	Beamline 19 ID	미국 에너지부의 APS(Advanced Photon Source) ' 아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory)는 거의 모든 과학 분야의 연구를 위해 매우 밝은 고에너지 저장 링 생성 X선 빔을 제공합니다.