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방법 논문

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

10.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56095

⸱

2017년 8월 25일

 ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, Shanghai, 2Cellular Biomedicine Group, Cupertino, 3Department of Respiratory Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

이 논문에서

요약

이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

초록

만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 지속적인 공기 흐름 제한 및 폐 parenchymal 파괴에 의해 특징입니다. 그것은 인구 고령 화에 매우 높은 발생률 있습니다. 의약품에 대 한 COPD 초점 주로 증상 수정; 현재 기존의 치료 따라서, 새로운 치료법의 개발이 절실히 필요 합니다. COPD의 자격 갖춘된 동물 모델 기본 메커니즘을 특성화 하는 데 도움이 수와 새로운 약물 검사에 사용할 수 있습니다. 현재 COPD 모델, lipopolysaccharide (LPS) 또는 돼지 췌 장 elastase (PPE)-유도 기종 모델, COPD 모양의 병 변 폐와 기도에서 생성 하지만 그렇지 않으면 인간의 COPD의 병 인을 유사 하지 않습니다. 담배 연기 (CS)-유도 모델 뿐만 아니라 호흡기 시스템에 COPD와 같은 장애를 시뮬레이션 하지만 그것은 또한 인 간에 있는 COPD를 일으키는 주요 유해 물질 중 하나에 기반 하기 때문에 가장 인기 있는 중 하나에 남아 있다. 그러나, CS 유발 모델의 시간과 노동 집약적인 측면 극적으로 새로운 약물 검사에 응용 프로그램을 제한합니다. 이 연구에서 우리는 성공적으로 오존의 높은 수준에 쥐를 노출 하 여 새로운 COPD 모델 생성. 이 모델은 다음 설명: 1) 강제로 내쉬는 숨의 볼륨 25, 50, 및 75/강제 중요 한 용량 감소 (FEV25/FVC, FEV50/FVC, 고 FEV75/FVC), 폐 기능;의 악화를 나타내는 2) 확대 폐 폐 포, 폐 parenchymal 파괴; 3) 감소 피로 시간과 거리; 그리고 4) 염증 증가. 함께 찍은, 이러한 데이터는 오존 노출 (OE) 모델은 오존 노출 과도 COPD의 etiological 요인 중 하나는 인 간에 게 유사한 이므로 신뢰할 수 있는 동물 모델을 보여 줍니다. 또한, 그것은 단지 6-8 주, 3-12 개월 OE 모델 COPD 연구를 위한 좋은 선택 일지도 모 르다 나타내는 담배 연기 모델을 유도 해야 하는 반면 OE 모델을 만드는 데 우리의 이전 작업에 기반 했다.

서론

폐기 종 등 만성 기관지염 COPD 20201,2세계에서 죽음의 세 번째 주요 원인 것으로 추정 되었다. 40 세 이상 인구에서 COPD의 잠재적인 발생률 남성에서 12.7%와 8.3%3다음 40 년 이내 여성에서 추정 된다. 아니 약물 COPD 환자4진보적인 악화를 현재 사용할 수 있습니다. COPD의 신뢰할 수 있는 동물 모델 뿐만 아니라 질병 병리학 과정의 모방을 요구 하지만 짧은 세대 기간 필요. LPS 또는 PPE 유도 모델을 포함 하 여 현재 COPD 모델 기종 같은 증상5,6을 유도할 수 있다. 폐를 생산 하는 단일 관리 또는 쥐 또는 쥐에 bronchoalveolar 게 액체 (BALF), 증가 프로-염증 성 중재자 (예를 들어, TNF-α 및 IL 1β) BALF 또는 혈 청에서 표시 된 neutrophilia LPS 또는 PPE의 1 주일 동안 도전 parenchymal 파괴 확대 공기 공간, 고도 공기5,6,7,,89,10. 그러나, LPS 또는 PPE 인간의 COPD의 원인이 되지 않습니다 및 따라서 병 적인 과정11를 모방 하지 않습니다. CS 유발 모델 지속적인 공기 흐름 제한, 폐 parenchymal 파괴, 생산과 기능적 운동 능력을 감소. 그러나, 전통적인 CS 프로토콜 COPD 모델12,13,,1415를 생성 하기 위해 3 개월 이상 필요 합니다. 따라서, 두 가지 요구 사항을 충족 하는 새로운, 더 효율적인 동물 모델을 생성 하는 것이 중요 하다.

최근, 담배 흡연, 뿐만 아니라 대기오염과 직업적 노출 되고있다 COPD16,,1718의 일반적인 원인. 오존, 주요 오염 물질의 한으로 (비록 아니라 대기오염의 주요 구성 요소), 수 직접 호흡기로 반작용 하 고 어린이 젊은 성인19,20,21의 폐 조직 손상 ,,2223,,2425. LPS, PPE, CS, 등 다른 자극으로 오존, 심각한 폐 산화 스트레스와 DNA 손상의 생 화 확 적인 통로의 참여 하 고 개시와 COPD26,27의 승진에 연결. 또 다른 요인은 일부 COPD 환자의 증상 오존, 오존이 폐 기능18,,2829을 방해할 수 있습니다 나타내는 노출 후 악화 이다. 따라서, 우리는 반복 해 서 7 주;에 대 한 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 COPD 모델 생성 이 공기 결함 및 이전 조사30,,3132의 그들과 유사 하 폐 parenchymal 손상 귀착되는. 우리이 연구에서 여성 쥐 OE 프로토콜을 확장 하 고 우리의 이전 연구30,,3132남자 쥐에서 관찰 하는 기종 성공적으로 재현. 때문에 남성에서 COPD 사망률은 감소 하지만 많은 국가33여성 증가, 여성에서 COPD 모델 메커니즘을 연구 하 고 필요한 여성 COPD 환자에 대 한 치료 방법을 개발 하. 모든 성별에 OE 모델의 적용 COPD 모델로 사용 하는 추가 지원을 빌려준다.

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프로토콜

참고: 모델에 OE를 생성 하 고 이전에 보고 된 연구 30 , , 31 32에서 사용. 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 상하이 교통 대학에 의해 승인 했다.

1. 쥐

아래
  1. 집 병원 체-무료, 7-를 9 주-오래 된 여성 BALB/c 마우스 동물에 개별 통풍이 장에 시설 제어 온도 (20 ℃)와 습도 (40-60%). 12 h 빛 및 시설에 12 h 어두운 주기를 제공 합니다. 음식을 제공 하 고 광고 libitum 물.

2. 오존 또는 공기 노출

  1. 씰링 (예: Perspex) 아크릴 상자에 전기 발전기로 생성 오존. 상자 안쪽에 연결 되는 공기 환기 파이프를 통해 작은 공기 송풍기를 사용 하 여 상자에서 공기를 불어. 오존 프로브를 사용 하 여 상자에서 오존의 농도 모니터링 합니다. 상자에서 오존의 농도 당 2.5 부분에 도달할 때까지 기다려 백만 (ppm).
    참고: 오존 프로브 켜거나 오존 생성기를 자동으로 전환할 수 있습니다 및 2.5 ppm에 상자에서 오존 수준을 유지할 수 있습니다.
  2. 오존의 수준에 도달 하면 2.5 ppm 상자에 마우스를 놓습니다. 계속 쥐 3 h 상자에서 각 시간 오존 노출.
    참고: 상자 3 h 동안 켜거나 오존 생성기를 자동으로 전환 하 여 2.5 p p m의 오존 레벨을 유지할 수 있고 상자 마우스에 의해 생산 되는 CO 2 부.
  3. 7 주 동안 주당 (한 번 매 3 일) 두 오존 노출 (3 h 지속 각 노출)를 주고, 동시에 및 동일한 기간 동안에 컨트롤 마우스를 노출.

3. 마이크로-단층

  1. 주 7의 끝에, anesthetize pelltobarbitalum natricum의 복 주사와 쥐 (1%, 0.6-0.8 ml/100 g) 마우스 하지 않습니다 보고 개별 상황에 따라 복용량을 조정 발가락을 꼬집어. 모니터 응답 및 꾸준한 호흡 주파수;에서 마우스를 계속 아무 자발적인 동의 절차 동안 존재 다는 것을 확인.
  2. 마이크로 계산 된 단층 촬영 (µCT)의 약 실에 있는 마 취 마우스를 놓습니다.
  3. 보정 표준 프로토콜 및 제조 업체를 사용 하 여 µCT ' s 지시. 50 x 선 튜브 설정 k v 및 450 µ A 전류.
    참고: 모두는 마우스 주위를 회전 하는 x-선 및 검출기.
  4. µCT 분석 한 조각, 300 ms의 노출 시간과 0.093 m m의 슬라이스 두께 0.092 mm의 효과적인 픽셀 크기 515 계획을 획득 하 여 수행.
  5. 인수 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 폐를 재구성 합니다. -750 및-550 Hounsfield 단위, 최소 및 최대는 회색조의를 각각 설정 하 여 회색 음영 이미지의 밝기를 조정.
    참고: 소프트웨어 자동으로 폐 실질과 낮은 감쇠 지역 (LAA) 34 , 35의 볼륨 계산 합니다.
  6. 총 폐 볼륨에 의해 라 볼륨을 나누어 라 (라 %)의 비율을 계산.

4. 디딜 방 아 테스트

  1. 주고는 실행 디딜 방 아 기계입니다. 참고에 10 분 동안 10 m/분의 속도에 적응 한 쥐 테스트: 전기는 항상 떨어져 절차 실시 되는 때.
  2. 관리는 피로 마우스를 테스트 합니다.
  3. 워밍업 5 분에 대 한 10 m/min의 속도로 마우스
    1. 10 분에 대 한 15 m/분 속도 증가
    2. 운동 강도 증가: 5 m/min, 20 m/분에서 시작 하 여 속도 증가 마우스까지 30 분 마다 36 실행을 계속할 수 없습니다.
  4. 거리가 고 실행 시간 피로 거리 및 피로 시간으로 각각 총 기록.

5. 폐 기능 측정

  1. Anesthetize pelltobarbitalum natricum의 복 주사와 쥐 (1%, 0.6-0.8 ml/100 g) 마우스는 볼을 개별 상황에 따라 복용량을 조정 발가락 핀치에 응답 하지 및 쥐 유지 자발적인 호흡. 모니터와 꾸준한 호흡 주파수;에서 마우스를 계속 될 때까지 기다립니다 아무 자발적인 동의 절차 동안 존재 다는 것을 확인.
  2. 신중 하 게 쥐를 tracheostomize 하 고 컴퓨터 제어 통풍 기에 연결 된 몸 plethysmograph에 그들을 배치.
    참고: 환기 proximally endotracheal 튜브에 있는 밸브를 통해 제어 됩니다. 설치 다른 자동 기동, 준 정적 압력 볼륨의 책략 및 빠른 흐름 볼륨의 책략을 포함 하 여 제공 합니다.
  3. 호흡 주파수 150 호흡/분 일반 호흡 패턴까지 압력 제어 환기를 통해 마 취 마우스의 평균 고 각 호흡 사이클에서 완전 한 만료 획득.
  4. 는 plethysmograph에서 생성 하는 부정적인 압력을 사용 하 여 장치와 유사 정적 압력-볼륨 책략을 수행.
  5. 는 FVC는 FEV를 기록 준 정적 압력-볼륨 루프 내 빠른 흐름 볼륨 책략을 수행 합니다. + 30 cm H 2로 폐를 팽창 O 및 즉시 이후에 만료 될 때까지 잔여 볼륨-30 cm H 2 o. 기록에 첫 번째 25, 50, 및 증발 기 (FEV 25의 75 ms에 FEV를 적용 하는 매우 부정적인 압력에 연결 FEV 50 및 FEV 75, 각각). 최적이 아닌 훈련을 거부 한다. 모든 단일 마우스를 각 테스트에 대 한 모든 숫자 매개 변수에 대 한 신뢰할 수 있는 의미를 세 허용 훈련의 최소 수행.

6. BALF 컬렉션

  1. pelltobarbitalum natricum와 터미널 마 취에 따라 ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) 마우스 발가락 핀치에 응답 하지 않는 및 숨을 잃게 참조 하는 개별 상황에 따라 복용량을 조정), 게는 1 m m 직경 endotracheal 튜브 및 다음 검색 BALF 10 통해 PBS의 2 mL와 쥐.
  2. 풀 검색 된 게 aliquots 및 4 ° C와 10 분 대 한 250 x g에서 원심
  3. 즉각적인 사용을 위해 상쾌한을 수집 하 고 저장-80 ° C 또는 액체 질소에서 나머지.
  4. 는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 총 수를 계산 하.
  5. PBS에 다음 스핀 (1400 x g, 6 분) 250 µ L 슬라이드 회전자 원심 분리기를 사용 하 여 슬라이드에 resuspended 셀의 셀 펠 릿 resuspend.
  6. 제조 업체에 따라 슬라이드에 세포 적용 라이트를 얼룩 ' s 프로토콜.
  7. 마우스 당 200 셀, 400 배 확대;에서 표준 형태에 따라 세포 또는 호 중구, 셀을 식별 하 고 그들의 숫자의 개수 계산.

7. 심장 혈액 샘플링

  1. 심장 찔린 통해 혈액 수집 1.5 mL 튜브에 그것을 로드 하 고 30 분에 대 한 얼음에 그것을 유지
  2. 2000 g x 4에서 5 분에 대 한 혈액 샘플을 원심 ° c.
  3. 새 튜브를 상쾌한 (혈 청)을 전송 하 고-80 ° C 또는 액체 질소에 저장.
  4. IL 1β에 대 한 혈 청을 준비 IL-10, 및 각각 ELISA 키트를 사용 하 여 TNF-α 탐지 테스트.

8. 폐 형태학 분석

  1. 부 폐와 쥐에서 tracheas.
    1. 희생 후 즉시 외과 보드에 각 안락사 마우스 위치.
    2. 멀리는 platysma 해 부 및 시각화 하 고 액세스 tracheal 반지 앞쪽 tracheal 근육.
    3. 열기는 흉부를 캐비티입니다. 폐와 기관지, 해 부 하지만 폐에서 마음을 분리 하지 마십시오.
  2. PE90 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 4 %paraformaldehyde 포함 된 주사기에 연결할 endotracheal 테.
    주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 장갑, 안전 안경 착용 하 고 연기 후드 내부 솔루션을 사용 하 여.
  3. Endotracheal 카 테 터를 통해 4 %paraformaldehyde (10 방울, ~ 200 µ L)를 사용 하 여 완전히 폐를 부 풀 려. 인플레이션의 완료 후에 심장 제거.
  4. 유지 적어도 4 헤에 대 한 4 %paraformaldehyde 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 폐
  5. 는 파라핀에 폐를 포함합니다. 파라핀 블록 회전 톰으로 단면 5 µ m 섹션을 얻을. 단면, 하는 동안 폐 조직 기관지 트리 영역 내에서 최대 표면적 노출.
  6. 형태학 분석 수행 되며 고 오신 (H & E) 섹션에 얼룩.
  7. 밝은 분야 직 립 현미경 (대물 렌즈, 20 X, 노출 시간, 1.667 ms) 섹션 이미지.
  8. 두 수 사관 치료 프로토콜을 눈 멀게 하는 조직학 단면도 독립적으로 계산 했습니다. 간 치경 septal 벽의 거리를 측정 하기 위한 매개 변수로 평균 선형 절편 (L m)를 사용 합니다. 다음 단계를 사용 하 여 L m 결정:
    1. 포토샵에서 섹션의 이미지를 열고 5 550 µ m 긴 라인 이미지에 reticule 그리드를 그립니다.
    2. 폐 포의 수를 계산 하는 격자 라인에 걸쳐.
    3. 는 그리드 라인의 길이 폐 포의 수로 나누어 L m을 계산 합니다. 정량화, 마우스 당 5 섹션 이미지. 각 섹션 (하나의 이미지 필드 당)의 10 개의 이미지를 수집 하 고 무작위로 평가. 필드 선택, 동안 앞 또는 다른 방향에서 한 필드를 이동 하 여 항공 및 선박 분야 방지.
      참고: 데이터 평균 ± S.E.M.로 표시 됩니다. 유엔 쌍체 t 검정은 공기에 노출 된 쥐와 쥐 오존 노출 사이 비교를 위해 실시 됐다. 각 그룹의 3 개의 동물 상당한 차이 계산 하기 위해 사용 되었다. P-값이 < 0.05 중요 하 게 고려 되었다.

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결과

각 그룹의 3 차원 µCT 이미지의 예는 그림 1는에 표시 됩니다. 오존 노출 쥐 상당히 큰 총 폐 볼륨 했다 (그림 1는 b)와 라 %그림 1(c) 보다 공기 노출 제어 마우스. 오존 노출31,32의 6 주 후 폐 볼륨 및 LAA % 상승 된 남아. 증가 폐 볼륨 및 LAA % 기종 표현 형을 나타냅니다. 그림 2는 에 폐 치경 확대의 예 기종 형성을 보여 줍니다. 평균 선형 절편 (Lm) 증가 오존에 노출 된 생쥐 (

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토론

이 연구에서 우리는 새로운 COPD 모델을 생성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법 제시. (즉, LPS 또는 PPE 모델) 다른 모델에 비해,이 OE 모델이 COPD 환자 들의 병 적인 과정. 담배 연기 때문에 인간의 환자40에서 COPD를 일으키는 주요 유해 물질, CS 모델 가장 인기 있는 COPD 모델41,42남아 있습니다. 그러나 CS 모델 3-12 개월 연구를 필요로 하는, & D 기간 새로운 약물에 대 한. CS 모델에 비해, 현재 OE 모델 6-8 주를 생성 기간을 감소 시킨다. 우리는 우리의 이전 연구30,,3132에 오존 노출의 6 주 후 남성 생쥐에서 기종 관찰. 이 연구에서 우...

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공개 사항

Z.W.S.와 트 면은 현재 직원 및 셀룰러 의학 그룹의 스톡 옵션 보유자 (나스닥: CBMG). 다른 작가 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

감사의 글

저자가이 프로토콜에서 µCT 평가와 기술 지원 씨 Boyin 진 (상하이 보건 임상 센터)에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BALB/c 마우스Slac Laboratory Animal, Shanghai, ChinaN/A7-9주 된 암컷 BALB/c 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.
개별 환기 케이지Suhang, Shanghai, China모델 번호: MU64S7케이지는 동물 시설에서 쥐를 수용하는 데 사용되었습니다.
씰링 방풍 상자Suhang, Shanghai, ChinaN/A상자는 오존 발생기를 담는 데 사용되었습니다. 생쥐는 상자 안의 오존에 노출되었습니다.
전기 발전기Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany모델 500 이 장치는 오존을 생성하는 데 사용되었습니다.
오존 프로브ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK오존 300이 장치는 오존 생성을 모니터링하고 제어하는 데 사용되었습니다.
Pelltobarbitalum natricumSigma, St. Louis, MO, USAP3761마우스는 pelltobarbitalum natricum의 복강 내 주사로 마취되었습니다.
Micro-Computed TomographyGE Healthcare, London, ON, CanadaRS0800639-0075이 장치는 폐의 이미지를 획득하는 데 사용되었습니다.
Micro-view 2.01 ABA 소프트웨어GE Healthcare, London, ON, CanadaMicro-view 2.01 이 장치는 폐를 재건하고 폐의 부피, LAA를 분석하는 데 사용되었습니다.
러닝머신 기계 Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, ChinaDSPT-208이 기계는 피로 시험을 위해 usd였습니다.
신체 혈량계eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK ForcedManoeuvres System이 장치는 폐활량 측정 폐 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다.
인공호흡기eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK ForcedManoeuvres System이 장치는 폐활량 측정 폐 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다.
슬라이드 스피너 원심분리기Denville Scientific, Holliston, MA, USAC1183 BALF 세포를 슬라이드에 회전시키는 데 사용되었습니다.
Wright StainingHanhong, 상하이, 중국RE04000054  그것은 현탁 된 BALF에서 대식 세포, 호중구를 염색하는 데 사용되었습니다.
HemocytometerHausser Scientific, Horsham, PA, USA4000세포를 계수하는 데 사용되었습니다.
IL-1&베타;Abcam, Cambridge, MA, USAab100704그들은 혈청의 각 인자를 테스트하는 데 사용되었습니다.
IL-10Abcam, Cambridge, MA, USAab46103그들은 혈청의 각 인자를 테스트하는 데 사용되었습니다.
TNF-&알파;Abcam, Cambridge, MA, USAab100747그들은 혈청의 각 인자를 테스트하는 데 사용되었습니다.
파라포름알데히드 Sigma, St. Louis, MO, USAP6148폐는 4% 파라포름알데히드로 팽창되었습니다.
ParaffinHualing, Shanghai, China56#폐를 삽입하는 데 사용되었습니다.
로터리 마이크로톰Leica, Wetzlar,  독일 헤센RM2255폐를 절단하는 데 사용되었습니다.
Hgaematoxylin 및 Eosin(H& E) 염색 용액Solarbio, 베이징, 중국G1120H & 형태 분석을 위해 E 염색을 수행했습니다.
정립 명시야 현미경Olympus, Center Valley, PA, USA, CX41H&를 이미지화하는 데 사용되었습니다. E 염색 슬라이드.
Adobe Photoshop 12Adobe, San Jose, CA, USAAdobe Photoshop 12H&의 폐포 수를 계산하는 데 사용되었습니다. E 스테인드 이미지.
GraphPad prism 5Graphpad Software Inc., San Diego, CAGraphPad prism 5데이터 분석 및 그림 제작에 사용되었습니다.

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